能改善化疗药导致卵巢功能损伤的中药组合物及制备方法和应用

1.本发明涉及中药医疗技术领域，具体地指一种能改善化疗药导致卵巢功能损伤的中药组合物及制备方法和应用。


背景技术：

2.近年来我国恶性肿瘤的发病率不断上升，目前恶性肿瘤已经成为国人的首位死亡原因。数据显示，在2000年至2011年间，女性恶性肿瘤发病率的增长速度显著增加( 2.2％每年，p《0.05)。与此同时，女性生殖系统恶性肿瘤呈现出发病人群年轻化的特点，2009至2011年之间登记的数据提示，在新近诊断为子宫恶性肿瘤的患者中，45岁以下患者的百分比为29.7％。随着早期检测方法以及多元化抗肿瘤手段的发展进步，肿瘤患者的生存率大大提高，发病率的升高和死亡率的下降导致治疗后年轻恶性肿瘤患者的绝对数累计增加。对于仍处在育龄期的女性肿瘤幸存者来说，不仅需要得到最有效的癌症治疗，延长寿命，同时要保证生活质量，与生活质量相关最重要的问题就是化疗导致的卵巢内分泌功能受损，远期生育力下降甚至发生卵巢早衰。抗肿瘤治疗对于患者生育功能的不良影响逐渐被重视，如何保护肿瘤患者的生育力，如何满足肿瘤患者的生育需求受到临床医生以及学者的广泛关注。
3.环磷酰胺(ctx)是常用的化疗药之一，具有高度的卵巢毒性，可作用于肿瘤细胞及正常细胞dna，引起dna单链或者双链的断裂，继而出现rna无法正常转录，蛋白质无法正常合成的情况，最终造成性腺组织损伤。ctx目前被广泛用于治疗各种恶性肿瘤和自身免疫性疾病，包括乳腺癌、鼻咽癌等实体肿瘤，以及血液和淋巴系统恶性肿瘤。ctx的性腺毒性，表现为卵泡数目减少，卵巢组织形态结构改变，卵巢功能下降，最终出现化疗源性卵巢早衰(pof)。pof不仅仅会导致雌激素缺乏，增加早期绝经的风险，对患者生活质量、骨骼功能、心血管和身心健康产生严重不良影响，而且影响女性的远期生育能力。因此积极寻求有效途径改善化疗导致pof状况，提高卵巢功能及生育能力，已经成为临床亟待解决的难题。目前针对pof尚无有效的针对性治疗措施，pof患者出现的不适症状，源于雌激素水平低下，故临床上常采用激素替代疗法(hrt)，即利用雌激素和孕激素序贯联合或者连续联合。在正常更年期妇女中应用hrt疗法可以有效改善绝经症状，同时兼顾安全性及有效性。针对生育期卵巢恶性肿瘤及宫颈癌患者，在接受化疗/放疗后出现的医源性pof，hrt疗法有效缓解患者症状，且不影响患者的5年生存率。hrt疗法补充性激素即可明显改善患者类似绝经期症状，同时能降低远期并发症诸如骨质疏松和骨折，心脑血管疾病以及老年痴呆的风险，因此hrt疗法无论是从生理上还是心理上都有其他治疗无可比拟的优点，同时需要注意的是长期全身性激素替代治疗，可能影响患者肝、肾功能，甚至可能会增加罹患乳腺癌、子宫内膜癌的风险。除此之外，hrt虽可改善患者的pof症状，却无法满足患者的生育要求，许多年轻患者常常面临着自然受孕障碍且辅助生殖技术成功率极低的困境。
4.传统中药是我国传统文化中一颗璀璨的明珠，中药尤其是药食同源的中药更是具
有极高的安全性。近年来，众多学者尝试以现代科学思路开发中药的新用途，并阐明中药的作用机制，为治疗pof提供了新的思路。已有学者先后尝试利用不同中药组分组成复方，如四二五合方加减治疗pof患者，口服药物后月经情况明显改善的患者比例达到80％以上；而在关于补肾益冲丸疗效的研究中，患者症状改善情况，血清中雌激素水平上升情况均高于对照组(hrt)；补肾活血方更是可以通过调节免疫反应，抑制卵泡凋亡，从而改善卵巢功能。既往的研究显示，中药组合物能通过多层面，多环节调节机体反应，最终达到改善pof的目的。因此本发明在药食同源思想的指导下，筛选出桑葚、葛根、茯苓以及枸杞这四味中药作为组合物的组成成分。这四味药材其中含有的活性成分，从黄酮类到多糖类，从氨基酸到生物碱，从维生素到氨基酸等不尽相同，尽管活性成分各异，它们都具有强效抗氧化应激的作用，能调节机体免疫功能，发挥抗炎抗衰老效应。


技术实现要素：

5.本发明为了解决以上问题，提供一种能改善化疗药导致卵巢功能损伤的中药组合物及制备方法和应用。本发明提供的中药组合物，依据传统医学中药食同源的指导思想，合理搭配中药四气五味，升降沉浮和君臣佐使。具有能够缓解由化疗药造成的卵巢功能损伤的作用。
6.为达到上述目的，本发明通过下述技术方案实现：
7.第一方面，本发明提供一种能改善化疗药导致卵巢功能损伤的中药组合物，所述中药组合物包括以下重量份的原料：桑葚3-30份、葛根4-40份、茯苓5-50份、枸杞5-50份。
8.优选的是，所述桑葚、葛根、茯苓和枸杞之间的重量比为1:1:1:1
9.第二方面，本发明提供一种制备中药组合物的方法，包括：
10.称取葛根与桑椹，加水煎煮，收集煎煮液，过滤煎煮液后醇沉后即得到1#提取物；
11.称取茯苓与枸杞，加水煎煮，收集煎煮液，过滤煎煮液后醇沉后即得到2#提取物；
12.将1#提取物和2#提取物混合后即得到所述中药组合物。
13.从中药材中提取有效成分时，由于存在多种成分间的相互助溶的情况。通常需根据提取要求、目的成分及杂质的性质差别以及溶剂的溶解能力来确定，药材可以直接用乙醇提取，提取液浓缩成膏，干燥成粉。按照“相似相溶”的原则，保证提取过程中能最大程度提取出其中有效活性成分，因此参考组合物中各味中药活性成分特点，将四味中药分成两部分进行煎煮提取，1#提取物来自葛根及桑椹的混合，葛根的主要活性成分为黄酮及淀粉，桑椹的主要活性成分为黄酮及多糖，活性成分类似；2#提取物来自茯苓与枸杞的混合，茯苓的主要活性成分为三萜类及多糖，枸杞的主要活性成分为多糖类及氨基酸。
14.优选的是，所述1#提取物加水煎煮的具体过程为：
15.葛根与桑椹分别破碎至20-60目的粗粉，混合，加入其重量7-15倍体积的纯水煎煮，煎煮后分别收集粗粉及滤液，粗粉中加入7-15倍体积的纯水再次煎煮，煎煮过程重复2-3次，每次煎煮时间1-3小时，收集所有煎液，室温冷却后过滤，收集滤液并浓缩至一定体积，加入2-5倍体积无水乙醇，室温醇沉12-24小时后过滤，滤饼用体积分数75-90％乙醇洗涤2-3次，沉淀后得到1#提取物。
16.优选的是，所述2#提取物加水煎煮的具体过程为：
17.茯苓丁与枸杞分别破碎至20-60目的粗粉，混合，加入其重量3-10倍体积的纯水煎
煮，100℃煎煮1-3小时，随后分别收集粗粉及滤液，粗粉中加入7-15倍体积的纯水再次煎煮，煎煮过程重复2-3次，时间分别是1-3小时，1-2小时；收集所有煎煮液，室温冷却后过滤；收集滤液并浓缩至一定体积，加入2-5倍体积无水乙醇，室温醇沉12-24小时后过滤，滤饼用体积分数75-90％乙醇洗涤2-5次，沉淀后得到2#提取物。
18.第三方面，本发明提供一种采用如前所述的中药组合物在改善化疗药导致卵巢功能损伤中的应用。
19.所述卵巢功能损伤包括卵巢内分泌功能障碍、卵巢生育功能障碍。
20.优选的是，所述化疗药包括环磷酰胺、多柔比星和顺铂中的一种或多种。
21.第四方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括有效剂量的如前所述的中药组合物，以及药学上可接受的载体、辅料或赋性剂组成的组合物。
22.上述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等；填充剂如淀粉、蔗糖等；黏合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮等；湿润剂如甘油等；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠等；表面活性剂如十六烷醇等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、镁和聚乙二醇等。另外，还可以在药物组合物中加入其它辅助剂如香味剂、甜味剂等。
23.本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域常规的生产方法制备。例如使活性成份与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。
24.优选的是，所述药物组合物的应用形式为中药制剂、复方药物或保健食品。
25.上述中药组合物能够进一步被制备成药学上可接受的中药制剂，如颗粒剂、胶囊剂、片剂、糖浆剂等口服制剂，或经静脉、肌肉、腹腔给药的注射剂等。
26.对本发明各组成成分的药理作用分析如下：
27.桑葚，主要的活性成分有总黄酮类、多糖类、生物碱、苯并呋喃类、氨基酸、维生素、矿物质元素、粗纤维、花青素等。药理研究有提高免疫力、抗衰老、抗氧化、降低血糖、降低血脂、抗肿瘤、抗炎等作用。
28.葛根，主要的活性成分有异黄酮类、总黄酮类、多糖类、多环芳烃类、氨基酸、微量元素等。药理研究有扩张血管、抗心律失常、抗氧化、降低血糖、降低血脂、抗肿瘤、抗炎、抗感染、解热镇痛等作用。
29.茯苓，主要的活性成分有三萜类、多糖类、甾醇类、微量元素、氨基酸等。药理作用有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、降低血糖、降低血脂、抗氧化、抗衰老等作用。
30.枸杞，主要的活性成分有多糖类、氨基酸、维生素、微量元素、类胡萝卜素、生物碱等。药理作用有免疫调节、抗衰老、抗氧化、降低血糖、降低血脂、抗肿瘤等作用。
31.本发明对上述原料的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的常规市售优等产品即可。
32.本发明与现有技术相比，具有如下优点及有益效果：
33.本发明充分利用中药资源，通过动物实验，开发出中药组合物改善化疗药(ctx)导致卵巢功能损伤的新用途，该提取物可以添加到不同剂型的产品中去，用于治疗因化疗药(ctx)损伤导致的卵巢内分泌功能紊乱、生育功能下降，具有疗效好、性价比高等特点。
附图说明
34.图1是各组小鼠体重-日期折线图。
35.图2是各组小鼠卵巢质量对比图。
36.图3是各组小鼠卵巢指数对比图。
37.图4是各组小鼠造模后动情周期规则情况对比图。
38.图5是各组小鼠血清中amh水平图。
39.图6是空白对照组小鼠卵巢组织形态图。
40.图7是中药组合物组小鼠卵巢组织形态图。
41.图8是ctx组小鼠卵巢组织形态图。
42.图9是ctx 中药组合物组小鼠卵巢组织形态图。
43.图10是各组小鼠始基卵泡计数结果图。
44.图11是各组小鼠初级卵泡计数结果图。
45.图12是各组小鼠次级卵泡计数结果图。
46.图13是各组小鼠窦卵泡计数结果图。
47.图14是各组小鼠闭锁卵泡计数结果图。
具体实施方式
48.以下结合附图、实施例和实验例对本发明作进一步的详细描述。当然，本发明的保护范围并不限于下述实施例。本领域专业技术人员能够理解，在不背离本发明精神的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但本发明仍然在此作尽可能详细的描述。以下实施例是进一步说明本发明，而不是限制本发明。任何依据本发明构思所作出的仅仅为形式上的而非实质性的等效变换都应视为本发明技术方案的范畴。
49.下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
50.实施例1
51.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚30份、葛根30份、茯苓30份、枸杞30份。
52.实施例2
53.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚30份、葛根30份、茯苓40份、枸杞40份。
54.实施例3
55.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚25份、葛根40份、茯苓45份、枸杞50份。
56.实施例4
57.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚3份、葛根15份、茯苓5份、枸杞10份。
58.实施例5
59.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚10份、葛根5份、茯苓12份、枸杞5份。
60.实施例6
61.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物，其由以下原料制成：桑葚30份、葛根40份、茯苓50份、枸杞50份。
62.一种改善ctx导致卵巢功能损伤的中药组合物
63.上述实施例提供的中药组合物的制备方法，包括以下步骤：称取桑葚、葛根、茯苓、枸杞。
64.第一步：先取葛根与桑椹分别破碎至20-60目的粗粉，混合，加入其重量7-15倍体积的纯水煎煮，煎煮后分别收集粗粉及滤液，粗粉中加入7-15倍体积的纯水再次煎煮，煎煮过程重复2-3次，每次煎煮时间1-3小时，收集所有煎液，合并煎液，室温冷却后过滤，收集滤液并浓缩至一定体积，加入2-5倍体积无水乙醇，室温醇沉12-24小时后过滤，滤饼用体积分数75％-90％乙醇洗涤2-3次，得到沉淀。
65.第二步：再取茯苓丁与枸杞分别破碎至20-60目的粗粉，混合，加入其重量3-10倍体积的纯水煎煮，100℃煎煮1-3小时，随后分别收集粗粉及滤液，粗粉中加入7-15倍体积的纯水再次煎煮，煎煮过程重复2-3次，时间分别是1-3小时，1-2小时；收集所有煎煮液，室温冷却后过滤；收集滤液并浓缩至一定体积，加入2-5倍体积无水乙醇，室温醇沉12-24小时后过滤，滤饼用体积分数75％-90％乙醇洗涤2-5次，得到沉淀。
66.合并以上两步获得的沉淀，即得到该中药组合物。
67.以实施例1制备得到的中药组合物为例进行效果说明。
68.实验方案
69.1.1主要试剂
70.抗缪勒管激素检测试剂盒、4％多聚甲醛、苏木素染液、伊红染色液、二甲苯、无水乙醇等。
71.1.2主要仪器
72.电子天平(mettler toledo)、酶标仪(molecular devices)、正置光学显微镜(olympus公司)、高速低温离心机(heal force公司)等。
73.1.3实验动物
74.spf级的6周龄的c57bl/6j雌鼠，实验动物购自北京维通利华实验动物有限公司。根据国际伦理委员会指南以及华中科技大学伦理委员会的批准，所有实验动物饲养华中科技大学同济医学院同济医院实验动物中心spf屏障环境内，饲养在恒温26℃，规律光照周期(有光照及无光照时间各12小时)。进入屏障环境饲养的所有实验小鼠均可以自由获取食物和水，在正式实验开前，先进行为期1周的检疫隔离及适应性饲养。
75.1.4实验分组
76.所有小鼠共计40只，分为4组，即空白对照组、ctx组、中药组合物组、ctx 中药组合物组。
77.1.5化疗药物损伤卵巢模型构建造模方法：
78.ctx组及ctx 中药组合物组，在d11、d16、d21天时腹腔注射环磷酰胺(75mg/kg)。空白对照组及中药组合物组则给予相同体积质量分数为0.9％的生理盐水腹腔注射。
79.1.6给药剂量和灌胃方法
80.1.6.1实验药物来源及配制方法
81.按照人与小鼠体表面积换算的等效剂量比率：40g/60kg＊9＝6g生药/kg/d，将实施例1制备得到的中药组合物，计算出小鼠对应的组合物质量，以双蒸水配制成所需体积的混悬液备用。
82.根据《试验动物学》，一般小鼠灌胃的容积0.1-0.8ml，选择灌胃量为0.2ml/20g。
83.1.6.2给药方式
84.1.6.2.1中药组合物组
85.上述制备完成的混悬液，灌胃，0.2ml/20g/d，连续灌服40天，在上述时间点腹腔注射生理盐水。
86.1.6.2.2 ctx组
87.生理盐水，灌胃，0.2ml/20g/d，连续灌服40天，在上述时间点腹腔注射环磷酰胺。
88.1.6.2.3ctx 中药组合物组
89.上述制备完成的混悬液，灌胃，0.2ml/20g/d，连续灌服40天，在上述时间点腹腔注射环磷酰胺。
90.1.6.2.4空白对照组
91.生理盐水，灌胃，0.2ml/20g/d，连续灌服40天，在上述时间点腹腔注射生理盐水。
92.1.7标本收集及储存
93.血清：于末次给药24小时后，给予各组小鼠质量分数为4％水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉药物剂量为0.2ml/20g)，待小鼠麻醉完全后。使用无菌眼科弯镊摘取小鼠眼球，使用ep管收集自眼眶后静脉丛流出的血液，取血过程中避免血液沾到小鼠皮毛被污染或发生凝血。收集到的血液在室温静置半小时以上，使用4℃离心机以1500rcf离心15分钟，将分离出来的血清置于新的ep管中，做好标记后冻存于-80℃冰箱备用。
94.卵巢：待采血完成后，以颈椎脱臼法处死小鼠后，使用无菌眼科剪在小鼠腹部剪开一个小口，由该小口处沿肋骨后缘向两侧做横形切口，暴露出小鼠腹腔后。镊子推开肠管，寻找“y”形子宫，沿子宫及输卵管方向找到卵巢。使用眼科镊及眼科剪完整摘取双侧卵巢，尽量剥除附于其表面的脂肪组织，双侧卵巢分别称量并记录质量，一侧卵巢置于含有0.5ml多聚甲醛的er管中，固定24-48小时；另一侧卵巢立即冻存于-80℃冰箱备用。
95.1.8实验观察指标
96.1.8.1动情周期
97.按照实验计划，分别在完成造模后以及完成40天给药后，分别进行为期10天以及为期7天的动情周期监测。每天9：00-11：00进行，具体的方法如下：用200μl的微量移液器，吸取约0.02ml生理盐水，自小鼠阴道口缓慢注入，反复冲洗2-3次后，均匀涂抹在载玻片上，静置干燥阴道分泌物涂片。he染色后，通过观察涂片中的主要细胞的比例来确定小鼠所处的性周期阶段：动情前期：大部分为小而圆的有核上皮细胞，可见少量的角化上皮细胞；动情期，细胞主要是角质化的上皮细胞，光镜下可见大量红染的无核角质化上皮细胞，该细胞是由有核上皮细胞转化而来的；动情后期：在动情后期中，由50％的角质化上皮细胞和50％的白细胞组成；动情间期：角质化的上皮进一步减少，白细胞大量增多，甚至在光镜下观察到的细胞几乎以白细胞为主。正常性周期性被定义为存在至少两个连续的正常性周期。
98.1.8.2血清抗苗勒氏管激素水平测定
99.取出冻存于-80℃冰箱的血清，置于冰上缓慢融化，待其融化后再次离心，同时将血清抗苗勒氏管激素(amh)酶联免疫吸附测定试剂盒自4℃冰箱中拿出放在室温中平衡，按照试剂盒的说明书具体操作：
100.加样：依次吸取50μl已知浓度的标准品，分别为s0、s1、s2、s3、s4、s5加入反应孔并设置复孔，之后各个孔依次加入待测小鼠血清50μl(设置复孔)，空白孔内暂不加入任何液体；
101.加hdr结合物：在各个孔内依次加入50μl hdr结合物，空白孔内不加；
102.混匀：整个酶标板在微孔板混匀器中，按照400转/分钟的速度混匀1分钟；
103.孵育：混匀后的酶标板避光后在37℃恒温箱中孵育1小时；
104.洗涤：弃去反应孔内的液体，并在吸水纸上拍干孔内残留液体，再向每个孔内加入200μl洗涤液，静置洗涤10秒后弃去洗涤液，之后在吸水纸上拍干各孔内残留液体，以上洗涤的过程重复进行3次；
105.加入反应底物：向各个孔内加入50μl底物a以及50μl底物b，加样过程中注意避光操作；
106.混匀：整个酶标板在微孔板混匀器中，按照400转/分钟的速度混匀1分钟；
107.孵育：混匀后的酶标板避光后在37℃恒温箱中孵育15分钟；
108.停止反应：观察加入标准品的反应孔，当观察到s3与s4出现肉眼可分辨的颜色差别时，即向各个反应孔内加入50μl终止液停止反应；
109.结果测定：中止后孔内液体颜色变为黄色，应用酶标仪测定450nm波长处各个反应孔的光密度(od)，测定过程应在中止反应后10m内完成。
110.1.8.3卵巢组织病理学观察
111.将如前所述收集到的卵巢组织常规固定、脱水、石蜡包埋、切片、he染色，然后在400倍光学显微镜下观察卵巢的形态，记录各级卵巢的数目，具体步骤如下：
112.固定：小鼠卵巢称重后，在固定液中至少固定24小时以上，将组织从固定液中取出来后进行简单修整，贴好标签置于脱水盒中；
113.脱水浸蜡：脱水盒在梯度酒精中进行脱水。75％酒精4小时，85％酒精2小时，90％酒精2小时，95％酒精1小时，无水乙醇i 30分钟，无水乙醇ii 30分钟，醇苯5-10分钟，二甲苯i 5-10分钟，二甲苯ii 5-10分钟，65％融化石蜡i1小时，65％融化石蜡ii 1小时，65％融化石蜡iii 1小时；
114.包埋：将融化的蜡放入包埋框中，待蜡凝固之前将组织从脱水盒中取出，按照卵巢最大横切面放入包埋框中。于-20℃冻台冷却蜡块，待蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块；
115.切片：待蜡块冷却后切片，厚4μm，切片漂浮于摊片40℃温水上组织展平，载玻片将组织捞起，60℃烘箱内烤片，待石蜡融化；
116.he染色：石蜡融化后一次放入二甲苯i 20分钟，二甲苯ii 20分钟，无水乙醇i 5分钟，无水乙醇ii 5分钟，75％酒精5分钟，自来水洗；
117.苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5分钟，自来水洗后，分化液分化，切片进入返蓝液中返蓝10秒左右，自来水洗；
118.伊红染色：切片依次进入85％、95％酒精各脱水5分钟，再进入伊红染液中染色2分钟；
119.脱水封片：切片依次放入无水乙醇i 5分钟，无水乙醇ii 5分钟，无水乙醇iii 5分钟，无水乙醇iii 5分钟，二甲苯i 5分钟，二甲苯ii 5分钟，中性树脂封片。
120.1.8.4卵泡计数
121.使用光学显微镜观察he切片，并对切片上各个时期的卵泡进行计数，各时期卵泡判断标准如下：
122.始基卵泡：如果卵泡包含有完整的卵母细胞，且卵母细胞具有可见的核仁，卵泡被单层梭状颗粒细胞所包围，此时的卵母细胞停留在减数分裂双线期，则评定其为始基卵泡。
123.初级卵泡：如果卵泡由完整的，扩大的卵母细胞组成，卵母细胞带有清晰可见的核仁，被单层立方形颗粒细胞所包围，卵母细胞跟颗粒细胞之间形成透明带，则将其评为初级卵泡。
124.次级卵泡：如果卵泡中，包含具有可见核仁的卵母细胞和一层以上的颗粒细胞，通常可以达到6-8层，此时没有形成明显的窦腔，此时则评定其为次级卵泡。
125.窦卵泡：在次级卵泡的基础上，雌激素跟卵泡刺激素的共同作用下，因颗粒细胞间聚集的卵泡液逐步增多，在卵泡中形成窦腔。
126.闭锁卵泡：若出现卵母细胞核固缩，颗粒细胞结构紊乱，细胞层数减少，在he染色后，于光学显微镜下表现为，散布在卵巢结缔组织间的呈粉红色均质染色的不规则形状。所有he切片由两名阅片者独自计数后求取平均值。
127.1.9实验数据分析
128.实验数据均使用graph pad prism 7.0进行统计学分析，不同组之间差异的显著性使用单因素方差检验，两组之间差异的显著性使用student’s t检验，两组之间率差异的显著性使用卡方检验。认为p《0.05即差异具有统计学意义。
129.1.10实验结果
130.1.10.1小鼠体重-日期折线图
131.从d28起，ctx组小鼠体重为各组中最低，显著低于中药组合组(p《0.05)，表1中详细记录d28各组小鼠的体重。
132.表1为d28各组小鼠体重情况
133.组别小鼠数量(只)小鼠体重(g)空白对照组1019.18
±
0.749*中药组合物组1019.827
±
0.992****ctx组1018.327
±
0.811ctx 中药组合物组1019.027
±
0.771
134.注：ctx组相比：*p《0.05，****为p《0.0001。
135.通过对表1的数据分析可知，自28天起，ctx组小鼠体重为各组中最低，与空白对照组相比，体重显著下降(p《0.05)。与ctx组相比，中药组合物组小鼠，体重明显增加(p《0.0001)。与此同时，ctx 中药组合物组小鼠与中药组合物组小鼠的体重无差异。由此可见，环磷酰胺严重影响小鼠体重，中药组合物治疗后，小鼠体重有所改善。
136.1.10.2小鼠卵巢质量和卵巢指数
137.表2为各组小鼠卵巢质量和卵巢指数
[0138][0139]
采血后处死小鼠，完整剥离双侧卵巢，电子分析天平称量两侧卵巢重量，卵巢质量用于计算卵巢指数：双侧卵巢质量/小鼠体重*100％。通过对表2的数据分析，对照组与中药组合物组小鼠的卵巢质量和卵巢指数高于其余两组(p》0.05)，ctx组小鼠的卵巢质量和卵巢指数均为各组中最低(p》0.05)。与ctx组比较，在ctx 中药组合物组小鼠的卵巢质量及卵巢指数呈上升趋势。
[0140]
1.10.3小鼠动情周期变化
[0141]
通过阴道脱落细胞检测小鼠动情周期变化，结果表明，造模之后，ctx组小鼠动情不规则比例高于其他组，不规则情况表现为持续的动情间期以及动情周期延长，在使用中药组合物治疗的小鼠中，动情周期不规则小鼠所占比率降低，小鼠动情周期有恢复趋势。由此可见，使用环磷酰胺腹腔注射之后导致小鼠动情周期紊乱，影响卵巢的内分泌功能；给予本发明中药组合物治疗后动情周期有恢复的趋势，可能可以改善小鼠卵巢功能。结果见表3。
[0142]
表3各组小鼠造模完成后动情周期规则情况统计表
[0143][0144]
1.10.4小鼠血清中amh变化
[0145]
在小鼠体内模拟化疗药对卵巢的损伤作用，ctx组小鼠血清amh水平较对照组显著降低(p《0.05)，与临床上恶性肿瘤患者予环磷酰胺治疗后的临床表现一致，提示通过该方式可以构建环磷酰胺致卵巢损伤的模型。在给予本发明中药组合物治疗后，小鼠血清amh水平较ctx组有所较大的改善，但不具有统计学意义(p》0.05)。结果见表4及图5。
[0146]
表4各组小鼠血清中amh激素水平
[0147]
组别小鼠数量amh水平(ng/ml)空白对照组101.962
±
0.802*中药组合物组102.172
±
1.235*
ctx组100.414
±
0.075ctx 中药组合物组101.317
±
0.246
[0148]
注：ctx组相比：*p《0.05。
[0149]
amh由卵泡颗粒细胞产生，是评估卵巢储备功能的重要标志物。综上结果，腹腔注射环磷酰胺后，小鼠出现动情周期紊乱，血清amh水平下降，提示小鼠卵巢内分泌功能损伤。在给予本发明提供的中药组合物后可以提高小鼠amh水平，改善卵巢功能。
[0150]
1.10.5小鼠卵巢组织病理学观察
[0151]
在光学显微镜下观察各组小鼠经过he染色的卵巢组织切片，发现ctx组小鼠卵巢体积较空白对照组明显缩小，发育成熟卵泡数减少，颗粒细胞层排列紊乱疏松，有较多的卵泡结构塌陷，卵巢中均染的红色物质较多。在给予中药组合物治疗后，可见卵巢体积有所增加，同时各级卵泡数稍增多，均染的红色物质稍减少，具体表现为：
[0152]
空白对照组：卵巢内皮质、髓质结构清晰，原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡均同时存在，可见成熟卵泡，且成熟卵泡有丰富的卵泡液，颗粒细胞排列整齐，卵母细胞完整，透明带清晰，可见较多黄体。结果见图6。
[0153]
中药组合物组：卵巢体积较大，可见各级卵泡，卵泡结构完整，颗粒细胞排列整齐，透明带清晰，可见较多黄体。结果见图7。
[0154]
ctx组：卵巢体积明显减小，卵泡数目明显较少，大部分卵泡有炎细胞浸润，发育成熟卵泡少见，闭锁卵泡增加，颗粒细胞层排列紊乱，间质可见炎细胞浸润及纤维化。结果见图8。
[0155]
ctx 中药组合物组：卵巢体积接近正常，可见各级卵泡，可见卵泡发育不良，黄体数目较多。结果见图9。
[0156]
1.10.6小鼠卵泡计数结果
[0157]
与空白对照组比较，ctx组小鼠始基卵泡数目显著减少(p《0.05)，初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡有减少趋势，与此同时闭锁卵泡数目显著增多(p《0.05)。与中药组合物组比较，也呈现出ctx组小鼠始基卵泡数目显著减少(p《0.05)，初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数目减少的趋势，闭锁卵泡数目显著增多(p《0.05)。与ctx组比较，ctx 中药组合物组小鼠始基卵泡数目显著增加(p《0.05)，初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数呈上升趋势，闭锁卵泡数目显著降低(p《0.05)。结果见图10-14。
[0158]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修饰、等同替换、改进等等，均应包含在本发明的保护范围之内。