一种评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的方法

1.本发明涉及食品技术领域，具体涉及一种基于乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的方法。


背景技术：

2.白菜型油菜蜂花粉是一种在我国产量较大、应用范围较广的蜂花粉品种，富含多种营养、活性成分，具有极高的食用和药用价值，目前已应用于食品、保健品、药品，以及畜牧养殖行业。
3.然而数据显示，白菜型油菜蜂花粉中含有潜在致敏原，会导致部分易感人群在食用后产生临床过敏症状。这为相关蜂花粉产品的开发利用带来了挑战，严重制约了产业发展。因此，开发便捷、高效、准确的蜂花粉致敏性评价方法对蜂花粉的食用安全防控及其产业发展至关重要。
4.现有技术已开发了对蜂花粉过敏原的鉴定方法，并从油菜蜂花粉中鉴定得到5种致敏蛋白，包括前纤维蛋白（profilin）、扩张蛋白（expansin）、醇溶谷蛋白（prolamin）、油质蛋白（oleosin b2）和谷氧还蛋白（glutaredoxin），为蜂花粉的致敏性研究奠定了基础。
5.此外，现有技术还开发了对不同类型蜂花粉致敏性的评价方法，例如，以油质蛋白（oleosin b2）和谷氧还蛋白（glutaredoxin）作为指标评价天然油菜蜂花粉和酶解油菜蜂花粉的致敏性；以胱抑素（cystatin）和前纤维蛋白（profilin）作为指标评价天然油菜蜂花粉和破壁油菜蜂花粉的致敏性。
6.然而，与其它类型油菜蜂花粉不同，白菜型油菜蜂花粉的植物来源单一且明确，是由蜜蜂采自于brassica campestris植物花粉而制成的。由于其具有专属性的特点，现有其它类型的油菜蜂花粉的致敏性评价方法用于评估白菜型油菜蜂花粉的致敏性时，受到的干扰性大，准确度不高，制约了相关产品的标准化生产和品质控制。
7.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明针对现有技术中缺乏针对白菜型油菜蜂花粉致敏性评价方法的问题，提出一种有效的评价方法。
9.本发明第一方面提供以乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段作为蜂花粉致敏性评价指标的新应用；所述蜂花粉为白菜型油菜蜂花粉。
10.乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）是一种含锌金属酶，目前已知的主要功能是作用于生物体内的短链醇代谢，在诸多生理过程中起着重要作用。然而本发明研究人员在对白菜型油菜蜂花粉的研究中，首次鉴定出其中含有致敏原乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段，并基于此提出以乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段作为评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的指标，可显著提高其致敏性评价的准确性。而现有技术中从未公开乙醇脱氢酶特征肽段具有致敏性，且可用于作为致敏性评价的指标的技术
内容，因此，本技术对于乙醇脱氢酶的新应用是非显而易见的。
11.本发明第二方面提供上述蜂花粉致敏性的评价方法。通过该方法可以快速、准确的评价此类蜂花粉是否具有致敏性，为此类蜂花粉的标准化生产和品质控制提供评估依据。
12.本发明提供的上述蜂花粉致敏性的评价方法，包括：以乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段为评价指标，利用蛋白组学技术检测蜂花粉蛋白提取物中乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的特征肽段，根据质谱检测及分析结果评价样品的致敏性；所述蜂花粉为白菜型油菜蜂花粉。
13.进一步地，本发明所述的评价方法中，在所述蛋白组学技术检测实施前，对蜂花粉蛋白提取物进行酶切处理；所述酶切处理使用的酶为质谱级胰蛋白酶；所述蛋白提取物中蛋白质量与胰蛋白酶的质量比为（30-100）：1；优选50:1。研究表明，通过控制胰酶用量，起到充分酶切蜂花粉蛋白提取物的作用，同时又避免过度酶切而影响鉴定结果的准确性。所述酶切处理的条件为：37℃下孵育12-14 h。
14.进一步地，所述蛋白组学检测条件为：所述检测采用纳升级液相色谱仪串联组合型质谱仪进行；easy-nlc 1000纳升级液相色谱仪串联ltq-orbitrap elite组合型质谱仪（thermo fisher scientific，usa）；富集柱（100 μm
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2 cm，5 μm）和分析柱（75 μm
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15 cm，3 μm，100
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）均为thermo fisher scientific公司生产的反相 c18柱；色谱条件设置如下：流动相流速为350 nl/min，流动相a为 0.1%甲酸水溶液，流动相b为0.1%甲酸乙腈溶液；流动相洗脱梯度设置如下：质谱条件设置如下：一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（esi），喷雾电压为2.3 kv，离子传输管温度为275℃，s-lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为 300-8000 m/z。
15.二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2 m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（hcd），能
量为30 %。
16.通过上述质谱检测条件的优化，起到提高质谱检测灵敏度和准确度的作用。
17.本发明所述的评价方法中，所述质谱检测及分析还包括：根据蛋白质组学检测获得的质谱数据，利用uniprot蛋白质数据库检索获得蛋白质氨基酸序列；根据蛋白质氨基酸序列，利用allergenonline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的特征肽段；通过dnastar软件根据乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的一级序列进行抗原表位分析。
18.进一步地，为了提高上述蜂花粉致敏性评价方法的准确性，本发明所述的评价方法还包括：利用斑点免疫印迹技术进行相互验证；所述斑点免疫印迹技术包括：蛋白提取、蛋白上样、孵育抗体、膜显色反应。
19.所述斑点免疫印迹技术具体步骤如下：（1）利用植物蛋白提取试剂盒对不同处理组的蜂花粉粉末进行蛋白提取，然后利用二喹啉甲酸（bca）蛋白定量试剂盒测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；（2）准备一张5 cm
×
5 cm的硝化纤维膜，将4组样品点在膜上，保证各组样品蛋白上样量相同，为20~100 μg，然后将膜晾干；（3）将膜放入含有5% bsa的10cm培养皿中浸泡，室温孵育1 h，然后将膜取出放入按体积比1：1000~2000比例稀释的含有人血清ige抗体的bsa溶液中室温孵育1 h；（4）将膜取出后用tbs-t溶液清洗3次，每次5min，然后将膜放入按体积比1：1000~2000比例稀释的含有hrp标记抗人ige小鼠单克隆抗体的bsa溶液中室温孵育1 h；（5）将膜取出后用tbs-t溶液清洗3次，每次5min，然后利用dab显色试剂盒按照操作说明进行膜显色反应，直至膜上有棕色点显现后终止反应，并将膜晾干后扫描留存。
20.本发明的有益效果如下：本发明从白菜型油菜蜂花粉中鉴定出一种新的致敏原，即乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase），并基于此首次提出以乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）特征肽段作为评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的指标，并提供具体评价步骤。
21.本发明提出的评价方法能够快速准确地对白菜型油菜蜂花粉中致敏原进行鉴定，为相关蜂花粉产品的标准化生产和品质控制提供评估依据。
附图说明
22.图1为乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的质谱检测结果，（a）图是其特征肽段fgvtefvnpk的质谱图，（b）图是其特征肽段gtffgnykpk的质谱图。
23.图中乙醇脱氢酶的氨基酸序列如下：
图2为乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的抗原表位分析结果。
24.图3为白菜型油菜蜂花粉冻干粉（样品1）和酶解后的白菜型油菜蜂花粉冻干粉（样品2）中乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的含量差异。
25.图4为白菜型油菜蜂花粉冻干粉（样品1）和酶解后的白菜型油菜蜂花粉冻干粉（样品2）的相同浓度蛋白提取物的斑点免疫印迹图。
具体实施方式
26.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
27.以下实施例中涉及的试剂、耗材均可通过市售购买得到。
28.试验样品的制备本发明所述评价方法所适用的样品为白菜型油菜蜂花粉冻干粉，该样品可通过市售购买得到。
29.实施例1本实施例提供了一种评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的方法，具体步骤如下：1）蛋白抽提，得到沉淀蛋白：分别准确称取100.0mg样品1~3，加入1ml蛋白抽提剂；超声破碎，条件为超声3s，间隔3s，重复30次，超声结束后继续室温振荡30-60min；然后于4℃，13000g条件下离心15min，吸取400μl上清液，并向其中加入2ml丙酮冰上放置60min以沉淀蛋白，去上清，得到沉淀蛋白；其中，蛋白抽提剂由ph7.4的25mmol/l三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、150mmol/l氯化钠、1mmol/l乙二胺四乙酸、1%乙基苯基聚乙二醇和5%甘油组成。
30.2）蛋白酶切，得到肽段：2.1）沉淀蛋白的复溶，得到复溶蛋白溶液：沉淀蛋白用100μl 5mol/l尿素溶液复溶，得到复溶蛋白溶液；然后利用brandford法测定复溶蛋白溶液的蛋白浓度；再根据蛋白浓度计算蛋白质量；2.2）乙酰化反应：向复溶蛋白溶液中加入400μl 40mmol/l碳酸氢铵溶液，然后加入50μl 100mmol/l二硫苏糖醇溶液，室温反应1h，再加入250μl 100mmol/l碘乙酰胺溶液，室温避光1h，进行乙酰化反应。
31.2.3）酶解，孵育：
向乙酰化后的蛋白溶液中加入蛋白质量的1/50的质谱级胰酶（trypsin），37℃下孵育12h，加入1
µ
l甲酸终止反应。
32.3）肽段除盐：肽段除盐采用的是millipore公司的除盐洗脱柱ziptips，操作如下：首先用ziptip活化液和平衡液分别冲洗ziptipc18柱10次，然后用ziptip反复抽吸孵育后的蛋白溶液10次，使其肽段充分结合在ziptip柱上，再利用ziptip洗脱液冲洗柱上吸附的肽段，重复10次。
33.将带有肽段的洗脱液进行真空干燥，然后用0.1%甲酸溶液溶解，于4℃，13000g条件下离心10min取上清。
34.用nanodrop2000测定肽段浓度；根据肽段浓度，确定质谱上样体积。
35.4）质谱检测鉴定：利用easy-nlc1000纳升级液相色谱仪串联ltq-orbitrapelite组合型质谱仪（thermofisherscientific，usa）；其中：富集柱（100μm
×
2cm，5μm）和分析柱（75μm
×
15cm，3μm，100
å
）均为thermofisherscientific公司生产的反相c18柱。
36.色谱条件设置如下：流动相流速为350nl/min，流动相a为0.1%甲酸水溶液，流动相b为0.1%甲酸乙腈溶液。
37.流动相洗脱梯度设置见表1。
38.表1 流动相洗脱梯度质谱条件设置如下：一级全扫描：离子源为电喷雾离子源（esi），喷雾电压为2.3kv，离子传输管温度为275℃，s-lens射频为55%，分辨率为60000，扫描范围为300-8000m/z。
39.二级扫描是在一级扫描基础上进行的，选取前20个离子信号强度最强的母离子。二级扫描参数：分辨率为15000，隔离窗口为2m/z，碎裂模式为高能碰撞离子解离（hcd），能量为30%。
40.5）检测数据分析
经质谱采集的原始数据导入peaksdb7.5分析软件进行定性分析。定性分析的参数设置如下：从uniprot下载白菜型油菜（brassicacampestris）蛋白质数据库进行质谱数据检索。设置母离子质量误差为15ppm，子离子质量误差为0.05da，trypsin酶切最大漏切位点数为2，可变修饰为oxidation（m, 15.99），固定修饰为carbamidomethyl（c, 57.02）。所有检索结果采用正反库融合的算法控制蛋白和肽段的假阳性率（fdr）小于1%。
41.经uniprot蛋白质数据库检索获得的蛋白质氨基酸序列，采用allergenonline致敏蛋白数据库进行蛋白质序列同源性比对，获得乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）特征肽段（见表2和图1），由此验证了样品中含有乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）这种致敏蛋白。
42.表2白菜型油菜蜂花粉中乙醇脱氢酶特征肽段鉴定信息进一步地，通过dnastar软件，根据乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）的一级序列进行抗原表位分析。检测结果显示：经抗原表位分析为阳性，验证了乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）特征肽段潜在的致敏能力（见图2）。
43.实施例2:为了验证上述评价方法的准确性，本发明对白菜型油菜蜂花粉冻干粉和酶解后的白菜型油菜蜂花粉冻干粉进行乙醇脱氢酶（alcoholdehydrogenase）含量质谱检测，以及斑点免疫印迹检测。具体试验步骤如下：1.样品制备1.1样品1为市售白菜型油菜蜂花粉冻干粉，准备3个平行样品；利用gb5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定该冻干粉的含水量，在7%以下达标。
44.1.2样品2为酶解后的白菜型油菜蜂花粉冻干粉，准备3个平行样品；具体酶解步骤如下：1）准确称取5.0g研磨好的市售白菜型油菜蜂花粉冻干粉末（100~300目），并加入10ml蒸馏水，涡旋混匀后密封包装于食品级自封袋内，然后进行巴氏杀菌，条件为63℃，30min，获得蜂花粉溶液。
45.2）杀菌完成后在无菌超净工作台内转移蜂花粉溶液至无菌离心管中，然后分别按300u/g蜂花粉加入纤维素酶、果胶酶和木瓜蛋白酶，充分混合后用质量浓度为2%的维生素c溶液调整ph值至4.0，然后于无菌恒温培养箱内45℃下孵育24h，获得酶解蜂花粉溶液。
46.3）利用真空冷冻干燥机对酶解蜂花粉溶液进行真空冷冻干燥，所需干燥时长约为48h，获得酶解后的白菜型油菜蜂花粉冻干粉。
47.4）利用gb5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》测定，该冻干粉
的含水量在7%以下，符合要求。
48.2．样品1和2中乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）含量的质谱检测具体步骤与实施例1相同。
49.3．样品1和2的蛋白提取物的斑点免疫印迹检测1）利用植物蛋白提取试剂盒，按照操作说明对同质量的样品1和2进行蛋白提取；2）然后利用二喹啉甲酸（bca）蛋白定量试剂盒，按照操作说明测定各组样品蛋白提取液的蛋白浓度；3）准备一张5 cm
×
5 cm的硝化纤维膜，将2组样品点在膜上，各组样品的蛋白上样量均为50 μg，然后将膜晾干；4）将膜放入含有5% bsa的10cm培养皿中浸泡，室温孵育1 h，然后将膜取出放入按1：1000比例稀释的含有人血清ige抗体的bsa溶液中室温孵育1 h；5）将膜取出后用tbs-t溶液清洗3次，每次5 min，然后将膜放入按1：1500比例稀释的含有hrp标记抗人ige小鼠单克隆抗体的bsa溶液中室温孵育1 h；6）将膜取出后用tbs-t溶液清洗3次，每次5 min，然后利用dab显色试剂盒，按照操作说明进行膜显色反应，直至膜上有棕色点显现后终止反应，并将膜晾干后扫描留存。
50.3. 试验结果3.1 质谱检测结果显示：相比较样品1，样品2中乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）的含量显著下降（见图3），说明了样品2的致敏性较低，安全性相对较高，不会引起临床过敏症状或引起临床过敏症状的几率较低。
51.3.2 斑点免疫印迹检测结果显示：相比较样品1，样品2的蛋白提取物与免疫球蛋白e（ige）的特异性结合水平显著下降（见图4），同样，说明了样品2的致敏性较低，安全性相对较高，不会引起临床过敏症状或引起临床过敏症状的几率较低。
52.结合3.1和3.2的结果分析，进一步验证了以乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase）为指标评价白菜型油菜蜂花粉致敏性的准确性。
53.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。