一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法与流程

1.本发明属于医学检测技术领域，具体涉及一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法。


背景技术：

2.尿液是一种非侵入性的生物液体，是监测肾脏损害的理想分析物，常被用于医学诊断和临床研究。临床尿液检测可以帮助医生了解病患的泌尿生理功能和病理功能的变化，也可以间接反映全身系统的功能情况。
3.蛋白尿指的是尿液中含有非正常高浓度蛋白质的病症，正常情况下，大多数蛋白质不会进入尿液，但是在肾脏功能受损的情况下，一些蛋白质会进入尿液，形成蛋白尿。尿液中尿蛋白的测定是肾脏疾病诊断的基础，尿蛋白的检测分为定性检测和定量检测，目前应用较广的定性检测方法有磺基水杨酸法、加热乙酸法、干化学试带法，此类方法可快速检测出尿液中尿蛋白的存在，但是这些测试通常缺乏准确性、敏感性，定量检测方法主要有染料结合法、芯片电泳、毛细管电泳、高效液相色谱、酶促免疫测定、比浊抑制免疫测定，但这些方法大多需要较长的测样时间。染料结合法中的双缩脲法是利用蛋白质中的肽键与硫酸铜溶液发生反应，生成紫色的大分子络合物，其颜色深浅与尿液中的蛋白质含量成正比，可以根据产物吸光度的变化来定量检测出蛋白质的含量。双缩脲法具有操作简单、重复性好等优点，可以快速地测定蛋白质含量，但也存在一定的缺陷，如检测灵敏度较差，在测量低蛋白含量的样品时有一定的困难，且随着医疗条件的改进，对尿蛋白的定量检测提出了更高的要求。因此，对现有的双缩脲法进行改进，提供一种能快速简单且经济实用的尿蛋白检测方法已经刻不容缓了。


技术实现要素：

4.针对上述问题，本发明提供了一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法，该尿蛋白快速检测试剂具有特异性高、灵敏性好、响应速率快、稳定性好的特点，检出范围宽，可快速检测微量尿蛋白，操作简便，可实现尿蛋白的定量检测。
5.解决上述问题的技术方案如下。
6.第一方面，本发明提供了一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法，所述方法包括：将表面活性剂、薄荷醇按照质量比1:0.1~0.3混合后，加入去离子水溶解得到混合溶液，然后与双缩脲试剂按照质量比1:0.2~0.4混合，30~40℃下搅拌0.5~2h后，即得尿蛋白快速检测试剂。
7.作为优选实施方案，表面活性剂为月桂酰羟乙基磺酸钠或木质素磺酸钠。
8.作为优选实施方案，双缩脲试剂经由下述方法制备得到：1)氢氧化钾溶于水中配置成0.05~0.25g/ml的溶液，作为试剂a；2)依次将苯甲酸单乙醇胺、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯溶于水中，30~40℃下搅拌10~40min后，加入水合硫酸铜，继续搅拌0.5~2h，得到试剂b；3)将试剂a、试剂b按照体积比5~8:1混合均匀，即得双缩脲试剂。
9.作为进一步地优选，试剂b中，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.2~0.45%，二环己基酒石酸酯的质量分数为0.03~0.05%，苯甲酸单乙醇胺的质量分数为0.08~0.14%，水合硫酸铜的质量分数为0.1~0.3%。
10.作为进一步地优选，试剂b中，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.1~0.2。
11.上述基于双缩脲试剂的尿蛋白快速检测试剂，其为浅蓝色，与待测尿液样品混合后，蛋白质中的肽键与铜离子配价结合形成紫色的大分子络合物，通过标准曲线可实现尿蛋白定量检测的目的，检出限达15mg/l，具有灵敏度高、操作简单、重复性好的优点，可快速测定蛋白质含量；相比传统的双缩脲试剂，本发明提供的试剂中添加有一定质量比的二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯，两者具有一定的协同作用，可在一定程度上增加待测样品中不溶性蛋白的溶解，减少了因不溶性蛋白造成的测量误差，从而提高检测灵敏度和准确性，此外，还具有提高尿蛋白快速检测试剂的稳定性的作用，长时间放置后检测活性不变，保质期长。
12.第二方面，第一方面所述的尿蛋白快速检测试剂在尿蛋白检测中的应用。
13.第三方面，一种尿蛋白的检测方法，所述方法包括：步骤一、以水为空白样品，将牛血清白蛋白溶于水中配置成1g/ml的水溶液，然后稀释得到蛋白浓度处于15~6000mg/l范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；步骤二、分别将尿蛋白快速检测试剂与空白样品、标准蛋白样品混合，加入到生化自动仪中，30~40℃下搅拌0.5~2h后，以空白样品作为参比，在主波长540nm处测定标准蛋白样品的吸光度，以标准蛋白样品的浓度和吸光度拟合标准曲线；步骤三、待测尿液样品进行预处理后，向样品中加入尿蛋白快速检测试剂，30~40℃下搅拌0.5~2h后，测定吸光度并代入标准曲线中计算得到蛋白质含量。
14.作为优选实施方案，所述步骤二、三中，样品与尿蛋白快速检测试剂的体积比为1:1~20。
15.作为优选实施方案，所述步骤三中待测尿液样品为新鲜尿液、2~8℃保存24h的尿液或室温保存24h的尿液。
16.作为进一步地优选，室温保存24h的尿液中添加有一定量的麝香草酚作为防腐剂，可抑制尿液常温放置过程中的细菌增生，降低蛋白质的分解对测量结果的影响，提高测量准确性。
17.作为优选实施方案，所述步骤三中，待测尿液样品的预处理步骤包括：向待测尿液样品中加入尿素酶水溶液静置孵育，去除待测尿液样品中的尿素；然后加入吸附剂，振荡20~50min后，过滤去除尿液中的硫和磷。
18.作为进一步地优选，所述预处理过程中，孵育温度为30~40℃，时间为10~30min。
19.作为进一步地优选，所述预处理过程中，吸附剂为活性钠基膨润土。
20.作为进一步地优选，活性钠基膨润土经由下述方法制备得到：将钠基膨润土粉碎至200~300目，用质量分数为10~20%的氯化钠溶液进行清洗，然后将膨润土分散于二氯甲烷中，加入2-乙氧基苄基异氰酸酯，75~90℃下超声搅拌20~50min后过滤、水洗、干燥即得。本发明利用上述步骤，首先利用尿素酶对待测尿液样品处理分解尿素，再用活性钠基膨润土除去磷和硫，钠基膨润土经2-乙氧基苄基异氰酸酯处理后，可提
高膨润土的吸附性，提高尿素和磷硫的脱除效率，从而减少尿素等的存在造成的样品ph稳定性差等问题，进一步提高检测准确性。
21.本发明提供了一种利用尿蛋白快速检测试剂检测尿蛋白的方法，首先将待测尿液样品经预处理去除尿素、磷硫等，减少对尿蛋白含量测定的影响，提高准确性，然后利用本发明提供的尿蛋白快速检测试剂对待测尿液样品进行定量检测，方法简单，准确性高。
22.第四方面，本发明还提供了二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯在提高尿蛋白快速检测试剂的灵敏度和稳定性中的应用。
23.本发明的有益效果为：本发明提供了一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法，制得的尿蛋白快速检测试剂具有灵敏度高、操作简单、重复性好的优点，可以快速地测定蛋白质的含量，在临床尿液检测中具有较大的应用前景；尿蛋白快速检测试剂中添加了一定质量比的二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯，两者具有一定的协同作用，可增加待测样品中不溶性蛋白的溶解性，减少了因不溶性蛋白造成的测量误差，提高了检测灵敏度和准确性，并且提高了尿蛋白快速检测试剂的稳定性；待测尿液样品检测前，利用尿素酶处理分解尿素，再用活性钠基膨润土除去磷和硫，相比未处理的钠基膨润土，利用本发明提供的活性钠基膨润土可提高尿素和磷硫脱除效率，减少尿素等的存在造成的待测尿液样品ph稳定性差的问题，进一步提高了检测准确性。
附图说明
24.图1是标准蛋白样品的标准曲线；图2是实施例1中尿蛋白快速检测试剂与传统双缩脲试剂的吸收光谱；图中a代表尿蛋白快速检测试剂，b代表传统双缩脲试剂；图3是尿蛋白快速检测试剂的稳定性测试结果示意图；图中b代表保存5d后测得尿蛋白的变化率，c代表保存10d后测得尿蛋白的变化率，d代表保存20d后测得尿蛋白的变化率。
具体实施方式
25.为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
26.根据本发明，首先提供了一种尿蛋白快速检测试剂的制备方法，包括：氢氧化钾溶于水中配置成0.05~0.25g/ml的溶液，作为试剂a；依次将苯甲酸单乙醇胺、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯溶于水中，30~40℃下搅拌10~40min后，加入水合硫酸铜，继续搅拌0.5~2h，得到试剂b，试剂b中，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.2~0.45%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.03~0.05%，苯甲酸单乙醇胺的质量分数为0.08~0.14%，水合硫酸铜的质量分数为0.1~0.3%；将试剂a、试剂b按照体积比5~8:1混合均匀，即得双缩脲试剂；其中，所述二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.1~0.2；将表面活性剂、薄荷醇按照质量比1:0.1~0.3混合后，加入去离子水溶解得到混合溶液，与双缩脲试剂按照质量比1:0.2~0.4混合，30~40℃下搅拌0.5~2h后，即得尿蛋白
快速检测试剂。
27.上述基于双缩脲试剂的尿蛋白快速检测试剂，检出范围为15~6000mg/l，具有灵敏度高、操作简单、重复性好的优点，可以快速地测定蛋白质含量；相比传统的双缩脲试剂，本发明提供的试剂中添加有一定质量比的二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯，两者具有一定的协同作用，可增加待测样品中不溶性蛋白的溶解性，减少了因不溶性蛋白造成的测量误差，提高了检测灵敏度和准确性，此外，还具有提高尿蛋白快速检测试剂稳定性的效果，长时间放置后仍具有较高的准确性，保质期长。
28.根据本发明，还提供了一种尿蛋白的检测方法，所述方法包括：步骤一、以水为空白样品，将牛血清白蛋白溶于水中配置成1g/ml的水溶液，然后进行稀释得到蛋白浓度处于15~6000mg/l范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；步骤二、分别将尿蛋白快速检测试剂与空白样品、标准蛋白样品按照体积比为5~20:1混合，加入到生化自动仪中，30~40℃下搅拌0.5~2h后，以空白样品作为参比，在主波长540nm处测定标准蛋白样品的吸光度，以标准蛋白样品的浓度和吸光度拟合标准曲线；步骤三、待测尿液样品进行预处理，具体步骤为：向待测尿液样品中加入100u/mg的尿素酶水溶液，静置，30~40℃下孵育10~30min，去除尿液样本中的尿素；将钠基膨润土粉碎至200~300目，用质量分数为10~20%的氯化钠溶液进行清洗，然后将钠基膨润土分散于二氯甲烷中，加入钠基膨润土质量0.2~0.35倍的2-乙氧基苄基异氰酸酯，75~90℃下超声搅拌20~50min后过滤、水洗、干燥，得到活性钠基膨润土；将活性钠基膨润土加入到待测尿液样品中，振荡20~50min后，过滤去除尿液中的硫和磷；步骤四、按照体积比1:1~20，向预处理后的待测尿液样品中加入尿蛋白快速检测试剂，30~40℃下搅拌0.5~2h后，测定吸光度并代入标准曲线中计算得到蛋白质含量。
29.经过上述步骤，利用尿素酶处理分解尿素、再用活性钠基膨润土除去磷和硫，然后利用尿蛋白快速检测试剂对其进行检测，预处理过程中利用本发明提供的活性钠基膨润土可提高尿素和磷硫脱除效率，减少尿素等的存在造成的待测尿液样品ph稳定性差的问题，进一步提高了检测准确性。
30.下面结合实施例对本发明进行详细地解释说明。
31.实施例1：本实施提供了一种尿蛋白的检测方法，包括以下步骤：1)氢氧化钾溶于水中配置成0.1g/ml的溶液，作为试剂a；依次将苯甲酸单乙醇胺、二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯溶于水中，37℃下搅拌25min后，加入水合硫酸铜，继续搅拌1h，得到试剂b，试剂b中，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.3%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.045%，苯甲酸单乙醇胺的质量分数为0.1%，水合硫酸铜的质量分数为0.2%；将试剂a、试剂b按照体积比6:1混合均匀，即得双缩脲试剂；将月桂酰羟乙基磺酸钠、薄荷醇按照质量比1:0.2混合后，加入10质量倍的去离子水溶解得到混合溶液，然后与双缩脲试剂按照质量比1:0.3混合，35℃下搅拌1h后，即得尿蛋白快速检测试剂；2)以水为空白样品，将牛血清白蛋白溶于水中配置成1g/ml的水溶液，然后进行稀释得到蛋白浓度处于15~6000mg/l范围内的一系列溶液，作为标准蛋白样品；3)分别将尿蛋白快速检测试剂与空白样品、标准蛋白样品按照体积比为5:1混合，加入到生化自动仪中，37℃下搅拌1h后，以空白样品作为参比，在主波长540nm处测定标准
蛋白样品的吸光度，以标准蛋白样品的浓度和吸光度拟合标准曲线，结果如图1所示，在蛋白质含量为15~6000mg/l范围内，浓度与吸光度具有良好的线性关系，线性相关度r2达0.9996，曲线方程为y=0.0078x-0.1926；4)向待测尿液样品中加入样品体积0.1倍、100u/mg的尿素酶水溶液，静置，37℃下孵育20min，去除尿液样本中的尿素；将钠基膨润土粉碎至250目，用质量分数为15%的氯化钠溶液进行清洗；将钠基膨润土分散于10重量倍的二氯甲烷中，加入钠基膨润土质量0.3倍的2-乙氧基苄基异氰酸酯，80℃下超声搅拌35min后过滤、水洗、干燥得到活性钠基膨润土；将钠基膨润土加入到待测尿液样品中，振荡40min后，过滤去除尿液中的硫和磷；5)按照体积比1:5，向预处理后的待测尿液样品中加入尿蛋白快速检测试剂，37℃下搅拌1h后，测定吸光度并代入标准曲线中计算得到蛋白质含量。
32.实施例2：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.3%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.03%，即二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.1。
33.实施例3：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.25%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.05%，即二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.2。
34.实施例4：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.3%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.015%，即二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.05。
35.实施例5：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的质量分数为0.3%，二环己基酒石酸酯的质量分数0.09%，即二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的质量比为1:0.3。
36.实施例6：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中未添加二环己基酒石酸酯，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠的添加质量分数为0.3%。
37.实施例7：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中未添加二异辛基琥珀酸酯磺酸钠，二环己基酒石酸酯的添加质量分数为0.045%。
38.实施例8：
本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，制备尿蛋白快速检测试剂过程中，试剂b中未添加二环己基酒石酸酯和二异辛基琥珀酸酯磺酸钠。
39.实施例9：本实施例提供了另一种尿蛋白的检测方法，其步骤与实施例1基本相同，不同之处在于，待测尿液样品预处理过程中，钠基膨润土未经2-乙氧基苄基异氰酸酯处理。
40.试验例1：准确性测试：以凯氏定氮法、传统双缩脲法、实施例1、4~9所述方法对相同待测尿液样品进行测定，每组测试5次，取平均值计为蛋白质含量，并利用下述公式计算相对误差：相对误差=(c
0-c)/c0×
100%，其中，所述c0为凯氏定氮法测定结果，c表示传统双缩脲法或实施例1、4~9所述方法测定结果，所述传统双缩脲法是：将3ml0.1g/l的氢氧化钠水溶液加入到3ml待测尿液样品中，振荡均匀后，加入2滴0.01g/ml的硫酸铜水溶液，振荡均匀后测定吸光度。结果如表1所示。
41.表1检测结果表1是待测尿液样品的测定结果，如表1所示，实施例1中尿蛋白的测定结果与凯氏定氮法测定结果相比，相对误差为0.17，传统双缩脲法测定的蛋白质含量与凯氏定氮法测定结果相比，相对误差为1.18%，本发明提供的检测方法的相对误差更小，由此可知，相比传统双缩脲法，本发明提供的尿蛋白快速检测试剂测定的蛋白质含量更接近蛋白质的真实含量，具有更高的准确性；还可以看出，实施例4~8中尿蛋白的测定结果与凯氏定氮法测定结果相比，相对误差在0.74~1.34%，明显高于实施例1，由此可知，制备尿蛋白快速检测试剂中添加一定质量比的二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯，有助于提升试剂的检测
准确性；还可以看出，实施例9中尿蛋白的测定结果与凯氏定氮法测定的蛋白质相比，相对误差在0.94%，由此可知，待测尿液样品的预处理可减少尿素等对尿蛋白检测的影响，提升检测结果的准确性。
42.试验例2：灵敏度测试：用传统双缩脲试剂和本发明实施例1提供的尿蛋白快速检测试剂，加入到同一待测尿液样品中振荡均匀，测试吸收光谱；所述传统双缩脲试剂中包括：0.1g/l的氢氧化钠水溶液，0.01g/ml的硫酸铜水溶液；测得吸收光谱如图2所示。
43.图2是尿蛋白快速检测试剂与传统双缩脲试剂的吸收光谱，图中a代表尿蛋白快速检测试剂，b代表传统双缩脲试剂；观察图2可知，本发明提供的尿蛋白快速检测试剂测定的蛋白质的吸光度最大值为0.317，而传统双缩脲试剂测定蛋白质的吸光度最大值为0.139，因此，本发明的方法增敏作用显著，同等条件下，灵敏度比传统双缩脲试剂明显提高。
44.试验例3：重复性测试：利用实施例1、4~8提供的方法对同一待测尿液样品进行重复测试10次，计算标准偏差和变异系数，用变异系数评价其重复性，测定结果如表2所示。
45.表2重复性测试结果表2是尿蛋白快速检测试剂的重复性测试结果，观察表2可知，实施例1提供的方法对待测尿液样品进行重复测试10次，标准偏差为1.2mg/l、变异系数为0.61%，说明20次的重复性试验误差较小，本发明提供的尿蛋白快速检测试剂重复性好、准确度高；对比实施例1和4~8可知，实施例4~8的标准偏差和变异系数均明显高于实施例1，说明在尿蛋白快速检测试剂中添加一定质量比的二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯，有助于提升试剂的重复性，提高准确性。
46.试验例4：稳定性测试：
将实施例1、4~8中的尿蛋白快速检测试剂在37℃下保存，分别在0d、5d、10d、20d时，依据实施例1提供的方法对同一待测尿液样品进行检测，并利用下述公式计算变化率：变化率(%)=(c
t-c0)/c0×
100%；c
t
保存不同时间后尿蛋白的测定含量，c0时间为初始时尿蛋白的测定含量，利用变化率用于评价稳定性，测定结果如图3所示。
47.图3是尿蛋白快速检测试剂的稳定性测试结果示意图；图中b代表保存5d后尿蛋白的变化率，c代表保存10d后尿蛋白的变化率，d代表保存20d后尿蛋白的变化率；观察图3可知，优选实施例1中的尿蛋白快速检测试剂具有较高的稳定性，在37℃下保存20d后不会出现大量浑浊，省去了试剂在使用前需要进行过滤的预处理步骤，性能不发生改变，蛋白质检测结果仅变化了1.13%，仍具有较高的准确性；实施例4~8的尿蛋白快速检测试剂不同之处在于，双缩脲试剂的成分不同，实施例4~8的变化率明显高于实施例1，由此可知，二异辛基琥珀酸酯磺酸钠、二环己基酒石酸酯的添加对尿蛋白快速检测试剂的稳定性具有较大的影响。
48.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程，但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。