使用抗BAG2抗体诊断癌症的方法

使用抗bag2抗体诊断癌症的方法
1.发明背景
1.技术领域：
2.本公开涉及用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段；以及提供用于诊断癌症的信息的方法。
3.2.一般背景和现有技术：
4.共伴侣蛋白bcl-2相关永生基因(bag)蛋白家族介导包括细胞内蛋白折叠、应激反应、神经元分化、细胞凋亡和细胞增殖在内多种生理过程，并且在功能上与各种协同蛋白结合。bag2(具有抗细胞凋亡活性的bag结构域家族成员之一)是hsc70相互作用蛋白(chip)的c末端的负调控因子，其是伴侣蛋白相关的泛素连接酶。bag2在通过抑制chip活性调控蛋白质中的主要作用是通过稳定伴侣蛋白相关蛋白质(如pink1和cftr)而与神经变性疾病和常染色体隐性遗传疾病相关。据报告，bag2以使得bag2的表达增加蛋白酶体抑制剂诱导的细胞凋亡的方式具有促凋亡活性，并且当甲状腺癌细胞暴露于蛋白酶体抑制剂mg132中时，bag2敲低可部分抑制细胞凋亡。还据报告，在各种突变型k-ras诱导的肿瘤中，bag2的过表达促进强效肿瘤基因stk33蛋白的稳定化，从而促进肿瘤的发展。然而，尽管有这些发现，但bag2在癌症进展和转移中的作用尚不清楚。
5.因此，需要开发用于使用特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体来诊断癌症的组合物和方法。


技术实现要素：

6.通过对本发明的以下描述、所附参考附图和所附权利要求书，将能更全面地了解本发明的这些和其他目的。
7.一个方面提供了用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。
8.另一个方面提供了用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包括所述组合物。
9.另一个方面提供了提供用于诊断癌症的信息的方法。
10.另外的方面将部分地在下文描述中被阐述，部分地将从说明书中显而易见或者可通过实践所呈现的本公开的实施方式学习到。
11.一个方面提供了用于诊断癌症的组合物，所述组合物包含特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段。
12.bag2多肽可源自哺乳动物。所述哺乳动物可以是人(智人)、小鼠(小家鼠)、猴、牛或马。bag2可包含seq id no:69的氨基酸序列。seq id no:69的氨基酸序列是对应于ncbi参考seq id no:nm_004282.4的序列。bag2蛋白包含与seq id no:69的氨基酸序列具有生物等效活性的变体，尽管它们的氨基酸序列与seq id no:69的氨基酸序列不匹配。bag2多肽可包含与seq id no:69的序列具有至少60％，例如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列。bag2蛋白可以是具有除了至少一个氨基
酸残基、至少两个氨基酸残基、至少三个氨基酸残基、至少四个氨基酸残基、至少五个氨基酸残基、至少六个氨基酸残基或至少七个氨基酸残基之外与seq id no:69相同的序列的多肽。在本说明书中，“多肽”可与“蛋白质”互换使用。
13.抗体是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白。抗体是指特异性地结合至bag2多肽或其片段的多肽或多肽组合。抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体或重组抗体，如scfv片段、双抗体、单链抗体等，并且包括所有免疫球蛋白抗体。抗体可包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式的抗体，并且还可包括其抗体分子的这样的功能片段，所述功能片段由于包含特异性抗原结合位点(即结合结构域)而保留抗原结合功能，尽管不存在具有两条轻链和两条重链的完整形式的完整抗体的结构。
14.所述抗原结合片段是免疫球蛋白的整个结构的片段，并且是指所述多肽的包含能够与抗原结合的部分的部分。例如，抗原结合片段可以是scfv、(scfv)2、fv、fab、fab'、fv f(ab')2或其组合。
15.存在五种重链γ、δ、α、μ和ε，并且重链可决定抗体的类型。α和γ各自包括450个氨基酸，并且μ和ε各自包含550个氨基酸。重链具有两个区域，即可变区和恒定区。
16.存在两种轻链κ和λ，并且可包括约211个氨基酸至约217个氨基酸。轻链可具有恒定区和可变区。
17.所述抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:33的氨基酸序列组成的互补决定区(vh-cdr)1、由seq id no:39的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:45的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:51的氨基酸序列组成的互补决定区(vl-cdr)1、由seq id no:57的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:63的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；
18.重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:34的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:40的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:46的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:52的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:58的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:64的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；
19.重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:35的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:41的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:47的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:53的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:59的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:65的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；
20.重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:36的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:42的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:48的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:54的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:60的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:66的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；
21.重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:37的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:43的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:49的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:55的氨基酸序列组成的vl-cdr1、
由seq id no:61的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:67的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；以及
22.重链可变区(所述重链可变区包含由seq id no:38的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:44的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:50的氨基酸序列组成的vh-cdr3)，和轻链可变区(所述轻链可变区包含由seq id no:56的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:62的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:68的氨基酸序列组成的vl-cdr3)；或它们的组合。
23.seq id no:39中的第6个和第7个xaa可以是甘氨酸(gly)或丙氨酸(ala)。seq id no:35中的第二个xaa可以是酪氨酸(tyr)或组氨酸(his)。seq id no:41中的第8个xaa可以是丝氨酸(ser)或苏氨酸(thr)。seq id no:47中的第12个xaa可以是酪氨酸(tyr)或组氨酸(his)。seq id no:53中的第三个xaa可以是甲硫氨酸(met)或异亮氨酸(lie)。seq id no:59中的第二个xaa可以是ala或ser。
24.所述抗体或其抗原结合片段可以是包含以下的抗体或其抗原结合片段：重链可变区，所述重链可变区包含由seq id no:33的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:39的氨基酸序列组成且其中第6个和第7个xaa是gly的vh-cdr2和由seq id no:45的氨基酸序列组成的vh-cdr3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含由seq id no:51的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:57的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:63的氨基酸序列组成的vl-cdr3；或
25.包含以下的抗体或其抗原结合片段：重链可变区，所述重链可变区包含由seq id no:38的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:44的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:50的氨基酸序列组成的vh-cdr3；和轻链可变区，所述轻链可变区包含由seq id no:56的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:62的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:68的氨基酸序列组成的vl-cdr3。
26.所述抗体或其抗原结合片段可以是包含以下的抗体或其抗原结合片段：重链可变区，所述重链可变区包含由seq id no:35的氨基酸序列组成且其中第2个xaa是tyr的的vh-cdr1、由seq id no:41的氨基酸序列组成且其中第8个xaa是ser的vh-cdr2和由seq id no:47的氨基酸序列组成且其中第12个xaa是his的vh-cdr3；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含由seq id no:53的氨基酸序列组成且其中第3个xaa是met的vl-cdr1、由seq id no:59的氨基酸序列组成且其中第2个xaa是ala的vl-cdr2和由seq id no:65的氨基酸序列组成的vl-cdr3；或包含以下的抗体或其抗原结合片段：重链可变区，所述重链可变区包含由seq id no:37的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:43的氨基酸序列组成的vh-cdr2和由seq id no:49的氨基酸序列组成的vh-cdr3；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含由seq id no:55的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:61的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:67的氨基酸序列组成的vl-cdr3。
27.所述抗体或其抗原结合片段可以是包含以下的抗体或其抗原结合片段：重链可变区，所述重链可变区包含由seq id no:33的氨基酸序列组成的vh-cdr1、由seq id no:39的氨基酸序列组成且其中第6个xaa和第7个xaa分别是ala和gly的vh-cdr2和由seq id no:45的氨基酸序列组成的vh-cdr3；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含由seq id no:51的氨基酸序列组成的vl-cdr1、由seq id no:57的氨基酸序列组成的vl-cdr2和由seq id no:63
137448p、kctc 137458p和kctc 137468p保藏的杂交瘤细胞的杂交瘤细胞产生。
35.所述杂交瘤细胞是指通过两种细胞的人工融合而产生的具有致瘤性的杂交细胞，并且一般来说，可用于通过使从免疫受试者分离的b细胞和浆细胞瘤细胞融合来连续产生抗体。在本说明书中，所述杂交瘤细胞可被称为杂交瘤细胞或融合细胞。
36.所述癌症可以是实体癌或非实体癌。实体癌是指在诸如肝脏、肺、乳房和皮肤的器官中发生癌性肿瘤。非实体癌是在血液中发生的癌症，并且也被称为血液癌症。所述癌症可以是癌、肉瘤、源自造血细胞的癌症、生殖细胞肿瘤或胚细胞瘤。所述癌症可选自例如乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、结肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、膀胱癌、尿道癌、肝癌、肾癌、透明细胞肉瘤、黑素瘤、脑脊髓肿瘤、脑癌、胸腺、间皮瘤、食道癌、胆管癌、睾丸癌、生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、甲状旁腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(mos)、骨髓纤维化、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、霍奇金病、内分泌癌和肉瘤。
37.本发明人发现，当使用抗bag2抗体或其抗原结合片段，特别是通过bag2结构域筛选而选择的抗bag2抗体或其抗原结合片段的组合时，bag2的存在能被鉴定出来并且其在包括乳腺癌细胞系、胰腺癌细胞系、多形性成胶质细胞瘤细胞系、胃癌细胞系、卵巢癌细胞系或弥漫性大b细胞淋巴瘤细胞系在内的癌细胞系中的水平显著高于其在正常细胞中的水平。因此，通过使用所述组合物诊断的癌症可选自乳腺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、胃癌、卵巢癌和淋巴瘤。
38.本发明人发现，当使用抗bag2抗体或其抗原结合片段，并且特别是抗bag2抗体或其抗原结合片段的组合时，与正常受试者相比bag2在乳腺癌患者中过表达，并且当bag2水平高时，乳腺癌患者患转移性乳腺癌的可能性高。因此，用所述组合物诊断的乳腺癌可以是转移性乳腺癌。
39.在乳腺癌的分子亚型中，三阴性乳腺癌(tnbc)是具有非常强的侵袭性的类型，尽管进行了系统性治疗，但预后差且死亡率高。与管腔型或her2富集型相比，tnbc属于异质型。虽然大多数靶向乳腺癌疗法已显示出针对激素受体和her2阳性乳腺癌的积极结果，但由于tnbc患者缺乏包括雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)、人表皮生长因子受体(her2)在内的三种类型的靶受体，或其他明确定义的分子靶标，因此需要纳入有限的有效治疗选项，例如，聚adp-核糖聚合酶(parp)、表皮生长因子受体(egfr)、src酪氨酸激酶等。因此，为了防止不必要的治疗途径并且为了为tnbc患者选择有效的治疗，需要快速且准确地将tnbc患者与各种类型的乳腺癌患者区分开来。
40.本发明人发现，当使用抗bag2抗体或其抗原结合片段，并且特别是抗bag2抗体或其抗原结合片段的组合时，bag2在乳腺癌患者中过表达，并且当bag2水平高时，乳腺癌患者被诊断出tnbc型乳腺癌的概率高。因此，可通过使用所述方法诊断的乳腺癌可以是三阴性乳腺癌或tnbc型乳腺癌。
41.另一个方面提供了用于诊断癌症的试剂盒，所述试剂盒包括所述组合物。
42.所述试剂盒可进一步包括一种或多种其他组分组合物、溶液或装置，其适合于所述试剂盒所使用的分析方法，例如蛋白质印迹、elisa、放射免疫测定、放射免疫扩散、ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体固定法、fags、蛋白质芯片或它们的组合。例如，为了使用对它们中的每一种具有特异性的抗体检测样品中bag2的免疫复合物，所述试剂盒可进一步包括底物、合适的缓冲剂、用着色酶或荧光物质标
记的第二抗体，或着色底物。所述底物可以是硝酸纤维素膜、用聚乙烯树脂合成的96孔板、用聚苯乙烯树脂合成的96孔板、载玻片等；所述着色酶可以是过氧化物酶、碱性磷酸酶等；所述荧光物质可以是异硫氰酸荧光素(fitc)、罗丹明b-异硫氰酸酯(ritc)等；并且所述着色底物可以是2,2'-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(abts)、邻苯二胺(opd)、四甲基联苯胺(tmb)等。
43.另一个方面提供了提供用于诊断癌症的信息的方法。
44.所述方法是提供用于诊断癌症的信息的方法，其中检测受试者中bag2的存在以诊断受试者中存在的癌症。
45.所述方法可包括使从受试者分离的样品与特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体接触；以及测量所形成的bag2多肽或其片段与抗体的复合物。
46.所述方法可进一步包括确定受试者是否患有癌症。所述信息可以是关于在受试者中测量到的bag2水平是高于、等于还是低于在对照组中测量到的bag2水平的信息。
47.所述样品可以是从待诊断的受试者分离的生物样品。所述生物样品可以是细胞、器官、细胞裂解物、全血、血液、血清、血浆、淋巴液、细胞外液、体液、尿液、粪便、组织、骨髓、唾液、痰、脑脊液或它们的组合。
48.所述样品可以是血液、血清、血浆或它们的组合。本发明人已经证明bag2被分泌到细胞外并且bag2实际上是通过使用抗bag2抗体或其抗原结合片段在乳腺癌患者的血清中检测到的。因此，bag2可溶于血液、血清、血浆或它们的组合中。
49.当bag2存在于从受试者分离的样品中时，特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体可结合至所述样品中的bag2。可用例如荧光团、生色团或能够将底物转化为生色团的酶标记抗体，例如，以可视化样品中bag2的存在。
50.由于结合反应，样品中的bag2与特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体形成复合物，并且从所述复合物中，如果需要，可使用本领域技术人员已知的方法鉴定或测量出bag2的存在或其水平。所述复合物可通过蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定(elisa)、放射免疫测定(ria)、放射免疫扩散、ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、组织免疫染色、免疫沉淀测定、补体固定测定、facs、蛋白质芯片或它们的组合来测量。可执行该测量以测量样品中复合物的水平。
51.对照组可以是取自健康受试者的样品或取自乳腺癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、卵巢癌或弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)的样品。因此，对照组的bag2水平可以是取自健康受试者的样品，或者，如果需要，取自乳腺癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、卵巢癌或dlbcl患者的样品中的bag2浓度的平均值。
52.用作对照的样品可能与在同一解剖位置采集的用于诊断的样品类型相同。例如，当样品是从受试者的肘正中静脉采集的血液时，对照也可以是从对照组的腭中静脉采集的血液。
53.健康受试者是未患有任何急性或慢性疾病，至少癌症，例如乳腺癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、卵巢癌或dlbcl的受试者。
54.从健康受试者收集的样品中的bag2水平可能基本上不含bag2。因此，在对照组被设定为具有从健康受试者获得的值的情况下，当发现待诊断的受试者具有bag2，或其中的bag2水平显著高时，所述受试者可能疑似患有癌症。在另一方面，如本说明书实施例2的第3
节所示，在转移性乳腺癌患者的血液中，例如乳腺癌患者中的tnbc型患者的血液中，鉴定出bag2的存在的可能性高，并且bag2的平均值显著高(图7和8)。因此，在对照组被设定为从乳腺癌患者、非转移性乳腺癌患者或非tnbc型乳腺癌患者分离的样品的情况下，当确定bag2的水平在待诊断的受试者中显著高时，所述受试者可能疑似患有转移性乳腺癌或tnbc型乳腺癌。
55.因此，在一个方面，本发明涉及一种用于检测个体中癌症的存在的方法，所述方法包括使从所述个体分离的生物样品与特异性地结合至bag2多肽或其片段的抗体或其抗原结合片段接触；以及测量所形成的所述bag2多肽或其片段与所述抗体或其抗原结合片段的复合物，其中如果所述样品中测量到的bag2高于阴性对照组中测量到的bag2水平，则检测到癌症的存在。
附图说明
56.本专利或申请文件含有至少一幅彩色绘制的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公布的副本将在请求并支付必要费用后由专利局提供。
57.本发明将从本文以下所给出的具体实施方式和附图得到更充分的理解，附图仅是说明性的，并且因此不限制本发明，在附图中：
58.图1示出从10个小鼠杂交瘤细胞产生的抗bag2抗体的蛋白质印迹的结果；
59.图2a和2b示出抗bag2抗体的全长bag2多肽或其片段的蛋白质印迹的结果；
60.图3示出与相应的抗bag2抗体反应的bag2结构域；
61.图4示出抗bag2抗体的可能的90种组合中bag2蛋白的标准曲线；
62.图5示出所选的14种抗体组合的关于bag2蛋白的特异性结合力的图；
63.图6示出使用2a11-3f12的抗体组合和9b12-3g8的抗体组合观察到的各种癌细胞系中bag2表达模式的差异；
64.图7示出使用2a11-3f12的抗体组合和9b12-3g8的抗体组合观察到的管腔型和tnbc型乳腺癌患者的血清中bag2蛋白表达的显著差异；
65.图8示出使用8c4-3g8的抗体组合和10h7-3g8的抗体组合观察到的管腔型和tnbc型乳腺癌患者的血清中bag2蛋白表达的显著差异；并且
66.图9a至9d示出四种抗体组合的接受者操作特征曲线(roc)值和曲线下面积(auc)值。
具体实施方式
67.以下实施例是为了说明本发明而提供的，而不是以限制方式提供。
68.实施例
69.实施例1:抗bag2抗体的选择、测序和抗原-抗体反应
70.1.靶向bag2的单克隆抗体的选择及其氨基酸序列分析
71.本发明人选择了靶向bag2的抗体，分析了它们的氨基酸序列，并确定了所述抗体中的每一种的互补决定区(cdr)。
72.详细地，将由seq id no:70的核苷酸序列组成的编码由seq id no:69的氨基酸序列组成的人bag2蛋白的基因克隆到pcaggs质粒中并进行线性化，然后通过施加电击将线性
化的构建体接种到五只6周龄雌性balb/c小鼠的肌肉中。所述构建体以三周的间隔肌肉内接种3次，并由100ug在100ul pbs中的dna组成。此时，对照组的质粒也以同样的方式处理。为了产生治疗性和诊断性抗体，执行了比基于蛋白质的抗原注射更有效的基于dna疫苗的免疫策略。从小鼠的眼底腔静脉或尾静脉采集血液，并且通过显示出血清抗体效价的酶免疫测定检查血液，并在最后一次免疫3天后，从表现出足够抗体效价的小鼠中提取脾脏。从脾脏中分离出b淋巴细胞，然后使其与用分离的b淋巴细胞培养的骨髓瘤细胞，即atcc的sp2/0-ag14细胞系融合，从而获得融合细胞。在将融合细胞在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的hat培养基中进行培养之后，通过选择大约130个克隆来获得仅与骨髓瘤和b淋巴细胞融合的杂交瘤细胞。在通过免疫印迹选择过程获得的杂交瘤细胞中，获得了10个产生特异性地结合至人bag2蛋白的抗体的杂交瘤细胞。
73.从5x106个杂交瘤细胞产生抗bag2抗体的总rna，并且根据制造商的说明书通过使用smart race cdna扩增试剂盒(clontech)由100ng总rna产生5'-race-cdna。通过pcr扩增重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)编码区，并且将扩增的基因插入到pgem-t载体(promega，usa)中，对该基因进行克隆，并且通过使用自动基因分析仪(abi prism 310,applied biosystem co.)分析该基因的核苷酸序列。通过与先前报告的核苷酸序列进行比较来鉴定所分析基因的核苷酸序列，并且人工翻译所鉴定的核苷酸序列以用于确定互补决定区vh-cdr1、-cdr2和-cdr3以及vl-cdr1、-cdr2和-cdr3的序列。确定互补决定区的序列是使用kabat的数据库(http://www.bioinf.org.uk/abs/)执行的。
74.结果，从杂交瘤细胞中获得了10种特异性地结合至bag2的抗bag2抗体。10种抗bag2抗体是2a11、4c2、8c4、3b5、9b3、9b12、3b10、10h7、3gb和3f12抗体。此外，确定了如表1至表3所示的重链可变区、轻链可变区及其互补决定区的氨基酸序列和编码所述抗体的基因的核苷酸序列。
75.2a11、4c2和8c4抗体包含由seq id no:21的氨基酸序列组成的重链可变区和由seq id no:27的氨基酸序列组成的轻链可变区。在2a11抗体中，seq id no:21的第56和57个xaa各自是gly，并且seq id no:27的第53个xaa是lie。在4c2抗体中，seq id no:21的第56个xaa和第57个xaa分别是gly和ala，并且seq id no:27的第53个xaa是phe。在8c4抗体中，seq id no:21的第56个xaa和第57个xaa分别是ala和gly，并且seq id no:27的第53个xaa是phe。
76.2a11、4c2和8c4抗体的vh-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seq id no:33、39和45的氨基酸序列组成，并且vl-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seq id no:51、57和63的氨基酸序列组成。在2a11抗体中，seq id no:21的第56个和第57个xaa各自是gly。关于4c2抗体，在seq id no:21中，第56个xaa是gly，并且第57个xaa是ala。关于8c4抗体，在seq id no:21中，第56个xaa是ala，并且第57个xaa是gly。
77.9b3、9b12和3b10抗体包含由seq id no:23的氨基酸序列组成的重链可变区和由seq id no:29的氨基酸序列组成的轻链可变区。关于9b3抗体，在seq id no:23中，第1个xaa是glu，第7个xaa是ser，第12个xaa是val，第27个xaa是tyr，第58个xaa是ser，第61个xaa是asn，第74个xaa是lys，第83个xaa是phe，第92个xaa是ala，并且第108个xaa是tyr。关于9b3抗体，在seq id no:29中，第23个xaa是lie，第45个xaa是ala，第73个xaa是glu，并且第100个xaa是lie。关于9b12抗体，在seq id no:23中，第1个xaa是gin，第7个xaa是ser，第12
个xaa是val，第27个xaa是tyr，第58个xaa是ser，第61个xaa是asn，第74个xaa是arg，第83个xaa是phe，第92个xaa是gly，并且第108个xaa是his。关于9b12抗体，在seq id no:29中，第23个xaa是met，第45个xaa是ala，第73个xaa是glu，并且第100个xaa是met。关于3b10抗体，在seq id no:23中，第1个xaa是gin，第7个xaa是pro，第12个xaa是ala，第27个xaa是his，第58个xaa是thr，第61个xaa是ser，第74个xaa是arg，第83个xaa是leu，第92个xaa是gly，并且第108个xaa是his。关于3b10抗体，在seq id no:29中，第23个xaa是met，第45个xaa是ser，第73个xaa是asp，并且第100个xaa是lie。
78.关于9b3、9b12和3b10抗体，vh-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seq id no:35、41和47的氨基酸序列组成，并且vl-cdr1、-cdr2和-cdr3分别由seq id no:53、59和65的氨基酸序列组成。关于9b3抗体，seq id no:35的第2个xaa是tyr，seq id no:41的第8个xaa是ser，seq id no:47的第12个xaa是tyr，seq id no:53的第3个xaa是lie，并且seq id no:59的第2个xaa是ala。关于9b12抗体，seq id no:35的第2个xaa是tyr，seq id no:41的第8个xaa是ser，seq id no:47的第12个xaa是his，seq id no:53的第3个xaa是met，并且seq id no:59的第2个xaa是ala。关于3b10抗体，seq id no:35的第2个xaa是his，seq id no:41的第8个xaa是thr，seq id no:47的第12个xaa是his，seq id no:53的第3个xaa是met，并且seq id no:59的第2个xaa是ser。
79.表1
80.抗体名称vh基因的核苷酸序列vl基因的核苷酸序列2a11seq id no:1seq id no:114c2seq id no:2seq id no:128c4seq id no:3seq id no:133b5seq id no:4seq id no:149b3seq id no:5seq id no:159b12seq id no:6seq id no:163b10seq id no:7seq id no:1710h7seq id no:8seq id no:183g8seq id no:9seq id no:193f12seq id no:10seq id no:20
81.表2
82.抗体名称vh区的氨基酸序列vl区的氨基酸序列2a11seq id no:21seq id no:274c2seq id no:21seq id no:278c4seq id no:21seq id no:273b5seq id no:22seq id no:289b3seq id no:23seq id no:299b12seq id no:23seq id no:293b10seq id no:23seq id no:2910h7seq id no:24seq id no:303g8seq id no:25seq id no:31
3f12seq id no:26seq id no:32
83.表3
[0084][0085]
2.抗bag2抗体在乳腺癌细胞中的抗原-抗体应答的鉴定
[0086]
图1示出从10个小鼠杂交瘤细胞产生的抗bag2抗体的免疫印迹的结果。具体而言，将人乳腺癌细胞mda-mb-231细胞在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(welgene)培养基中在37℃的温度下培养。从孔中收获细胞并用pbs洗涤，并且将细胞溶解在含有1％brij 97、5mm edta、0.02m hepes ph 7.3、0.15m nacl、1mm pmsf、0.5mm naf、10μg/rni抑肽酶和0.2mm原钒酸钠的裂解缓冲液中。在冰上孵育15分钟后，通过离心从细胞中除去细胞核并收集上清液。向适量的上清液中添加由20％甘油、4.6％sos、0.125m tris(ph 6.8)、0.1％溴酚蓝组成的2x样品缓冲液。在标准条件下，通过使用mini-protean ii系统(bio-rad hercules，ca)在12％凝胶上对10ug蛋白质样品进行sos-page分析。对于免疫印迹，将蛋白质转移至millipore(一种pvdf膜)。使由在tbs中的0.1％tween 20和5％牛血清白蛋白(bsa)组成的封闭溶液反应1小时。随后，将从杂交瘤细胞培养物提取的抗bag2抗体的1/2000稀释液用作第一抗体，并且将用作第二抗体的山羊抗小鼠hrp缀合物(dako)稀释至1/5000。使用egl试剂(amersham pharmacia biotech)作为底物在黑暗中进行胶片感光。将光敏条带与标准分子标记物进行比较，以鉴定对应于bag2的大小的条带。
[0087]
结果，如图1所示，与用作阳性对照的市售多克隆抗bag2抗体ab58682(abcam)相比，抗体2a11、3b5、3b10、3f12、3gb、4c2、8c4、9b3、9b12和10h7表现出靶向bag2的抗原-抗体反应。
[0088]
接下来，为了对在上文第1节细胞中鉴定出的十种抗体所针对的bag2抗原进行结构域作图，将其中引入有分子量为约26kda的gst-空载体(pcdna3.1 /gst载体，novopro bioscience inc.china)的细胞用作阴性对照。将gst-bag完整载体、gst-bag f1载体、gst-bag f2载体、gst-bag f3载体和gst-bag f4载体(各自包含编码人bag2蛋白的多核苷酸和编码bag2蛋白的片段的多核苷酸)引入到细胞中，并且培养其中引入有所述载体的细胞以表达基因，然后获得细胞裂解物。针对细胞裂解物，使用10种抗体中的每一种进行免疫印迹。编码人bag2蛋白的多核苷酸具有seq id no:70的核苷酸序列。gst-bag f1、-bag f2、-bag f3和-bag f4载体分别由seq id no:71至74的核苷酸序列组成。
[0089]
图2a和2b示出抗bag2抗体的全长bag2多肽或其片段的免疫印迹的结果。在图2中，a示出载体和bag2蛋白及其片段的示意图，并且b示出免疫印迹的结果。详细地，如下那样执行免疫印迹：通过脂质转染胺(lipofectamine)转染(thermo fisher scientific,inc.,waltham,ma,usa)方法将所述载体中的每一种引入到hek293t细胞中，并且将所得转化细胞在37℃下在含有10％fbs、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dmem(welgene)培养基中培养30小时，然后分离细胞。使用与结合图1所述的方法相同的方法使分离的细胞破碎并在12％凝胶上对该细胞进行sos-page分析。对于免疫印迹，在与如结合图1描述的封闭溶液相同的封闭溶液反应1小时后，将浓度为2mg/ml的10种纯化的抗bag2抗体中的每一种以1/10000稀释的稀释液用作第一抗体并使其与细胞结合。用作第二抗体的山羊抗小鼠hrp缀合物以1/5000稀释浓度使用，并且使用egl试剂(amersham pharmacia biotech)作为底物在黑暗中进行胶片感光。表达标准分子标记物大小以确认bag2的大小。
[0090]
结果，如图2所示，每种抗bag2抗体与全长bag2多肽或其片段差异地结合。特别地，对于10种抗bag2抗体中的每一种，通常在gst-bag完整载体引入的细胞裂解产物中约50kda的位置处检测到信号。这一结果表明所有这些抗体都可与全长bag2多肽结合。最后，鉴定出了每种抗bag2抗体与其反应的bag2结构域区域。
[0091]
图3示出与相应的抗bag2抗体反应的bag2结构域。如图3所示，9b3、9b12、3b10和10h7抗体结合至bag2蛋白的n末端，2a11、3b5、4c2和8c4抗体结合至bag2蛋白的中间区域，并且3f12和3gb抗体结合至bag2蛋白的c末端。n末端通常包括21-60个氨基酸的卷曲螺旋区域，并且中间区域结合至109-189个氨基酸的bnb区域的一部分。因此，通过使用一组结合至不同位点的抗体，可以高灵敏度和特异性检测样品中存在的bag2蛋白或其片段。
[0092]
实施例2:抗bag2抗体组合的筛选和癌症诊断功效的确认
[0093]
1.筛选可用于癌症诊断的抗bag2抗体的组合
[0094]
图4示出抗bag2抗体的可能的90种组合中bag2蛋白的标准曲线。结果，如图4所示，在抗bag2抗体的可能组合中，选择了显示出高斜率的标准曲线的14种抗体组合，即2a11-3f12、10h7-3g8、9b12-3g8、10h7-3f12、9b8-3g8、3g8-3f12、3b5-3f12、3g8-4c2、3f12-3g8、3b5-3g8、3b5-4c2、3g8-8c4和9b3-3f12。
[0095]
图5示出所选的14种抗体组合的关于bag2蛋白的特异性结合力的图。详细地，根据制造商的说明书，通过使用lipofectamine2000(lnvitrogen)将myc-tag bag2表达载体或myc-tag空载体各自转导到人乳腺癌细胞系mda-mb-231中。使用14种抗体组合，测定了从其中引入有myc-tag空载体的对照细胞和其中引入有myc-tag bag2表达载体的过表达bag2蛋白的细胞的30ug裂解物分泌的bag2蛋白的相对量。对照细胞用ev标记，bag2过表达细胞用
oe标记。即，通过确认bag2过表达细胞和对照细胞的分泌的bag2蛋白的相对量，有可能确定抗体组合的关于bag2蛋白的特异性结合能力。
[0096]
结果，如图5中所示，选择了对bag2蛋白具有高特异性结合能力的四种抗体组合，即2a11-3f12、9b12-3g8、8c4-3g8和10h7-3f12。
[0097]
2.鉴定选定的抗bag2抗体组合在诊断各种癌症中的功效
[0098]
为了确认章节1中选择的抗体组合的癌症诊断功效，确认了所述抗体组合与bag2的抗原-抗体反应。详细地，获取从人293t细胞产生和纯化的具有针对n末端的6个组氨酸附接物的人bag2蛋白作为抗原。
[0099]
使用2a11-3f12和9b12-3g8抗体组合中的每一种执行夹心酶联免疫吸附测定(夹心elisa)。
[0100]
详细地，通过以下过程执行夹心elisa。使抗体3f12和3g8中的每一种以1mg的量与27ul的10mm nhs-生物素(琥珀酰亚胺基生物素，thermo scientific，目录号21435)反应以制备被生物素结合的检测抗体。使用elisa板包被缓冲液(r&d system，dy006)将作为捕获抗体的抗体2a11、9b12、8c4和10h7中的每一种稀释至3ug/ml的浓度，并以100ul的量铺展在96孔板的每孔中，然后在4℃的温度下包被过夜。将经抗体包被的板在室温下用1％牛血清白蛋白(bsa)缓冲液(r&d system，dy995)封闭1小时。使用1％bsa缓冲液以100ng/ml的浓度制备在人来源的细胞系hek293t中产生并纯化的人his标记bag2重组蛋白(ybiologics，korea)作为bag2标准材料，然后将其4倍稀释以制备0.02、0.097、0.31、1.56、6.25和25ng/ml的标准溶液。对于血液样品，从14名健康人、20名被诊断患有管腔型乳腺癌的患者和38名被诊断患有tnbc型乳腺癌的患者中的每一者采集8ml或更多的血液，然后通过轻轻振荡混合，并在室温下静置20-30分钟。然后，将血液以2,500rpm离心10分钟。使用1％bsa缓冲液将储存在4℃以下的血清稀释1/2倍。将0、0.02、0.097、0.39、1.56、6.25、25和100ng/ml的bag2标准溶液和100ul的1/2倍稀释的患者样品分配到除去了封闭溶液的板的每个孔中，并在室温下反应1小时，然后用洗涤缓冲液(r&d system，wa126)洗涤。将100ul的通过使用1％bsa缓冲液1:50000稀释的链霉亲和素-hrp(pierce，21130)分配到每个孔中，并在室温下反应30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤。将100ul的3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb,r&d system,dy999)分配到每个孔中，在母牛中在室温下反应15分钟，然后向其添加终止溶液以终止反应。从通过测量反应溶液在450nm处的吸光度获得的抗体的标准曲线计算患者样品中bag2蛋白的浓度。
[0101]
图6示出通过使用抗bag2抗体组合观察到的包括乳腺癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、卵巢癌和弥漫性巨b细胞淋巴瘤在内的癌细胞系中bag2表达模式的差异。图6a示出2a11-3f12抗体组合的夹心elisa的结果，并且图6b示出9b12-3g8抗体组合的夹心elisa的结果。
[0102]
如图6a和6b所示，当使用2a11-3f12和9b12-3g8抗体组合时，bag蛋白在各种癌细胞系中以高水平表达，所述癌细胞系包括乳腺癌细胞系mda-mb-231和hs578t、胰腺癌细胞系snu2564和panc1、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞系u251mg和t98g、胃癌细胞系snu1和snu484、卵巢癌细胞系skov3和a2780以及弥漫性巨b细胞淋巴瘤(dlbcl)细胞系su-dhl4和su-dhl6。相比之下，正常细胞系t47d、snu2469、a172、snu620、ovcar3和u2932中的bag2蛋白根本不表达或表达很少。换言之，与正常细胞相比，通过使用2a11-3f12和9b12-3g8抗体组
合证实bag2蛋白在包括乳腺癌、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、卵巢癌和弥漫性巨b细胞淋巴瘤的癌细胞中显著高表达。
[0103]
因此，当使用上述抗体组合时，与正常细胞相比，通过鉴定bag2蛋白的表达模式是否与癌细胞中显示的bag2蛋白的表达模式相似，可有效地诊断癌症。
[0104]
3.鉴定选定的抗bag2抗体组合在诊断乳腺癌中的功效
[0105]
通过使用与章节2中描述的相同的夹心elisa方法，证实了管腔型和tnbc型乳腺癌患者与正常受试者之间血清中bag2蛋白的表达模式的差异。详细地，收集健康志愿者(n＝14)、管腔型乳腺癌患者(n＝38)和tnbc型乳腺癌患者(n＝38)的血清，并且确认所获得的血清中bag2蛋白的表达模式。
[0106]
图7a和7b以及8a和8b示出通过使用抗bag2抗体组合鉴定的管腔型和tnbg型乳腺癌患者的血清中bag2蛋白表达的显著差异。图7a示出使用9b12-3g8抗体组合的情况，并且图7b示出使用2a11-3f12抗体组合的情况。图8a示出使用8g4-3g8抗体组合的情况，并且图8b示出使用10h7-3g8抗体组合的情况。
[0107]
如图7a和7b以及8a和8b所示，当使用9b12-3g8、2a11-3f12、8g4-3g8和1oh7-3f12抗体组合时，相应抗体组合的p值是p《0.0001、p＝0.0373、p＝0.0009、p＝0.0190，表明管腔型和tnbg型乳腺癌患者血清中bag2蛋白表达模式与正常受试者相比存在显著差异。因此，通过使用抗体组合观察bag2蛋白表达模式的显著差异，可有效地诊断乳腺癌。
[0108]
4.确认选定的抗bag2抗体组合在乳腺癌诊断中的有用性。
[0109]
为了确认使用四种抗体组合中的每一种的癌症诊断的灵敏度和特异性，通过使用rog曲线示出章节2的结果。
[0110]
图9a至9d示出相应抗体组合的接受者操作特征曲线(rog)和曲线下面积(aug)。图9a示出使用9b12-3g8抗体组合的情况，图9b示出使用8g4-3g8抗体组合的情况，图9c示出使用2a11-3f12抗体组合的情况，并且图9d示出使用10h7-3f12抗体组合的情况。
[0111]
如图9a至9d所示，当使用9b12-3g8、8g4-3g8、2a11-3f12和10h7-3g8抗体组合时，aug值是0.8596、0.8368、0.8554和0.6736。也就是说，在所有抗体组合的情况下，rog曲线中的aug值都在0.7左右，并且当使用9b12-3g8、8g4-3g8和2a11-3f12抗体组合时，测得aug值介于0.8与0.9之间。这些结果表明，每种抗体组合均可用来以高灵敏度和特异性来诊断乳腺癌。因此，该四种抗体组合可有效地用于诊断乳腺癌。
[0112]
根据一个方面的用于诊断癌症的包含抗bag2抗体或其抗原结合片段的组合物可提供用于诊断癌症的信息。
[0113]
根据根据另一个方面的提供用于诊断癌症的信息的方法，与收集组织的常规诊断方法不同，血液中bag2多肽的存在或水平可从血液中鉴定或测量，并且诊断有用性高。因此，各种组织机构可以使用所述方法来诊断癌症。
[0114]
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[0145]
本文中引用的所有参考文献以引用的方式整体并入。
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[0147]
本领域的技术人员将认识到或者仅仅使用常规实验就能够确定本文具体描述的本发明的具体实施方案的许多等效方案。