桦褐孔菌培养方法及其培养物产品与流程

1.本发明总体涉及一种桦褐孔菌培养方法。


背景技术：

2.白桦茸，学名桦褐孔菌，拉丁学名inonotus obliquus(ach.ex pers.)pil
á
t，又名斜生纤孔菌、白桦菌、桦树茸、西伯利亚灵芝等，属担子菌门、伞菌纲、锈革孔菌目、锈革孔菌科，主要寄生于白桦、银桦、榆树、赤杨等树的活立木树皮下或砍伐后树木的枯干上。其主要分布于北纬45
°‑
50
°
的地区，如俄罗斯的西伯利亚、波兰、日本北海道、我国的黑龙江、吉林长白山，在山西吕梁、云南等地也有发现。白桦树中的桦褐孔菌菌丝在-40℃也不会冻死，是极耐寒的真菌种类。
3.研究发现桦褐孔菌含有多糖、三萜、甾体、多酚等多种有效成份，具有防治糖尿病、抗肿瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗疲劳、抗衰老、降血脂、增强免疫功能、保肝等多种生物活性及药理作用。近年来，关于其有效成份的药理作用和临床应用的研究逐渐增多。桦褐孔菌已广泛被制成茶剂、提取物、清洗剂、糖浆、坐浴剂、气雾剂等，用于结核病、胃病、肝病、心脏病、癌症等的防治。
4.桦褐孔菌生长方式和生存环境的特殊性使其野生资源极为稀少，且只有在活的桦树上生长10-15年的菌核才有使用价值。近年来，商业开采逐渐增多，桦褐孔菌面临严重的物种威胁，相关物种如冬虫夏草等也受到影响。
5.由于桦褐孔菌生长在人迹罕至的地方，在自然条件下主要以菌核形态存在，子实体通常存在于树皮下很难被发现，因此人工栽培生产困难。目前关于桦褐孔菌的人工驯化和栽培技术，无论是液体深层发酵，还是固态培养，大多处于实验研究阶段，在药效、量产及生产成本等诸多方面均亟待改进。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种改进的桦褐孔菌培养方法。
7.根据本发明的培养方法包括：
8.提供母种培养基，该母种培养基的成分为：马铃薯20％，燕麦2％，黄豆粉1％，琼脂2％，kh2po
4 0.3％，mgso
4 0.15％，vb
1 0.001％，余量为水，自然ph；
9.将桦褐孔菌菌株在母种培养基中培养后得到母种；
10.提供含水原种培养基，该原种培养基的(除水之外的)干质成分为：燕麦50％、黑小麦12％、黑玉米27.5％、麦麸10％以及石膏0.5％；
11.将在母种培养基中培养后得到的母种转接在原种培养基中培养后得到原种；
12.将在原种培养基中培养后得到的原种接种至栽培种培养基中培养后得到桦褐孔菌培养物，其中栽培种培养基与原种培养基成分相同。
13.根据本发明的方法，其中菌株在母种培养基中的接种量(菌株质量占母种培养基总质量的百分比)可以为10％左右。
14.根据本发明的方法，其中母种在原种培养基中的接种量(母种质量占原种培养基干质成分的质量或干重的百分比)可以为0.2％左右。
15.根据本发明的方法，其中原种在栽培种培养基中的接种量(原种质量占栽培种培养基干重的百分比)可以为0.1％左右。
16.根据本发明的方法，其中桦褐孔菌菌株在母种培养基中的培养温度为28℃左右，培养时间为15-20天。
17.根据本发明的方法，其中原种培养基的含水量为50％-60％。另外，母种在原种培养基中的培养温度为25-30℃，相对湿度为60％左右，培养时间为25天左右。
18.根据本发明的方法，其中原种在栽培种培养基中的培养温度为25℃左右，相对湿度为40％-60％，培养时间为90天左右。
19.在本发明中，如没有特别注明，各成分的含量是指其重量百分比含量或质量比。
20.本发明还提供了一种桦褐孔菌产品，其包含根据上述培养方法所得到的桦褐孔菌培养物。
21.本发明通过深层设计并优化培养条件，将基质转化为菌丝并积累代谢物质，从而获得了优质的桦褐孔菌培养物产品。
22.本发明成功培养出了具有一定功能因子含量的桦褐孔菌产品，适于工业化量产，获得的培养物产品可进一步用于制成食品、保健品、以及化妆品等。
附图说明
23.图1为多糖含量随培养时间的变化曲线图；
24.图2为三萜含量随培养时间的变化曲线图；
25.图3为sod活性随培养时间的变化曲线图；
26.图4为桦褐孔菌醇含量随培养时间的变化曲线图；
27.图5为白桦脂醇标准曲线图；
28.图6为桦褐孔菌醇标准曲线图；以及
29.图7为蛋白标准曲线图。
具体实施方式
30.下面结合实施例、对比例和附图对本发明做进一步说明，本领域技术人员应该理解，这些实施例、对比例和附图只是为了更好地理解本发明，并不用于任何限制目的。
31.配制母种培养基
32.实施例母种培养基成分(重量百分比)：马铃薯20％，燕麦2％，黄豆粉1％，琼脂2％，kh2po
4 0.3％，mgso
4 0.15％，vb
1 0.001％，余量为水，自然ph。
33.对比例母种培养基成分：使用葡萄糖2％、蔗糖2％、麦芽糖2％、黑玉米2％及小麦2％分别替代实施例中的燕麦2％，其它成分和条件同实施例保持不变，进行下面的碳源变化菌丝生长实验；再使用蛋白胨1％、黑玉米1％、酵母膏1％及牛肉膏1％分别替代实施例中的黄豆粉1％，其它成分和条件同实施例保持不变，进行下面的氮源变化菌丝生长实验；最后再选择燕麦、葡萄糖、蔗糖为碳源，黑玉米、黄豆粉为氮源，进行交叉实验。
34.母种培养实验
35.将桦褐孔菌菌株(商购自东北食药真菌研究所)在上述实施例及各对比例母种培养基中分别按10％的接种量(菌株质量占母钟培养基总质量的百分比)于28℃恒温避光培养15天，分别观察相应试管中菌丝生长情况如下表1、表2和表3所示。
36.表1：不同碳源对菌丝生长的影响
[0037][0038]
表2：不同氮源对菌丝生长的影响
[0039][0040]
表3：交叉试验结果
[0041][0042]
通过表1-3可知：
[0043]
白桦茸在不同碳源培养基上的生长速度表现为燕麦＞葡萄糖＞蔗糖＞麦芽糖＞黑玉米＞小麦。白桦茸不宜以黑玉米和小麦作为碳源，菌丝形态不佳，且长势缓慢。在以葡萄糖、蔗糖和麦芽糖为碳源的培养基上，菌丝形态较好，但生长速度较燕麦次之。以在燕麦
为碳源的培养基上菌丝粗壮整齐，且长势旺盛。
[0044]
白桦茸在不同氮源培养基上的生长速度表现为黑玉米＞黄豆粉＞蛋白胨＞酵母膏＞牛肉膏。白桦茸不宜以酵母膏、牛肉膏和蛋白胨作为氮源，菌丝形态不佳且生长较慢。在以黄豆粉为氮源的培养基上，菌丝形态良好，但生长速度较慢。以在黑玉米为氮源的培养基上长势最佳。
[0045]
但是，当选择燕麦、葡萄糖、蔗糖为碳源，黑玉米、黄豆粉为氮源，进一步进行交叉实验时，结果却出乎意外：在采用燕麦为碳源、黄豆粉为氮源的实施例培养基中，菌丝长速快且菌落形态好，明显优于其它尤其是采用燕麦为碳源、黑玉米为氮源的对比例培养基。
[0046]
配制原种培养基
[0047]
实施例原种培养基：燕麦50％、黑小麦12％、黑玉米27.5％(粗破碎)分别浸泡后，沥干，与麦麸10％、石膏0.5％混合，搅拌均匀后形成原种培养基(其初始含水量为50％)。
[0048]
原种培养实验
[0049]
将在上述实施例母种培养基中培养得到的母种转接在原种培养基中，接种量0.2％(母种的质量占培养基干重的百分比)，自然ph，25℃、相对湿度60％，培养25天后得到原种。
[0050]
对比例原种培养基：使用燕麦10％、30％、70％和90％分别替代实施例中的燕麦50％，其它成分和条件同实施例保持不变，进行燕麦含量变化菌丝生长实验；再使用培养温度20℃、30℃、35℃和40℃分别替代实施例中的25℃，其它成分和条件同实施例保持不变，进行温度变化菌丝生长实验；最后再使用环境相对湿度20％、40％和80％分别替代实施例中的湿度60％，其它成分和条件同实施例保持不变，进行湿度变化菌丝生长实验。分别观察上述实验的菌丝生长情况，如下表4所示。
[0051]
表4：燕麦含量、温度及湿度变化对菌丝生长的影响
[0052][0053]
从表4中可以看出，随着燕麦添加量的增加，菌丝生长速度逐渐增加，对其有显著影响(p＜0.05)。随着温度的升高，菌丝生长速度逐渐加快，但变化不明显(p＞0.05)，当温
度升至30℃后，污染情况增加。随着湿度的增加，菌丝生长速度也无显著变化(p＞0.05)，当湿度增加至80％后污染现象加重。
[0054]
栽培种培养实验
[0055]
将在上述实施例原种培养基中培养得到的原种接种至栽培种培养基中，接种量0.1％，于25℃恒温培养90天后，得到实施例培养物，其中栽培种培养基与原种培养基相同。
[0056]
对比例培养物：使用培养周期0天、30天、60天、90天、120天及150天分别替代实施例中的90天，其它条件不变得到对比例培养物。
[0057]
将上述实施例培养物及对比例培养物粗粉碎后于60℃烘干至恒重，再粉碎后得到相应样品，分别对其进行成分检测，结果如下。
[0058]
固体发酵过程中干物质损失、多糖、三萜、桦褐孔菌醇含量及sod活性的变化情况分别如下图1-4所示：初始时，培养基含有的多糖、三萜、桦褐孔菌醇及sod分别为2.4g/100g、0mg/g、0mg/g、6.6u/mg。随着培养时间的增加，基质消耗在第60天之后逐渐变慢，说明在60天后菌丝生长进入稳定期。多糖含量也在前60天时快速增加，之后进入平稳期。三萜含量在第60天后开始急剧增加，第90天积累到最大值，之后出现缓慢的下降。其中，桦褐孔菌醇的含量在第30天时开始增加，在第120天达到最大值，之后开始下降。sod活性在第90天时达到最高，之后出现急剧的下降。
[0059]
综合上述几种指标的变化，实施例的固体发酵时间90天最为适宜，此时的干物质损失为43.32％，多糖含量为8.56g/100g，三萜含量为3.96mg/g，桦褐孔菌醇含量为0.47mg/g，sod活性为32u/mg。经过桦褐孔菌的生态转化，基质中这些活性成分累积增加。
[0060]
上述成分检测按照如下方法进行。
[0061]
干物质损失测定
[0062]
固态培养过程中由于菌丝体无法与基质完全分离，因此生物量的测定相当困难。本发明以固态培养发酵过程中干物质的损失来反映单位面积内生物量的变化。
[0063]
干物质损失(％)＝(基质初始干重-发酵结束后物质干重)/基质初始干重
ⅹ
100％
[0064]
多糖检测
[0065]
按照ny/t 1676-2008食用菌粗多糖含量的测定方法进行。
[0066]
三萜检测
[0067]
取处理好的样品干燥粉末100mg于离心管中，加入6ml 95％乙醇，混合均匀后，静置24h，离心20min，取上清液备用。
[0068]
准确吸取上清液0.1ml，补足95％乙醇至0.5ml，再加入0.2ml8％香草醛-冰醋酸溶液和5ml 60％的硫酸乙醇溶液，混匀，50℃水浴20min，4℃冷水浴20min。于533nm处检测吸光度，每个处理重复3次。同时做试剂空白。
[0069]
标准曲线制作
[0070]
将白桦脂醇对照品制成浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.12、0.14mg/ml的系列标准溶液，分别取0.5ml，加入0.2ml8％香草醛-冰醋酸溶液和5ml 60％的硫酸乙醇溶液，混匀，50℃水浴20min，4℃冷水浴20min。于533nm处检测吸光度，绘制标准曲线，如图5所示。
[0071]
桦褐孔菌醇检测
[0072]
准确称取20g样品，加入200ml 95％的乙醇，超声处理4h，过滤，取滤液，60℃旋转
蒸发后，用40ml乙酸乙酯-水(3：1)萃取后，将乙酸乙酯层分离，再用甲醇进行萃取，萃取液过0.22μm滤膜，待测。
[0073]
检测条件
[0074]
色谱柱：安捷伦zorbax sb-c18色谱柱(4.6
ⅹ
250mm，5μm)；流动相90％甲醇：水(90：10)，15-20min甲醇：水(70：30)；流速：1ml/min；进样量20μl；桦褐孔菌醇保留时间12.5min。
[0075]
标准曲线绘制：用色谱级甲醇将标准品配置成0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1mg/ml的标准溶液，进行hplc分析，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，如图6所示。根据标准曲线计算样品中桦褐孔菌醇的含量。
[0076]
sod检测
[0077]
准确称取0.5g(精确至0.0001g)样品于预冷的研钵中，加入3ml预冷的0.05mol/l磷酸缓冲液(ph 7.8)，研磨5min，转入离心管中，洗涤3次，每次用量为1ml，洗涤液转入离心管。4000rpm/min离心20min，上清液即为粗酶液。
[0078]
sod活力检测
[0079]
取规格相同的试管或比色管，按下表5加入各溶液。
[0080]
表5
[0081][0082]
混合均匀，1支对照管置暗处，其它各管于4000lx日光下反应20min。
[0083]
以不照光的对照管做空白，于560nm处检测吸光度。
[0084]
蛋白含量检测
[0085]
样品检测
[0086]
按下表6加样后混合均匀，室温下放置10min，以不照光的对照管做空白，于595nm处检测吸光度，根据标准曲线计算样品中的蛋白含量。
[0087]
表6
[0088][0089]
标准曲线绘制
[0090]
取6只试管，按下表7取样，混合均匀后，室温下放置10min后，于595nm处检测吸光度。根据吸光度绘制标准曲线，如图7所示。
[0091]
表7
[0092][0093]
其中sod比活力(u/mg)＝sod总活性/蛋白质总浓度
[0094]
如上所述，本发明在传统菌类培养方法的基础上，首次将不同粮谷混合作为基质，通过优化不同阶段的培养基，获得了优良的桦褐孔菌菌丝体，并且无需进行菌丝体和基质的进一步分离。
[0095]
另外，本发明在降低原料成本的同时减少了对野生资源的开采，从而进一步保护该物种。