浅黄色基因座及其在烟草中的应用的制作方法

浅黄色基因座及其在烟草中的应用
1.相关申请的交叉引用和序列表的并入
2.本技术要求2019年10月10日提交的美国临时申请号62/913,313；和2019年10月10日提交的美国临时申请号62/913,414的优先权，这两者通过引用以其整体并入本文。包含在文件“p34737wo00_sl.txt”中的序列表是102,745字节(在ms-中测量)并于2020年10月09日创建，其以电子方式提交并通过引用整体并入。
技术领域
3.本公开涉及与烟草中浅黄色(py)基因座的鉴定和基因渗入相关的烟草植物、烟草种子、组合物和方法。还涉及在烟草的py基因座内产生新突变。
4.序列
5.表1中提供了核酸序列和氨基酸序列的列表。
6.表1：核酸序列和氨基酸序列
7.8.9.10.11.12.13.14.15.16.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.

背景技术：

28.在商业烟草(普通烟草(nicotiana tabacum))品种中，加速衰老有助于降低烟草特异性亚硝胺(tsna)的水平，否则其会在与传统品种相关的变黄过程中积累。两个基因座yb1和yb2参与控制白肋烟的衰老速度。第三个基因座，浅黄(py)基因座，已知也参与控制白肋烟、烤烟和深色烟品种的衰老速度。还已知py基因座的存在会降低tsna水平。
29.py基因座的位置和鉴定仍是未知的，需要一个耗时且主观的选择过程才能将py基因座整合到所需的烟草品种中。本公开提供了py基因座在烟草基因组中的位置。本公开还提供了促进py基因座加速育种到不同烟草品系中的标志物。此外，将py基因座整合到低生物碱烟草品系中会产生如通过usda等级指数测量的叶片质量的明显改善。


技术实现要素：

30.在一个方面中，本公开提供了一种产生表现出浅黄色(py)表型的烟草植物种群的方法，所述方法包括：(a)针对与py数量性状基因座(qtl)相关并在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的20厘摩(cm)内连锁的一个或多个标记基因座的存在，对烟草植物或烟草种子的第一种群进行基因分型；(b)选择在步骤(a)中进行基因分型的一个或多个烟草植物或烟草种子，其中所述一个或多个烟草植物或种子包含所述一个或多个标记基因座和所述py qtl；和(c)由步骤(b)中选择的所述一个或多个烟草植物或烟草种子产生包含所述py qtl和所述一个或多个标记基因座的烟草植物或烟草种子的第二种群，其中烟草植物或烟草种子的所述第二种群包含至少一个表现出所述浅黄色表型的烟草植物或种子。
31.在一个方面中，本公开提供了一种产生表现出浅黄色(py)表型的烟草植物种群的方法，所述方法包括：(a)针对与py数量性状基因座(qtl)相关并位于选自由seq id no:1-5
组成的组的基因座的20,000,000个核苷酸内的一个或多个标记基因座的存在，对烟草植物或烟草种子的第一种群进行基因分型；(b)选择在步骤(a)中进行基因分型的一个或多个烟草植物或烟草种子，其中所述个或多个烟草植物或种子包含所述一个或多个标记基因座和所述py qtl；和(c)由步骤(b)中选择的所述一个或多个烟草植物或烟草种子产生包含所述py qtl和所述一个或多个标记基因座的烟草植物或烟草种子的第二种群，其中烟草植物或烟草种子的所述第二种群包含至少一个表现出所述浅黄色表型的烟草植物或种子。
32.在一个方面中，本公开提供了一种基因渗入浅黄色(py)qtl的方法，所述方法包括：(a)将包含所述py数量性状基因座(qtl)的第一烟草植物与不同基因型的第二烟草植物杂交，以产生一个或多个后代植物或种子；和(b)选择在步骤(a)中产生的后代植物或种子，其包含选自以下的至少一种py相关的单核苷酸多态性(snp)：(i)在seq id no:1的核苷酸位置121处的鸟嘌呤；(ii)在seq id no:2的核苷酸位置121处的鸟嘌呤；(iii)在seq id no:3的核苷酸位置101处的鸟嘌呤；(iv)在seq id no:4的核苷酸位置121处的胸腺嘧啶；或(v)在seq id no:5的核苷酸位置121处的鸟嘌呤，其中所选择的后代植物或种子包含浅黄色表型。
33.在一个方面中，本公开提供了一种基因渗入浅黄色(py)性状的方法，所述方法包括：(a)将包含在选自由seq id no:16-21和48组成的组的序列中的非天然突变的第一烟草植物与不同基因型的第二烟草植物杂交，以产生一个或多个后代植物或种子；和(b)选择在步骤(a)中产生的包含所述非天然突变的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含所述py性状。
34.在一个方面中，本公开提供了一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述重组核酸构建体包含与编码非编码rna分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna编码与选自以下的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50，其中所述非编码rna分子抑制所述氨基酸序列的表达，并且其中所述修饰的烟草植物包含浅黄色表型。
附图说明
35.图1描述了使用定量rt-pcr测量的g58899(seq id no:24)的表达。显示了在打顶后的不同时间点，烟草品种ky171、浅黄色ky171(py_ky171)和ti1372在三个生物学重复中测量的g58899的平均rq(例如，倍数变化)。肌动蛋白被用作对照。
36.图2描述了使用定量rt-pcr测量的g61524(seq id no:27)的表达。显示了在打顶后的不同时间点，烟草品种ky171、浅黄色ky171(py_ky171)和ti1372在三个生物学重复中测量的g61524的平均rq(例如，倍数变化)。肌动蛋白被用作对照。
37.图3描述了使用定量rt-pcr测量的g58917(seq id no:25)的表达。显示了在打顶后的不同时间点，烟草品种ky171、浅黄色ky171(py_ky171)和ti1372在三个生物学重复中测量的g58917的平均rq(例如，倍数变化)。肌动蛋白被用作对照。
38.图4描述了过表达g58899(seq id no:54)的t0植物的rna表达。
39.图5描述了过表达g58899(seq id no:54)的四种植物品系的照片。黑色箭头指向浅黄色组织。
40.图6描述了表达rnai构建体(seq id no:52)的植物照片，该构建体被设计为抑制
g58899(seq id no:44)在组织培养中的表达。黑色箭头指向浅黄色组织。
41.图7描述了表达rnai构建体(seq id no:52)的t0植物的rna表达，该构建体被设计为抑制g58899(seq id no:44)的表达。
42.图8描述了表达rnai构建体(seq id no:52)的t0植物的照片，该构建体被设计为抑制g58899(seq id no:44)的表达。“ ”符号表示野生型样表达。符号“(-)”、
“‑”
、
“‑‑”
和
“‑‑‑”
是指通过半定量pcr测定的下调水平增加，其中在该组中(-)下调幅度最少，且
‑‑‑
下调幅度最大。wt指缺乏rnai构建体的窄叶madole对照植物。g58905指表达rnai构建体的植物，该rnai构建体被设计为抑制g58905(seq id no:26)。除非另有说明，否则在打顶后3周对植物进行成像。
43.图9描述了使用定量rt-pcr测量的g58899(seq id no:24)的表达。针对打顶前(ut)和打顶后24小时(24hr)的烟草品种窄叶madole(nlm；缺乏浅黄色性状)、ds1771(由nlm与ti1327杂交产生的f2种群)、野生型(wt；无浅黄色表型)、针对浅黄色性状的ds1771杂合子(ht)、针对浅黄色性状的ds1771纯合子(hm)和ti1372(浅黄色性状的来源)显示了平均rq。
44.图10描述了使用定量rt-pcr测量的g58917(seq id no:25)的表达。针对打顶前(ut)和打顶后24小时(24hr)的烟草品种窄叶madole(nlm；缺乏浅黄色性状)、ds1771(由nlm与ti1327杂交产生的f2种群)、野生型(wt；无浅黄色表型)、针对浅黄色性状的ds1771杂合子(ht)、针对浅黄色性状的ds1771纯合子(hm)和ti1372(浅黄色性状的来源)显示了平均rq。
45.图11描述了使用定量rt-pcr测量的g61524(seq id no:27)的表达。针对打顶前(ut)和打顶后24小时(24hr)的烟草品种窄叶madole(nlm；缺乏浅黄色性状)、ds1771(由nlm与ti1327杂交产生的f2种群)、野生型(wt；无浅黄色表型)、针对浅黄色性状的ds1771杂合子(ht)、针对浅黄色性状的ds1771纯合子(hm)和ti1372(浅黄色性状的来源)显示了平均rq。
46.图12描述了g58899氨基酸序列(seq id no:30)与拟南芥氨基酸序列bcm1(seq id no:55)和bcm2(seq id no:56)的比对。
47.图13描述了来自烟草品种窄叶madole(nlm；seq id no:46)、tn90(seq id no:30)和k326(seq id no:57)的g58899氨基酸序列的比对。图13还公开了g58899共有序列，如seq id no:58所示。
48.图14包括图14a、图14b和图14c。图14a描述了g58917_v2(seq id no:25)的相对定量(rq)。图14b描述了g61524(seq id no:27)的rq。图14c描述了g58899(seq id no:24)的rq。对于图14a、图14b和图14c的每一个，对烟草品系k326、浅黄(py)k326、ky171lc、py ky 171lc、tn90lc和py tn90lc进行采样。在打顶前(“未打顶”)和打顶后24小时(“24hr”)采取样品。
具体实施方案
49.除非另有定义，否则使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在以单数形式提供术语的情况下，发明人还考虑了由该术语的复数形式描述的本公开的方面。如果在通过引用并入的参考文献中使用的术语和定义存
在差异，则本技术中使用的术语应具有本文给出的定义。使用的其他技术术语在使用其的领域中具有其普通含义，如各种特定领域的词典所示，例如，“the americanscience dictionary”(美国传统辞典编辑，2011,houghton mifflin harcourt,boston and new york)，“mcgraw-hill dictionary of scientific and technical terms”(第6版，2002，mcgraw-hill,new york)或“oxford dictionary of biology”(第6版，2008，oxford university press,oxford and new york)。
50.本文引用的任何参考文献，包括，例如，所有专利、公开的专利申请和非专利出版物，均通过引用整体并入本文。
51.当呈现一组备选方案时，具体设想构成该备选方案分组成员的任何和所有组合。例如，如果从由a、b、c和d组成的组中选择一个项目，则发明人具体地单独设想每个备选方案(例如，单独的a、单独的b等)，以及诸如a、b和d；a和c；b和c等的组合。术语“和/或”在两个或多个项目列表中使用时，是指所列项目中的任何一个本身或者与任何一个或多个其他所列项目的组合。例如，“a和/或b”的表述旨在表示a和b中的一者或两者——即，单独的a、单独的b或者a和b的组合。表述“a、b和/或c”旨在表示单独的a、单独的b、单独的c、a和b的组合、a和c的组合、b和c的组合或者a、b和c的组合。
52.当在此提供一个数字范围时，将该范围理解为包括该范围的边缘以及该范围的定义边缘之间的任何数字。例如，“1至10之间”包括1至10之间的任何数字，以及数字1和数字10。
53.当使用术语“约”时，应理解为表示加减10％。例如，“约100”将包括从90至110。
54.如本文所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一个化合物”或“至少一个化合物”可以包括多个化合物，包括其混合物。
55.烟草植物中显性浅黄色(py)基因座的存在加速了叶片的衰老。加速衰老使更少的烟草特异性亚硝胺(tsna)在叶子中积累。从历史上看，将py基因座基因渗入不同烟草品系或品种中的唯一方法是对疑似携带py基因座的植物表型进行主观评分，将疑似携带者与不同烟草植物杂交，然后生长并筛选后代。然而，杂交可能需要在py相关表型出现之前进行。为解决这一问题，可以用乙烯利等化学物质处理单个叶子，以加速衰老。与等待衰老自然发生时相比，这使得在植物生命周期中更早地进行表型评分成为可能。这些要求使得基因渗入py基因座的过程既费时又费力。
56.当存在时，py基因座产生所谓的“浅黄色(py)表型”或“py性状”。与缺乏显性py基因座的对照植物相比，py表型加速了叶绿素的分解和/或叶片的成熟。py表型表现为叶片早期出现黄色，最终导致叶片完全变黄。变黄发生的时间早于其在缺乏py性状的相同遗传背景的对照烟草植物中出现的时间。通常，py性状的表型直到烟草植物被打顶后才会显现。
57.在一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前1天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前2天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前3天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一
个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前4天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前5天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前6天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前7天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前8天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前9天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前10天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前14天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前18天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。在另一个方面中，与缺乏py性状的相同品种的对照烟草植物相比，当在相同环境条件下生长时，包含py性状的烟草植物在打顶后至少提前21天表现出至少一片绿叶的叶子变黄。
58.在烟草中，随着茎的生长形成新叶。因此，最嫩的叶子是茎上最上面的叶子，而最老的叶子是茎上最下面的叶子。
59.在一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的1天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的2天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的3天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的4天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的5天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的6天内开始变黄。在另一个方面中，打顶后保留在包含py性状的烟草植物上的最嫩和最老的绿叶在烟草植物打顶后的7天内开始变黄。
60.本领域内可以理解的是，根据烟草品种，py表型可以略微不同的方式表现。py表型在深色烟草品种中最容易观察到，因为传统的深色烟草品种在成熟过程中不会变黄。通常，深色烟草品种的叶子在打顶后会继续膨胀、变厚并变得更脆，但叶子的颜色会保持深绿色。有时，叶子也会出现非绿色的老年斑。当收获传统深色烟草品种时，在打顶后大约5至7周，在叶子或茎秆中几乎没有观察到变黄。相反，当将py性状已基因渗入到深色烟草品种中时，植物将在打顶后两周内开始出现叶子变黄。植物将表现出所有叶子变黄，特别是在叶片中(中脉通常保持绿色)。植物也会出现黄色的茎。
61.在一个方面中，包含py性状的深色烟草植物在打顶后表现出至少一片绿叶变黄。
62.与深色烟草品种不同，传统白肋烟品种在成熟过程中会变黄。当白肋烟被打顶后，一些较低(更老)的叶子可能已经开始变黄。传统白肋烟在打顶后会从下到上持续变黄。然而，当白肋烟中存在py性状时，通常在打顶后一周内，植物会以更快的速度变黄，并且所有叶子同时开始变黄。
63.如本文所用，“变黄”指烟草叶或茎组织中的叶绿素损失，导致颜色变黄。
64.本公开首次确定了py基因座的染色体位置。本公开还提供了适于追踪烟草中的py基因座的标志物。
65.在一个方面中，本公开提供了一种产生表现出浅黄色(py)表型的烟草植物种群的方法，所述方法包括：(a)针对与py数量性状基因座(qtl)相关并在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的20厘摩(cm)内连锁的一个或多个标记基因座的存在，对烟草植物或烟草种子的第一种群进行基因分型；(b)选择在步骤(a)中进行基因分型的一个或多个烟草植物或烟草种子，其中所述一个或多个烟草植物或种子包含所述一个或多个标记基因座和所述py qtl；和(c)由步骤(b)中选择的所述一个或多个烟草植物或烟草种子产生包含所述py qtl和所述一个或多个标记基因座的烟草植物或烟草种子的第二种群，其中烟草植物或烟草种子的所述第二种群包含至少一个表现出所述py表型的烟草植物或种子。
66.在另一个方面中，本公开提供了一种产生表现出浅黄色(py)表型的烟草植物种群的方法，所述方法包括：(a)针对与py数量性状基因座(qtl)相关并在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的20,000,000个核苷酸内连锁的一个或多个标记基因座的存在，对烟草植物或烟草种子的第一种群进行基因分型；(b)选择在步骤(a)中进行基因分型的一个或多个烟草植物或烟草种子，其中所述一个或多个烟草植物或种子包含所述一个或多个标记基因座和所述py qtl；和(c)由步骤(b)中选择的所述一个或多个烟草植物或烟草种子产生包含所述py qtl和所述一个或多个标记基因座的烟草植物或烟草种子的第二种群，其中烟草植物或烟草种子的所述第二种群包含至少一个表现出所述py表型的烟草植物或种子。
67.标志物
68.如本文所用，短语“与
…
相关”或“连锁”指两个实体之间可识别和/或可测定的关系。例如，短语“与py性状相关”或“与py qtl相关”指性状、基因座、基因、等位基因、标志物、表型等或其表达，其存在或缺失会影响具有py性状或py qtl的植物或其目标部分的范围、程度和/或速率。同样地，当标志物与性状相关并且当标志物的存在指示所需性状或性状形式是否和/或在何种程度上将出现在包含所述标志物的植物/种质中时，则标志物与性状“相关”。类似地，当标志物与等位基因连锁并且当标志物的存在是等位基因是否存在与包含标志物的植物/种质中的指示时，则标志物与等位基因“相关”。例如，“与py性状相关的标志物”是指其存在或缺失可用于预测植物是否以及在何种程度上将显示py表型的标志物。
69.在一个方面中，py qtl位于烟草基因组15号染色体上的ssr标志物pt51549和pt55414之间。
70.如本文所用，“基因座”指染色体上的固定位置。在一个方面中，基因座包含基因。在另一个方面中，基因座包含标志物。基因座可以代表基因组区域中的单个核苷酸、几个核苷酸或大量核苷酸。如本文所用，“标志物”、“分子标志物”或“标记基因座”指足够独特以表征基因组上的特定基因座的核酸序列。任何可检测的多态性性状都可以用作标志物，只要
其是差异遗传的并表现出与目标表型性状的连锁不平衡。当一个性状被认为与给定标志物相联系时，应当理解的是，其序列影响性状的实际dna片段通常与标志物共分离。如果在性状的两侧都识别出标志物，则可以获得性状的更精确且更明确的定位。通过测量杂交后代中标志物的外观，可以通过相对简单的分子测试来检测性状的存在，而无需实际评估性状本身的外观，后者可能是困难且耗时的，因为对性状的实际评估需要植物生长到某一阶段和/或在性状可以表达的环境条件下。本领域内应当理解的是，标志物可以包含多于两个等位基因，并且多于一个等位基因可以与给定性状相关。
71.如本文所用，“等位基因”是指特定基因座处的替代核酸序列。等位基因的长度可以小到一个核苷酸碱基。例如，第一等位基因可以出现在一个染色体上，而第二等位基因可以出现在第二个同源染色体上，例如，如发生在杂合个体的不同染色体，或者群体中不同的纯合或杂合个体之间。
72.遗传连锁是指在有性生殖的减数分裂阶段dna基因座(例如，基因、标志物)一起遗传的趋势。物理上彼此靠近的基因座更有可能在遗传上互相“连锁”。连锁可以指遗传连锁或物理连锁。遗传连锁通常使用厘摩来测量，而物理连锁通常以核苷酸来测量。
73.如本文所用，“厘摩”(cm)是指染色体位置(也称为基因座或标志物)之间的距离，对于该距离，单代中干预染色体杂交的预期平均数为0.01。如果两个基因座之间的遗传距离大于50cm，则通常认为两个基因座在遗传上没有连锁。
74.在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的20cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的17.5cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的15cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的14cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的13cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的12cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的11cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的9cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的8cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的7cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的6cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的5cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的4cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的3cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的2cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.5cm内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.25cm内。
75.在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5
组成的组的基因座的0.05cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.1cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.5cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的5cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10cm至20cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至15cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至10cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至7.5cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至5cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至2.5cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.01cm至1cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.5cm至10cm之间内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.5cm至5cm之间内。
76.在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的75,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的50,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的40,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的30,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的25,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的20,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的17,500,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的15,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的12,500,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的9,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的8,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的7,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的6,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的5,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的4,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的3,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的2,000,000个核
苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的750,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的500,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的250,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的75,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的50,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的25,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的5,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的2,500个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的750个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的500个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的250个核苷酸内。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100个核苷酸内。
77.在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000,000个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000,000个核苷酸至100,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸
至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000,000个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000,000个核苷酸至50,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000,000个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000,000个核苷酸至20,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10,000个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。在一个方面中，一个或多个标记基因座在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1,000,000个核苷酸至10,000,000个核苷酸之间。
78.在一个方面中，基因座包含seq id no:1。在另一个方面中，基因座包含seq id no:2。在另一个方面中，基因座包含seq id no:3。在另一个方面中，基因座包含seq id no:4。在另一个方面中，基因座包含seq id no:5。
79.任何类型的多态性标记都被设想用于本文提供的方法和组合物。
80.在一个方面中，标记基因座选自由seq id no:1-5组成的组。在一个方面中，标记基因座包含seq id no:1。在一个方面中，标记基因座包含seq id no:2。在一个方面中，标记基因座包含seq id no:3。在一个方面中，标记基因座包含seq id no:4。在一个方面中，标记基因座包含seq id no:5。
81.在一个方面中，一个或多个标记基因座包含选自以下的单核苷酸多态性(snp)：(a)在seq id no:1的位置121处的鸟嘌呤；(b)在seq id no:2的位置121处的鸟嘌呤；(c)在seq id no:3的位置101处的鸟嘌呤；(d)在seq id no:4的位置121处的胸腺嘧啶；和(e)在seq id no:5的位置121处的鸟嘌呤。
82.在一个方面中，标记基因座包含在seq id no:1位置121处的鸟嘌呤。在另一个方面中，标记基因座包含在seq id no:2位置121处的鸟嘌呤。在另一个方面中，标记基因座包
含在seq id no:3位置101处的鸟嘌呤。在另一个方面中，标记基因座包含在seq id no:4位置121处的胸腺嘧啶。在另一个方面中，标记基因座包含在seq id no:5位置121处的鸟嘌呤。
83.在一个方面中，植物或种子对于snp是纯合子。在另一个方面中，植物或种子对于snp是杂合子。
84.在一个方面中，植物或种子在标记基因座处是纯合子。在另一个方面中，植物或种子在标记基因座处是杂合子。
85.在一个方面中，标记基因座包含一个或多个单核苷酸多态性标志物。在另一个方面中，标记基因座包含一个或多个插入缺失(indel)标志物。在另一个方面中，标记基因座包含一个或多个简单序列重复(ssr)标志物。在另一个方面中，标记基因座包含一个或多个限制性片段长度多态性(rflp)标志物。在另一个方面中，标记基因座包含一个或多个随机扩增多态性dna(rapd)标志物。在另一个方面中，标记基因座包含一个或多个扩增片段长度多态性(aflp)标志物。在一个方面中，一个或多个标记基因座选自以下：一个或多个snp标志物、一个或多个indel标志物、一个或多个ssr标志物、一个或多个rflp标志物、一个或多个rapd标志物和一个或多个aflp标志物。
86.可以理解的是，基因分型必须涉及通过使用分子测定检测dna序列并比较该序列与参考序列来确定单个植物或植物细胞的遗传组成。基因分型不同于目视表型分型，后者仅在对植物或植物细胞进行目视检查。在一个方面中，基因分型不包括植物或植物细胞的目视表型分型。
87.在一个方面中，基因分型包括检测一个或多个标记基因座。在另一个方面中，基因分型包括检测一个或多个等位基因或者一个或多个标记基因座。检测标记基因座或者标记基因座的特定等位基因的存在可以包括任何合适的方法或者本领域已知的技术或方法。检测标志物或者标志物的等位基因的非限制性示例包括凝胶电泳、dna测序、rna测序、southern印迹和微阵列技术。
88.在一个方面中，基因分型包括使用寡核苷酸探针。如本文所用，如本文所用，“寡核苷酸探针”是指与目标多核苷酸互补(尽管不一定完全互补)并通过与目标多核苷酸的至少一条链杂交形成双链体结构的寡核苷酸(合成的或天然存在的)。在一个方面中，寡核苷酸探针包含dna。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含rna。在另一个方面中，寡核苷酸探针是单链的。在另一个方面中，寡核苷酸探针是部分双链的。在一个方面中，寡核苷酸探针可以用作pcr引物。
89.通常，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至50个核苷酸之间的长度，但可以使用更长或更短的序列。在一个方面中，寡核苷酸探针包含15个核苷酸至40个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含15个核苷酸至35个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含15个核苷酸至30个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含20个核苷酸至40个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含20个核苷酸至35个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至100个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至75个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至50个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至40个核苷酸之间。在一个方面中，寡核苷酸探针包含10个核苷酸至30个核苷酸之间。
90.在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少18个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少19个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少20个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少21个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少22个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少23个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少24个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少25个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少26个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少27个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少28个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少29个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少30个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少31个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少32个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少33个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少34个核苷酸。在一个方面中，寡核苷酸探针包含至少35个核苷酸。
91.探针可以进一步包含可检测标记。可检测标记可以位于寡核苷酸探针的5’末端、3’末端或内部。可以将寡核苷酸探针设计为与特定标志物或标志物的特定等位基因杂交。可检测标记的非限制性示例包括生物素、荧光团(例如，绿色荧光蛋白、texasvic
tm
、jun
tm
、aby
tm
)和放射性同位素(例如，磷32、硫35、碘125)。
92.在一个方面中，寡核苷酸探针是taqman
tm
探针。taqman
tm
探针通常用于提高定量pcr的特异性。taqman
tm
探针依靠taq聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性在与互补靶序列杂交和基于荧光团的检测过程中切割双标记探针。与其他定量pcr方法一样，产生的荧光信号允许在pcr的指数阶段定量测量产物的积累；然而，taqman
tm
探针显著提高了检测的特异性。
93.在一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少80％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少85％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少90％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少95％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少96％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少97％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少98％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列至少99％同一性的核酸序列。在另一个方面中，寡核苷酸探针包含与选自由seq id no:34-42组成的组的核酸序列100％同一性的核酸序列。
94.在一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少80％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少85％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少90％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少91％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少92％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21
和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少93％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少94％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少95％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少96％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少97％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少98％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有至少99％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少18个连续核苷酸具有100％同一性。
95.在一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少80％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少85％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少90％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少91％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少92％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少93％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少94％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少95％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少96％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少97％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少98％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有至少99％同一性。在另一个方面中，寡核苷酸探针与选自由seq id no:16-21和48组成的组的核酸序列的至少21个连续核苷酸具有100％同一性。
96.在一个方面中，寡核苷酸探针与一个或多个标记基因座的多态性核苷酸位置邻近。如本文所用，“邻近”是指距寡核苷酸探针的最近端(3’或5’)和多态性核苷酸位置之间的0个核苷酸至50个核苷酸之间的距离。如本文所用，“多态性核苷酸位置”是指给定标记基因座的两个或更多个等位基因之间的差异(例如，插入、缺失、取代)。通过在等位基因序列之间进行配对比较，可以找到多态性核苷酸位置。例如，如果第一等位基因包含核苷酸序列atttg且第二等位基因包含核苷酸序列ttttg，则第一核苷酸将是“多态性核苷酸位置”。
97.在一个方面中，基因分型包括检测单倍型。如本文所用，“单倍型”指一组两个或更多个从单一亲本遗传的基因座。基因座可以包含基因、标志物或者基因和标志物的组合。通常，由单倍型描述的遗传基因座在物理上和遗传上是连锁的。单倍型也可以指位于单个基
因座内的snp组合。
98.在一个方面中，检测单倍型包括检测至少两种选自以下的单核苷酸多态性(snp)：在seq id no:1的核苷酸位置121处的鸟嘌呤、在seq id no:2的核苷酸位置121处的鸟嘌呤、在seq id no:3的核苷酸位置101处的鸟嘌呤、在seq id no:4的核苷酸位置121处的胸腺嘧啶以及在seq id no:5的核苷酸位置121处的鸟嘌呤。
99.基因渗入
100.在一个方面中，本公开提供了一种基因渗入浅黄色(py)数量性状基因座(qtl)的方法，所述方法包括：(a)将包含py qtl的第一烟草植物与不同基因型的第二烟草植物杂交，以产生一个或多个后代植物或种子；和(b)选择在步骤(a)中产生的后代植物或种子，其包含选自以下的至少一种py相关的单核苷酸多态性(snp)：(i)在seq id no:1的核苷酸位置121处的鸟嘌呤；(ii)在seq id no:2的核苷酸位置121处的鸟嘌呤；(iii)在seq id no:3的核苷酸位置101处的鸟嘌呤；(iv)在seq id no:4的核苷酸位置121处的胸腺嘧啶；和(v)在seq id no:5的核苷酸位置121处的鸟嘌呤，其中所选择的后代植物或种子包含py表型。
101.如本文所用，“基因渗入”指遗传基因座的所需等位基因从一种遗传背景(例如，基因型)传递到另一种遗传背景。
102.如本文所用，“py相关单核苷酸多态性”指与py qtl分离的多态性。
103.如本文所用，“基因型”指植物或细胞的遗传构成。来自不同烟草品系或品种的两种烟草植物被理解为具有不同基因型。或者，近交系植物通常包含相同基因型。然而，但不限于，如果py qtl已经基因渗入到单个tn 90植物中，则包含py qtl的单个tn 90植物将具有与缺乏py qtl的所有tn 90植物不同的基因型。
104.突变
105.在一个方面中，本公开提供了一种基因渗入浅黄色(py)性状的方法，所述方法包括：(a)将包含在选自由seq id no:16-21和48组成的组的序列中的非天然突变的第一烟草植物与不同基因型的第二烟草植物杂交，以产生一个或多个后代植物或种子；和(b)选择在步骤(a)中产生的包含所述非天然突变的后代植物或种子，其中所述后代植物或种子包含所述py性状。
106.在一个方面中，本公开提供了一种修饰的烟草植物或其部分，其包含在选自以下的核酸序列中的非天然突变：seq id no:16-21和48，其中所述修饰的烟草植物包含浅黄色表型，并且其中所述突变是与相同烟草品种的对照烟草植物比较。
107.在另一个方面中，本公开提供了一种修饰的烟草植物或其部分，其包含在编码选自以下的氨基酸序列的核酸序列中的非天然突变：seq id no:28-33、46、47和50，其中所述修饰的烟草植物包含浅黄色表型，并且其中所述突变是与相同烟草品种的对照烟草植物比较。
108.在一个方面中，植物或种子对于在选自以下的核酸序列中的非天然突变是纯合的：seq id no:16-21和48。在一个方面中，植物或种子对于在选自以下的核酸序列中的非天然突变是杂合的：seq id no:16-21和48。
109.在一个方面中，植物或种子对于在编码选自以下的氨基酸序列的核酸序列中的非天然突变是纯合的：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，植物或种子对于在编码选自以下的氨基酸序列的核酸序列中的非天然突变是杂合的：seq id no:28-33、46、47和
50。如本文所用，“突变”是指引入基因中以改变由该基因编码的产物的表达或活性的可遗传的基因修饰。此类修饰可以在基因的任何序列区域中，例如，在启动子、5’utr、外显子、内含子、3’utr或终止子区域中。在一个方面中，突变降低、抑制或消除基因产物的表达或活性。在另一个方面中，突变增加、提升、加强或增强基因产物的表达或活性。
110.在一个方面中，突变是“非天然的”或“非天然存在的”突变。如本文所用，“非天然的”或“非天然存在的”突变是指通过人为干预产生的非自发突变，并且不对应于没有人为干预产生的自发突变。人为干预的非限制性示例包括诱变(例如，化学诱变、电离辐射诱变)和靶向基因修饰(例如，基于crispr方法、基于talen方法、基于锌指方法)。非天然突变和非天然存在的突变不包括自然产生的自发突变(例如，通过植物种系中的异常dna复制)。
111.可以理解是，当鉴定突变时，参考dna序列应来自相同的烟草品种。例如，如果包含突变的修饰的烟草植物来自品种tn90，则内源性参考序列必须是内源性tn90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，k326)的同源序列。类似地，如果包含突变的修饰的烟草细胞是tn90细胞，则内源性参考序列必须是内源性tn90序列，而不是来自不同烟草品种(例如，k326)的烟草细胞的同源序列。
112.在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少75％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少80％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少85％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少90％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少95％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少96％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少97％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少98％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有至少99％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。在一个方面中，包含非天然突变的内源性核酸序列包含与选自以下的序列具有100％同一性的核酸序列：seq id no:16-21和48。
113.在一个方面中，本文提供的突变产生突变基因座的显性等位基因。显性等位基因是在同一基因座掩盖第二等位基因贡献的等位基因。显性等位基因可以是“显性负等位基因”或“显性正等位基因”。显性负等位基因或反效等位基因(antimorph)是与正常等位基因功能相反的等位基因。显性负等位基因通常不能正常发挥作用，并且直接抑制野生型蛋白的活性(例如，通过二聚化)或抑制野生型蛋白正常功能所需的第二种蛋白的活性(例如，通路的激活剂或下游组分)。例如，显性负等位基因消除或降低杂合或纯合状态的等位基因的正常功能。显性正等位基因可以增加正常基因功能(例如，超变体)或为基因提供新功能(例如，新变体)。当等位基因杂合个体中连锁表型的外显率低于等位基因纯合个体中观察到的外显率时，就会出现半显性等位基因。
114.在一个方面中，本文提供的突变产生突变基因座的显性负等位基因。在另一个方
面中，本文提供的突变产生突变基因座的显性正等位基因。
115.如本文所用，“诱导”突变是指通过人为干预在多核苷酸序列中产生突变。很多用于在烟草中诱导突变合适的方法是本领域已知的。此类方法的非限制性示例包括使用化学诱变剂、使用辐射和使用核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用选自以下的试剂：化学诱变剂、辐射、转座子、农杆菌和核酸酶。
116.在一个方面中，诱导突变包括使用化学诱变剂。在一个方面中，化学诱变剂包括甲磺酸乙酯(ems)。
117.在另一个方面中，诱导突变包括使用辐射。在一个方面中，辐射包括γ射线、x射线或电离辐射。在另一个方面中，辐射包括使用快中子。
118.在一个方面中，诱变包括使用转座子。在另一个方面中，诱变包括使用农杆菌。
119.在一个进一步的方面中，诱变包括使用核酸酶。在一个方面中，核酸酶选自以下：兆核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶、crispr/cas9核酸酶、crispr/cpf1核酸酶、crispr/casx核酸酶、crispr/casy核酸酶和csm1核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用crispr/cas9核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用crispr/cpf1核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用crispr/casx核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用crispr/casy核酸酶。在一个方面中，诱导突变包括使用csm1核酸酶。
120.几种突变类型是本领域已知的。在一个方面中，突变包括插入。“插入”指与内源性参考多核苷酸或氨基酸序列相比，分别向给定的多核苷酸或氨基酸序列添加一个或多个核苷酸或氨基酸。在另一个方面中，突变包括缺失。“缺失”指与内源性参考多核苷酸或氨基酸序列相比，分别去除给定多核苷酸或氨基酸序列的一个或多个核苷酸或氨基酸。在另一个方面中，突变包括取代。“取代”指与内源性参考多核苷酸或氨基酸序列相比，将一个或多个核苷酸或氨基酸分别替换为给定多核苷酸或氨基酸序列。在另一个方面中，突变包括倒位。“倒位”指当多核苷酸或氨基酸序列的片段被端对端颠倒时。在一个方面中，本文提供的突变包括选自以下的突变：插入、缺失、取代和倒位。
121.在一个方面中，非天然突变包含选自以下的突变：相对于选自seq id no:16-21和48的野生型核酸序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、重复和倒位。
122.在一个方面中，非天然突变包含选自以下的突变：相对于编码选自seq id no:28-33、46、47和50的氨基酸序列的野生型核酸序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、重复和倒位。
123.在一个方面中，非天然突变包括选自以下的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任何组合。如本文所用，“无义突变”是指通过核酸序列将提前终止密码子引入氨基酸序列的核酸序列突变。如本文所用，“错义突变”指导致核酸序列编码的氨基酸序列内的取代的核酸序列突变。如本文所用，“移码突变”指对核酸序列的插入或缺失，其移码以将核酸序列翻译成氨基酸序列。“剪接位点突变”指核酸序列中的突变，其导致内含子被保留用于蛋白翻译，或者，外显子被排除在蛋白翻译之外。剪接位点突变可导致无义、错义或移码突变。
124.当突变的信使rna(mrna)被翻译成蛋白或多肽时，基因编码区域的突变(例如，外显子突变)可导致截短的蛋白或多肽。在一个方面中，本公开提供了导致蛋白或多肽截短的突变。如本文所用，与内源性对照蛋白或多肽相比，“截短的”蛋白或多肽包含至少少一个氨
基酸。例如，如果内源性蛋白a包含100个氨基酸，则蛋白a的截短形式可以包含1至99个氨基酸。
125.不受任何科学理论的限制，导致蛋白或多肽截短的一种方式是通过在内源性基因的mrna转录物中引入提前终止密码子。在一个方面中，本公开提供了导致内源性基因的mrna转录物中提前终止密码子的突变。如本文所用，“终止密码子”指mrna转录物中的核苷酸三联体，其发出蛋白翻译终止的信号。“提前终止密码子”指定位于比内源性mrna转录物中的正常终止密码子位置更早(例如，在5’侧)的终止密码子。不受限制地，本领域已知几种终止密码子包括“uag”、“uaa”、“uga”、“tag”、“taa”和“tga”。
126.在一个方面中，本文提供的突变包括无效突变。如本文所用，“无效突变”指使由包含该突变的基因编码的蛋白完全丧失功能的突变，或者，使由基因组基因座编码的小rna完全丧失功能的突变。无效突变可导致缺乏mrna转录物产生、缺乏小rna转录物产生、缺乏蛋白功能或其组合。
127.本文提供的突变可以位于内源性基因的任何部分。在一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的外显子内。在另一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的内含子内。在一个进一步的方面中，本文提供的突变位于内源性基因的5’非翻译区(utr)内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的3’utr内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的启动子内。在又一个方面中，本文提供的突变位于内源性基因的终止子内。
128.可以通过本领域普通技术人员已知的任何方法来筛选和选择诱变的烟草植物。筛选和选择方法的示例包括但不限于southern分析、用于检测多核苷酸的pcr扩增、northern印迹、rnase保护、引物延伸、用于检测rna转录物的rt-pcr扩增、sanger测序、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的新一代测序技术(例如，illumina,pacbio,ion torrent,454)酶促测定，以及检测多肽的蛋白凝胶电泳、western印迹、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。用于执行所有参考技术的方法是已知的。
129.在一个方面中，与缺乏突变的内源性基因相比，内源性基因中的突变导致表达水平降低。在另一个方面中，与缺乏突变的内源性基因相比，内源性基因中的突变导致表达水平增加。
130.在一个方面中，与对照烟草植物中的基因表达相比，非天然突变导致表达水平降低。在一个方面中，与对照烟草植物中的基因表达相比，非天然突变导致表达水平增加。
131.在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的内源性基因编码的蛋白或多肽相比，内源性基因中的突变导致由具有突变的内源性基因编码的蛋白或多肽的活性水平降低。在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的内源性基因编码的蛋白或多肽相比，内源性基因中的突变导致由具有突变的内源性基因编码的蛋白或多肽的活性水平增加。
132.在一个方面中，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平降低。在另一个方面中，与由缺乏非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，非天然突变导致由包含非天然突变的多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平增加。
133.在一个方面中，与缺乏突变的基因组基因座相比，在基因组基因座中的突变导致
表达水平降低。在另一个方面中，与缺乏突变的基因组基因座相比，在基因组基因座中的突变导致表达水平增加。在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白或多肽相比，在基因组基因座中的突变导致由具有所述突变的基因组基因座编码的蛋白或多肽的活性水平降低。在一个进一步的方面中，与由缺乏突变的基因组基因座编码的蛋白或多肽相比，在基因组基因座中的突变导致由具有所述突变的基因组基因座编码的蛋白或多肽的活性水平增加。
134.基因表达水平是本领域的常规研究。作为非限制性示例，可以使用定量逆转录酶pcr(qrt-pcr)、rna测序或northern印迹来测量基因表达。在一个方面中，使用qrt-pcr测量基因表达。在另一个方面中，使用northern印迹测量基因表达。在另一个方面中，使用rna测序测量基因表达。
135.在一个方面中，本文提供的方法还包括将烟草植物与包含直接抑制或消除编码选自以下的产物的一种或多种基因的表达或活性的突变或转基因的烟草植物杂交：mpo、qpt、bbl、a622、天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。
136.如本文所用，“转基因”是指已稳定整合到修饰的烟草植物的基因组中的外源性dna。
137.在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含直接抑制或消除编码选自以下的产物的一种或多种基因的表达或活性的突变或转基因：甲基腐胺氧化酶(mpo)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(qpt)、喹啉酸合成酶(qs)、bbl、a622、天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)、精氨酸酶、二胺氧化酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)、精氨酸脱羧酶(adc)、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。
138.在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在nic2基因座的erf基因中的突变。在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者全部七个基因中的一个或多个突变：erf189、erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168。参见shoji等，plant cell,(10):3390-409(2010)；和kajikawa等，plant physiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在erf189、erf115或者两者中的一个或多个突变。
139.在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在nic1基因座(或于2019年1月11日提交的pct/us2019/013345中的nic1b基因座，公开号为wo/2019/140297)的erf基因中的突变。亦参见wo/2018/237107。在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个或者七个或更多个基因中的一个或多个突变：erf101、erf110、erfnew、erf199、erf19、erf130、erf16、erf29、erf210和erf91l2。参见kajikawa等，plant physiol.2017,174:999-1011。在一个方面中，包含py性状的烟草植物还包含在选自以下的两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或全部六个基因中的一个或多个突变：erfnew、erf199、erf19、erf29、erf210和erf91l2。
140.在一个方面中，与缺乏突变或转基因的烟草植物相比，本文提供的烟草植物包含赋予烟碱水平降低的突变或转基因。在一个方面中，本文提供的烟草植物是低生物碱烟草植物。
141.多种因素影响烟草生物碱水平，其中包括基因型、环境、施肥和农艺实践(例如，通过打顶、创伤和食草动物损伤刺激烟碱产生)。最初在古巴雪茄烟草品种的品系中发现的低生物碱性状通过一系列回交被引入卷烟品种。随后在品种burley 21的遗传背景中登记了低生物碱烟草种质(legg等，crop science,10:212(1970))。使用低生物碱burley 21(la bu21)品系的遗传研究表明，两个未连锁的基因座会影响烟叶中的烟碱水平。这两个基因座被称为nic1和nic2。la bu21中的nic1和nic2(分别与烟碱1和烟碱2相同)突变是半显性的。它们对烟碱水平表现出剂量依赖性影响，并且nic1的影响比nic2的影响强约2.4倍。已经报道了nic2基因座的分子特征。nic2突变已被证明包含来自乙烯响应因子(erf)家族的一组转录因子基因的缺失，例如，erf189,erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168(shoji等，plant cell,(10):3390-409(2010))。
142.降低烟草中总生物碱含量可以带来很多好处。它可以增加烟草作为生物质资源的价值。烟草植物中烟碱类生物碱的增加可在保护植物免受昆虫和食草动物侵害方面发挥重要作用。
143.与生物碱在昆虫防御中的作用一致，据报道la bu21极易受到昆虫损害(legg等，crop science,10:212(1970))。一项进一步的研究比较了具有低总生物碱百分比(约0.20％)的烤烟的等基因品系与其“正常”重复亲本(总生物碱1.85至2.70％)，其报告显示低生物碱品系的产量、等级指数、总氮和还原糖含量低于正常烤烟品种(chaplin和weeks,crop science,16(3):416-18(1976))。
144.不受限制地，低生物碱烟草品种包括la burley 21、lafc53、ln b&w和ln ky171。
145.在一个方面中，赋予烟碱水平降低的突变包括nic1突变、nic2突变或者两者。在一个方面中，nic1突变、nic2突变或者两者基因渗入或来源于选自以下的品种：la burley 21、lafc53、ln b&w和ln ky171。
146.如本文所用，烟草的“低生物碱品种”指包含一种或多种基因修饰的烟草品系，所述基因修饰将总生物碱(通过干重测量)降低至低于在除了一种或多种基因修饰以外的基本相似的遗传背景的对照烟草品种中总生物碱水平的25％。作为非限制性示例，ky171可以作为低生物碱品种la ky171的对照。
147.如本文所用，“遗传修饰”指经过诱变、基因组编辑、遗传转化或其组合的植物、种子、植物部分、植物细胞和植物基因组。
148.在一个方面中，赋予烟碱水平降低的突变包含在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(adc)、甲基腐胺氧化酶(mpo)、nadh脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)、腐胺n-甲基转移酶(pmt)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(qpt)、s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)、a622、nbb1、bbl、myc2、nic1_erf、nic2_erf、乙烯响应因子(erf)转录因子、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。在另一个方面中，赋予烟碱水平降低的突变包括在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：erf101、erf110、erfnew、erf199、erf19、erf130、erf16、erf29、erf210和erf91l2。在另一个方面中，赋予烟碱水平降低的突变包括在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：erf32、erf34、erf39、erf189、erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168。
149.在一个方面中，赋予烟碱水平降低的转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白
的基因的转基因：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(adc)、甲基腐胺氧化酶(mpo)、nadh脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)、腐胺n-甲基转移酶(pmt)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(qpt)、s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)、a622、nbb1、bbl、myc2、nic1_erf、nic2_erf、乙烯响应因子(erf)转录因子、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。在另一个方面中，赋予烟碱水平降低的转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：erf101、erf110、erfnew、erf199、erf19、erf130、erf16、erf29、erf210和erf91l2。在另一个方面中，赋予烟碱水平降低的转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：erf32、erf34、erf39、erf189、erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168。
150.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少75％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少80％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少85％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少90％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少95％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少96％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少97％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少98％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有至少99％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸序列与选自以下的序列具有100％同一性：seq id no:22-27、44、45和49。
151.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少80％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少85％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述
重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少90％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少95％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少96％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少97％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少98％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列至少99％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含重组dna构建体，所述重组dna构建体包含与核酸序列可操作地连接的异源启动子，所述核酸编码与选自以下的氨基酸序列100％同一性或相似的氨基酸序列：seq id no:28-33、46、47和50。
152.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含与多核苷酸可操作地连接的异源启动子，所述多核苷酸包含在选自以下的核酸序列中的非天然突变：seq id no:16-21和48。
153.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58899蛋白的内源核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:46相比，所述非天然突变包含在选自以下的位置处的氨基酸残基的插入、缺失或取代：位置18、24、54、56、57、60、87、221和325。
154.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58899蛋白的内源性核酸序列的启动子中的非天然突变，其中与缺乏非天然突变的对照烟草植物、种子或细胞相比，所述烟草植物、种子或细胞展现出降低的内源性核酸表达。
155.在一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58899蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与选自由seq id no:30、46和47组成的组的氨基酸序列相比，所述非天然突变导致g58899蛋白中产生提前终止密码子。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58887蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:28相比，所述非天然突变导致g58887蛋白中产生提前终止密码子。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58888蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:29相比，所述非天然突变导致g58888蛋白中产生提前终止密码子。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58917蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:31相比，所述非天然突变导致g58917蛋白中产生提前终止密码子。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g58905蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:32相比，所述非天然突变导致g58905蛋白中产生提前终止密码子。在另一个方面中，烟草植物、种子或细胞包含在编码g61524蛋白的内源性核酸序列中的非天然突变，其中与seq id no:33相比，所述非天然突变导致g61524蛋白中产生提前终止密码子。
156.人工mirna
157.在一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少80％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少85％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少90％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少95％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少96％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少97％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少98％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有至少99％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸序列与选自以下的氨基酸序列具有100％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50。
158.在一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少80％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少85％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少
90％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少95％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少96％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少97％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少98％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有至少99％同一性：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，本公开提供了一种包含可操作地连接至多核苷酸的异源启动子的重组核酸，所述多核苷酸编码非编码rna分子，其中所述非编码rna分子能够结合至rna，所述rna与选自以下的核酸序列具有100％同一性：seq id no:16-21和48。
159.在一个方面中，非编码rna分子选自以下：microrna(mirna)、小干扰rna(sirna)、反式作用sirna(ta-sirna)、转移rna(trna)、核糖体rna(rrna)、内含子、发夹rna(hprna)和包含内含子的发夹rna(ihprna)。
160.mirna通常在约19至约25个核苷酸之间(植物中通常为约20-24个核苷酸)，其指导靶转录物的反式切割，负调控参与各种调控和发育途径的基因的表达(bartel(2004)cell,116:281-297)。在一些情况下，mirna用于指导sirna初级转录物的同阶段处理(参见allen等，(2005)cell,121:207-221)。
161.很多microrna基因(mir基因)已被鉴定并在数据库中公开提供(“mirbase”，可以在线从microrna[dot]sanger[dot]ac[dot]uk/sequences获得；亦参见griffiths-jones等，(2003)nucleic acids res.,31:439-441)。据报道，mir基因出现在基因间区域，无论是分离的还是基因组中的簇，但也可以完全或部分位于其他基因(蛋白编码和非蛋白编码)的内含子内。最近对于mirna生源论的综述，参见kim(2005)nature rev.mol.cell.biol.,6:376-385。至少在一些情况下，mir基因的转录可以在mir基因自身启动子的促进控制下进行。初级转录物，成为“pri-mirna”，可以非常大(几千碱基)，并且可以是多顺反子，其包含一个或多个pre-mirna(包含茎环排列的折叠结构，该结构被加工成成熟的mirna)以及通常的5
’“
帽”和mrna的多聚腺苷酸尾。参见，例如，在kim(2005)nature rev.mol.cell.biol.,6:376-385中的图1。
[0162]
成熟mirna从其相应的前体(pri-mirna和pre-mirna)的成熟在动物和植物之间存在显着差异。例如，在植物细胞中，认为microrna前体分子在很大程度上完全在细胞核中被加工成成熟mirna，而在动物细胞中，pri-mirna转录物在细胞核中由动物特异性酶drosha加工，然后将pre-mirna输出到细胞质，在细胞质中进一步加工成成熟的mirna。在植物中成熟mirna的长度通常为21个核苷酸。对于最近对植物和动物中mirna生源论的综述，参见kim
(2005)nature rev.mol.cell.biol.,6:376-385。在mirna生源论和功能上的其他综述参见，例如，bartel(2004)cell,116:281-297；murchison和hannon(2004)curr.opin.cell biol.,16:223-229；以及dugas和bartel(2004)curr.opin.plant biol.,7:512-520。
[0163]
mirnas(无论是天然序列还是人工序列)的转基因表达可用于调控mirna的靶基因或基因的表达。转基因表达的转录物中mirna识别位点的包含也可用于调控转录物的表达；参见，例如，parizotto等，(2004)genes dev.,18:2237-2242。mirna的识别位点在mrna的所有区域都得到了验证，其中包括5’非翻译区、编码区和3’非翻译区，这表明mirna靶位点相对于编码序列的位置可能不一定会影响抑制(参见，例如，jones-rhoades和bartel(2004).mol.cell,14:787-799，rhoades等，(2002)cell,110:513-520，allen等，(2004)nat.genet.,36:1282-1290，sunkar和zhu(2004)plant cell,16:2001-2019)。由于mirna是真核生物中重要的调控元件，因此mirna的转基因抑制可用于操纵生物通路和应答。最后，mir基因的启动子可以具有非常特异性的表达模式(例如，细胞特异性、组织特异性、时间特异性或诱导型)，因此可用于重组构建体以诱导与其可操作地连接的dna序列的这种特异性转录。在美国专利申请公开2006/0200878a1中详细描述了mirna、其前体、其识别位点和其启动子的各种用途，该申请通过引用将其并入本文。这些用途的非限制性示例包括：(1)表达天然mirna或mirna前体序列以抑制靶基因；(2)表达人工mirna或mirna前体序列以抑制靶基因；(3)表达具有mirna识别位点的转基因，当成熟mirna表达时，转基因被抑制；(4)由mirna启动子驱动的转基因的表达。
[0164]
设计人工mirna序列可以像用与预期靶标互补的序列替换mirna前体的mirna茎区域中的核苷酸一样简单，如zeng等，(2002)mol.cell,9:1327-1333所证实的。用于确定天然mirna序列中核苷酸变化以产生工程化mirna前体的一般方法的一个非限制性示例包括以下步骤：(a)选择对靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，例如，通过使用blast等序列比对工具(参见，例如，altschul等，(1990)j.mol.biol.,215:403-410；altschul等，(1997)nucleic acids res.,25:3389-3402)，例如，选择对烟草cdna和基因组dna数据库两者的靶基因具有特异性的至少18个核苷酸的独特靶序列，以鉴定靶转录物直系同源物和无关基因的任何潜在匹配，从而避免非靶序列的无意沉默；(b)分析靶基因中不需要的序列(例如，匹配来自非靶物种的序列)，并对每个潜在的19-mer片段的gc含量进行评分，reynolds评分(见reynolds等，(2004)nature biotechnol.,22:326-330)，和通过自由能负差表征的功能不对称(".delta..delta.g"或“δδg”)(参见khvorova等，(2003)cell,115:209-216)。优选地，选择具有以下所有或大部分特征的19-mer：(1)reynold评分》4。(2)gc含量在约40％至约60％之间，(3)负δδg，(4)末端腺苷，(5)缺少连续运行的4个或更多个相同核苷酸；(6)邻近靶基因3’末端的位置；(7)与mirna前体转录物的差异很小。据报道，sirna中每第三个核苷酸的位置在影响rnai功效和算法方面尤为重要，“siexplorer”是在rna[dot]chem[dot]t[dot]u-tokyo[dot]ac[dot]jp/siexplorer.htm公开可获得的(参见katoh和suzuki(2007)nucleic acids res.,10.1093/nar/gkl1120)；(c)确定所选的19-mer的反向互补，以用于制备修饰的成熟mirna。位置20的另外的核苷酸优选与选定的靶序列匹配，并且位置21处的核苷酸优选地选择为不配对以防止靶转录物上的沉默扩散或与靶序列配对以促进靶转录物上的沉默扩散；和(d)将人工mirna转化入植物。
[0165]
在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下
的多核苷酸具有至少80％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少85％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少90％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少95％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少96％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少97％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少98％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有至少99％序列同一性：seq id no:16-21和48。在一个方面中，本文提供的人工mirna与多核苷酸互补，所述多核苷酸与选自以下的多核苷酸具有100％序列同一性：seq id no:16-21和48。
[0166]
在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少80％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少85％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少90％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少95％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少96％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少97％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少98％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有至少99％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。在另一个方面中，本文提供的人工mirna与编码多肽的多核苷酸互补，所述多肽与选自以下的多肽具有100％序列同一性或相似性：seq id no:28-33、46、47和50。
[0167]
在一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少15个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少16个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少17个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少18个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少19个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以下的核酸序列互补的至少20个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。在另一个方面中，人工mirna包含与选自以
下的核酸序列互补的至少21个连续的核苷酸：seq id no:16-21和48。
[0168]
在一个方面中，本文提供的人工mirna降低或消除选自以下的基因的rna转录或蛋白翻译：g58887、g58888、g58899、g58917、g58905、g61524和g20337。
[0169]
在一个方面中，修饰的烟草植物或其部分包含本文提供的任何非编码rna分子。在另一个方面中，修饰的烟草植物或其部分包含本文提供的任何人工mirna。在另一个方面中，修饰的烟草植物或其部分包含本文提供的任何重组核酸。
[0170]
当在烟草植物中表达时，与不表达非编码rna分子的对照烟草植物相比，本文提供的非编码rna分子降低同源靶转录物(例如，seq id no:16-21和48)的表达或翻译。类似地，当在烟草植物中表达时，与不表达非编码rna分子的对照烟草相比，本文提供的人工mirna降低同源靶转录物(例如，seq id no:16-21和48)的表达或翻译。
[0171]
在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物表现出浅黄色表型。
[0172]
在一个方面中，人工mirna与异源启动子可操作地连接。
[0173]
如本文所用，“能够结合至”与“能够杂交至”是同义的。在一个方面中，能够结合至第二核酸分子的第一核酸分子结合至第二核酸分子。如本文所用，在适当的体外和/或体内温度和溶液离子强度条件下，第一个核酸分子可以通过非共价相互作用(例如，watson-crick碱基配对)以序列特异性、反平行的方式(即，核酸与互补核酸特异性结合)“杂交”第二个核酸分子。如本领域公知的，标准watson-crick碱基配对包括：腺嘌呤与胸腺嘧啶配对、腺嘌呤与尿嘧啶配对以及鸟嘌呤(g)与胞嘧啶(c)配对[dna，rna]。此外，本领域还公知，对于两个rna分子(例如，dsrna)之间的杂交，鸟嘌呤碱基与尿嘧啶配对。例如，在trna反密码子碱基与mrna中的密码子配对的情况下，g/u碱基配对是遗传密码简并(即，冗余)的部分原因。在本公开的背景下，目标dna靶向rna分子的蛋白结合片段(dsrna双链体)的鸟嘌呤被认为与尿嘧啶互补，反之亦然。因此，当g/u碱基对可以在给定的核苷酸位置形成目标dna靶向rna分子的蛋白结合片段(dsrna双链体)时，该位置不被认为是非互补的，而是被认为是互补的。
[0174]
杂交和洗涤条件是众所周知的，并且示例于sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.molecular cloning:a laboratory manual，第二版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(1989)，特别是其中的第11章和表11.1；以及sambrook,j.和russell,w.,molecular cloning:a laboratory manual，第三版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor(2001)中。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严谨性”。
[0175]
杂交需要两个核酸包含互补序列，但碱基之间的错配是可能的。适用于两种核酸之间杂交的条件取决于核酸的长度和互补程度，这些是本领域众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的互补程度越大，具有这些序列的核酸杂交体的解链温度(tm)值就越大。对于具有短段互补性的核酸之间的杂交(例如，超过35个或更少核苷酸的互补性)，错配的位置变得很重要(参见sambrook等人)。通常，可杂交核酸的长度是至少约10个核苷酸。可杂交核酸的示例性最小长度是：至少约15个核苷酸；至少约20个核苷酸；至少约22个核苷酸；至少约25个核苷酸；和至少约30个核苷酸。此外，本领域技术人员将意识到，温度和洗涤溶液盐浓度可以根据诸如互补区域的长度和互补程度等因素进行必要的调整。
[0176]
本领域内应理解，多核苷酸的序列不需要与其靶核酸的序列100％互补以是可特
异性杂交的或可杂交的。此外，多核苷酸可以在一个或多个片段上杂交，使得插入或邻近的片段不参与杂交事件(例如，环结构或发夹结构)。例如，其中反义化合物的20个核苷酸中的18个与靶区域互补并因此特异性杂交的反义核酸代表90％的互补性。在这个示例中，剩余的非互补核苷酸可以与互补核苷酸成簇或散布，并且不必彼此连续或与互补核苷酸连续。可以使用本领域已知的程序(基于局部比对算法的搜索工具)和powerblast程序(参见altschul等，j.mol.biol.,1990,215,403-410；zhang和madden,genome res.,1997,7,649-656)，或者通过使用gap程序(wisconsin序列分析包，用于unix的第8版，genetics computer group,university research park,madison wis.)，使用默认设置，其使用smith和waterman的算法(adv.appl.math.,1981,2,482-489)，来常规测定核酸内特定核酸序列片段之间的互补性百分比。
[0177]
启动子
[0178]
如本领域通常所理解的，术语“启动子”是指包含rna聚合酶结合位点、转录起始位点和/或tata盒并协助或促进相关可转录多核苷酸序列和/或基因(或转基因)的转录和表达的dna序列。启动子可以由已知或天然存在的启动子序列或其他启动子序列合成产生、变化或衍生。启动子还可以包括包含两个或更多个异源序列的组合的嵌合启动子。因此，本技术的启动子可以包括与本文已知或提供的其他启动子序列组成相似但不同一的启动子序列的变体。
[0179]
在植物的所有或大部分组织中驱动表达的启动子称为“组成型”启动子。组成型启动子的非限制性示例是花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子。在发育的特定时期或阶段驱动表达的启动子被称为“发育”启动子。相对于生物体的其他组织，在生物体的某些组织中驱动增强表达的启动子被称为“组织偏好的”启动子。因此，“组织偏好的”启动子引起在植物的特定组织中相对较高或优先的表达，但在植物的其他组织中较低的表达水平。“诱导型”启动子是响应于环境刺激，如热、冷、干旱、光或其他刺激(如创伤或化学应用)而启动转录的启动子。
[0180]
在一个方面中，本文提供的启动子是组成型启动子。在另一个方面中，本文提供的启动子是诱导型启动子。在一个进一步的方面中，本文提供的启动子是发育启动子。
[0181]
在一个方面中，本公开提供了一种异源启动子。在另一个方面中，本公开提供了一种可操作地连接至异源多核苷酸的启动子。在另一个方面中，本公开提供了一种可操作地连接至异源启动子的多核苷酸序列。
[0182]
如本文所用，“可操作地连接”指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，目标多核苷酸和调控序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许目标多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或不连续的。在一个方面中，本文提供的启动子可操作地连接至异源核酸分子。
[0183]
植物
[0184]
如本文所用，“烟草”指普通烟草(nicotiana tabacum)。
[0185]
在一个方面中，本文提供的烟草部分包括，但不限于，叶、茎、根、种子、花、花粉、花药、胚珠、花梗、果实、分生组织、子叶、下胚轴、豆荚、胚、胚乳、外植体、愈伤组织、组织培养物、芽、细胞和原生质体。在一个方面中，所提供的烟草部分不包括种子。在一个方面中，本公开提供了烟草植物细胞、组织和器官，其不是繁殖材料，也不介导植物的自然繁殖。在另
一个方面中，本公开内容还提供了烟草植物细胞、组织和器官，其是繁殖材料并介导植物的自然繁殖。在另一个方面中，本公开提供了不能通过光合作用维持自身的烟草植物细胞、组织和器官。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物体细胞。与生殖细胞相反，体细胞不介导植物繁殖。
[0186]
细胞、组织和器官可以来自种子、果实、叶、子叶、下胚轴、分生组织、胚、胚乳、根、芽、茎、荚、花、花序、茎、花梗、花柱、柱头、花托、花瓣、萼片、花粉、花药、花丝、子房、胚珠、果皮、韧皮部、维管组织。在另一个方面中，本公开提供了烟草植物叶绿体。在一个进一步的方面中，本公开提供了表皮细胞、气孔细胞、叶毛或根毛、贮藏根或块茎。在另一个方面中，本公开提供了烟草原生质体。
[0187]
本领域技术人员理解烟草植物通过种子自然繁殖，而不是通过无性繁殖或营养繁殖。在一个方面中，本公开提供了烟草胚乳。
[0188]
本公开提供了来自本文提供的烟草植物的细胞。
[0189]
如本文所用，“后代植物”可以来自任何子代，例如，f1、f2、f3、f4、f5、f6、f7等。
[0190]
在一个方面中，烟草植物是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0191]
在一个方面中，烟草细胞是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。在一个方面中，修饰的烟草细胞是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0192]
在一个方面中，烟叶是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0193]
在一个方面中，熟化烟叶或植物部分是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。本领域技术人员进一步理解，熟化烟草不构成活生物体并且不能生长或繁殖。
[0194]
烤制熟化烟草(也称为“弗吉尼亚烟”或“金黄色”烟)占世界烟草产量的约40％。因为在熟化期间其达到金黄色至深橘色，烤制熟化烟草也常常称为“浅色烟烟草”。烤制熟化烟草具有淡淡的、明亮的香气和味道。烤制熟化烟草通常糖含量高并且油含量低。主要的烤制熟化烟草种植国家有阿根廷、巴西、中国、印度、坦桑尼亚和美国。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表2所列品种的烤制熟化烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。参见wo 2004/041006a1。在一个进一步的方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子的选自k326、k346和nc196的烤烟品种。
[0195]
表2：烤制熟化烟草品种
[0196]
[0197][0198]
晾制熟化烟草包括“白肋”、“马里兰”和“深色”烟草。将晾制熟化烟草联系起来的共同因素是熟化主要没有人工的热源和湿度。白肋烟的颜色是浅棕色至深棕色，油含量高，糖含量低。白肋烟通常在仓房中晾制熟化。白肋烟的主要种植国家包括阿根廷、巴西、意大利、马拉维和美国。
[0199]
马里兰烟草非常蓬松，具有良好的燃烧性能、低烟碱和中性香气。马里兰的主要种植国包括美国和意大利。
[0200]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表3中所列烟草品种的白肋烟品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。在一个进一步的方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子是选自以下的白肋烟品种：tn 90、kt 209、kt 206、kt212和hb 4488。
[0201]
表3：白肋烟草品种
[0202]
4407 lchb 4108pky 54(tc 71)aa-37-1hb 4151pky 56(tc 72)burley 21(tc 7)hb 4192pky 56(tc 72)burley 49(tc 10)hb 4194pky 57(tc 73)burley 64(tc 11)hb 4196ky 58(tc 74)
burley mammoth ky 16(tc 12)hb 4488ky 8654(tc 77)clay 402hb 4488pky 8959clay 403hb04pky 9(tc 54)clay 502hb 4488 lcky 907 lcclays 403hib 21ky 908(tc 630)gr 10(tc 19)hpb 21nbh 98(screened)gr 10(tc 19)hy 403nc 1206gr 10a(tc 20)hybrid 403 lcnc 129gr 13(tc 21)hybrid 404 lcnc 2000 lcgr 14(tc 22)hybrid 501 lcnc 2002 lcgr 149lckdh-959(tc 576)nc 3 lcgr 153kdh-960(tc 577)nc 5lcgr 17(tc 23)kt 200 lcnc 6 lcgr 17b(tc 24)kt 204 lcnc 7 lcgr 18(tc 25)kt 206 lcnc bh 129 lcgr 19(tc 26)kt 209 lcnc03-42-2gr 2(tc 15)kt 210 lcnewton 98gr 24(tc 27)kt 212 lcr 610 lcgr 36(tc 28)kt 215 lcr 630 lcgr 38(tc 29)ky 1(tc 52)r 7-11gr 38a(tc 30)ky 10(tc 55)r 7-12 lcgr 40(tc 31)ky 12(tc 56)rg 17gr 42(tc 32)ky 14(tc 57)tkf 1801 lcgr 42c(tc 33)ky 14 x l8 lctkf 2002 lcgr 43(tc 34)ky 15(tc 58)tkf 4024 lcgr 44(tc 35)ky 16(tc 59)tkf 4028 lcgr 45(tc 36)ky 17(tc 60)tkf 6400 lcgr 46(tc 37)ky 19(tc 61)tkf 7002 lcgr 48(tc 38)ky 21(tc 62)tks 2002 lcgr 5(tc 16)ky 22(tc 63)tn 86(tc 82)gr 53(tc 39)ky 24(tc 64)tn 90 lcgr 6(tc 17)ky 26(tc 65)tn 97 hybrid lcgr 9(tc 18)ky 33(tc 66)tn 97 lcgr139 nsky 34(tc 67)va 116gr139 sky 35(tc 68)va 119hb 04pky 41a(tc 69)virgin a mutante(ti 1406)hb 04p lcky 5(tc 53)virginia 509(tc 84)hb 3307p lcky 52(tc 70) [0203]
在另一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表4中所列烟草品种的马里兰烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品
种。
[0204]
表4：马里兰烟草品种
[0205]
maryland 10(tc 498)maryland 14 d2(tc 499)maryland 201(tc 503)maryland 21(tc 500)maryland 341(tc 504)maryland 40maryland 402maryland 59(tc 501)maryland 601maryland 609(tc 505)maryland 64(tc 502)maryland 872(tc 506)maryland mammoth(tc 507)
[0206]
深色晾制熟化烟草与其他烟草类型的区别主要在于其熟化过程，这使得深色晾制熟化烟草中具有中棕色至深棕色的颜色和独特的香气。深色晾制熟化烟草主要用于生产咀嚼烟和鼻烟。在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物或种子是选自以下的深色晾制熟化烟草品种：sumatra、jatim、dominican cubano、besuki、one sucker、green river、virginia sun-cured和paraguan passado，以及基本上衍生自任何一种前述品种的任何品种。
[0207]
深色明火烤制熟化烟草通常在封闭的熟化室底板上用低燃烧木火熟化。深色明火烤制熟化烟草通常用于制作管烟、卷烟、咀嚼烟草、鼻烟和烈性雪茄。深色明火烤制熟化烟草的主要种植区是美国的田纳西州、肯塔基州和弗吉尼亚州。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表5中列出的烟草品种，和基本上衍生自前述品种中的任一种的任何品种。
[0208]
表5：深色明火烤制熟化烟草品种
[0209]
[0210][0211]
东方烟草也被称为希腊香气和土耳其烟草，因为它们通常生长在东地中海地区，如土耳其、希腊、保加利亚、马其顿、叙利亚、黎巴嫩、意大利和罗马尼亚。东方烟草品种的株型小、叶型小和独特的香气特性是其适应所生长的贫瘠的土壤和恶劣气候条件的结果。在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表6中所列烟草品种的东方烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。
[0212]
表6：东方烟草品种
[0213]
[0214][0215]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表7中所列烟草品种的雪茄烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。
[0216]
表7：雪茄烟草品种
[0217][0218]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或种子或者修饰的烟草植物或种子是选自表8中所列烟草品种的烟草品种，以及基本上衍生自上述品种中的任一种的任何品种。
[0219]
表8：其他烟草品种
[0220][0221][0222]
在一个方面中，烟草植物、种子或细胞来自选自由表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8中列出的烟草品种组成的组中的品种。
[0223]
上述提到的烤制熟化、深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化或东方烟草类型的所有特定品种仅出于示例性目的而列出。在本技术中还考虑了任何其他的烤
制熟化、深色晾制熟化、白肋烟、马里兰烟、深色明火烤制熟化、雪茄或东方烟草品种。
[0224]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或品种是近交烟草植物或品种。如本文所用，“近交”烟草品种是为遗传同质性而培育的品种。
[0225]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或品种是杂交烟草植物或品种。通过杂交来自不同品种或物种的两种植物产生“杂交种”，使得子代包含来自每个亲本的遗传物质。本领域技术人员认识到也可以生成更高阶的杂交种。例如，可以通过将品种c与品种d杂交以产生c x d杂交种来制备第一杂交种，并且可以通过将品种e与品种f杂交以产生e x f杂交种来制备第二杂交种。可以进一步杂交第一和第二杂交种以产生包含来自所有四个亲本品种的遗传信息的高阶杂交种(c x d)x(e x f)。在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物是杂交烟草植物。在另一个方面中，本文提供的修饰的烟草种子是杂交烟草种子。
[0226]
如本文所用，术语“杂交”指两株植物的故意交配。在一个方面中，杂交包括通过第二烟草植物对第一烟草植物授粉和/或受精。杂交的两株烟草植物可以是远亲、近亲或相同的。在一个方面中，杂交的两株烟草植物都是修饰的烟草植物。在一个方面中，杂交的两株烟草属于同一烟草品种。在一个方面中，杂交的两株烟草植物属于两个不同的烟草品种。在一个方面中，杂交的两株烟草植物中的一株是雄性不育的。在一个方面中，杂交的两株烟草植物中的一株是雌性不育的。在一个方面中，杂交的两株烟草植物中的至少一株是杂交烟草植物。在一个方面中，杂交的两株烟草植物中的至少一株是修饰的烟草植物。
[0227]
在一个方面中，本文提供的烟草植物或品种是雄性不育的。在另一个方面中，本文提供的烟草植物或品种是胞质雄性不育(cms)的。雄性不育的烟草植物可以通过本领域公知的任何方法生产。在wernsman,e.a.和rufty,r.c.1987.第17章tobacco，第669-698页，cultivar development.crop species.w.h.fehr(ed.),macmillan publishing go.,inc.,new york,n.y.761pp中描述了生产雄性不育的烟草的方法。
[0228]
在另一个方面中，本文提供的烟草植物或品种是雌性不育的。作为非限制性示例，可以通过突变stig1基因来制备雌性不育的植物。参见，例如，goldman等，1994,embo journal 13:2976-2984。在一个方面中，本文提供的修饰的烟草植物是雌性不育的。
[0229]
如本文所用，植物或种子的“种群”是指由任意数量的个体、对象或数据组成的集合，从这些个体、对象或数据中获取样本进行评价。最常见的是，这些术语涉及植物的育种种群，从中选择成员并进行杂交以在育种计划中产生后代。植物的种群可以包括单个育种杂交或多个育种杂交的后代，并且可以是实际植物或植物衍生材料，或植物或种子的计算机代表。种群成员不必与被选择用于后续分析循环的种群成员或最终被选择以获得最终后代植物或种子的种群成员相同。通常，植物或种子种群源自单个双亲杂交，但也可能源自相同或不同亲本之间的两次或更多次杂交。尽管植物或种子的种群可以包括任意数量的个体，但本领域技术人员将认识到植物育种者通常使用从一两百个体到几千个体的种群大小，并且种群中表现最高5％-20％是通常选择用于后续杂交的，以提高后代种群的性能。
[0230]
将重组dna构建体引入植物细胞的许多方法是本领域已知的，其可根据本技术的方法使用以产生转基因植物细胞和植物。根据本发明的方法，可以使用本领域已知的用于转化植物细胞的任何合适的方法或技术。转化植物的有效方法包括细菌介导的转化，如农杆菌介导的或根瘤菌介导的转化和微粒轰击介导的转化。本领域已知多种方法通过细菌介导的转化或微粒轰击用转化载体转化外植体，然后对这些外植体进行培养等以再生或发育
转基因植物。植物转化的其它方法，如微注射、电穿孔、真空渗透、压力、超声处理、碳化硅纤维搅拌、聚乙二醇(peg)介导的转化等，也是本领域已知的。取决于所用的方法和外植体，通过这些转化方法产生的转基因植物对于转化事件可以是嵌合的或非嵌合的。
[0231]
转化植物细胞的方法是本领域普通技术人员熟知的。例如，美国专利号5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,153,812发现了通过用包被有重组dna的颗粒进行微粒轰击(例如，基因枪转化)来转化植物细胞的具体说明；以及美国专利号5,159,135；5,824,877；5,591,616；6,384,301；5,750,871；5,463,174；和5,188,958描述了农杆菌介导的转化，其均通过引用以其整体并入本文。转化植物的其它方法可见于例如compendium of transgenic crop plants(2009)blackwell publishing。本领域技术人员已知的任何合适的方法可用于用本文提供的任何核酸分子转化烟草细胞。
[0232]
在一个方面中，向烟草细胞提供核酸分子的方法包括农杆菌介导的转化。在另一个方面中，向细胞提供核酸分子的方法包括peg介导的转化。在另一个方面中，向细胞提供核酸分子的方法包括基因枪转化。在另一个方面中，向细胞提供核酸分子的方法包括脂质体介导的转染(脂质转染)。在另一个方面中，向细胞提供核酸分子的方法包括慢病毒转染。
[0233]
脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386、4,946,787；和4,897,355中，并且脂质转染试剂是市售的(例如，transfectam
tm
和lipofectin
tm
)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括wo91/17424和wo91/16024的那些。可以向细胞(例如，体外或离体施用)或靶组织(例如，体内施用)进行递送。
[0234]
预期可以再生可育的烟草植物的任何烟草细胞是用于实践本公开的有用的受体细胞。在一个方面中，将重组dna构建体引入烟草细胞。在一个方面中，将重组dna构建体引入烟草原生质体细胞。在另一个方面中，将重组dna构建体引入烟草愈伤组织细胞。在一个方面中，将重组dna构建体引入烟草细胞，所述烟草细胞选自种子细胞、果实细胞、叶细胞、子叶细胞、下胚轴细胞、分生组织细胞、胚细胞、胚乳细胞、根细胞、芽细胞、干细胞、花细胞、花序细胞、茎细胞、梗细胞、花柱细胞、柱头细胞、花托细胞、花瓣细胞、萼片细胞、花粉细胞、花药细胞、丝细胞、卵巢细胞、胚珠细胞、果皮细胞和韧皮细胞。
[0235]
愈伤组织可以从各种组织来源开始，其中包括但不限于未成熟胚或胚的部分、幼苗顶端分生组织、小孢子等。那些能够作为愈伤组织增殖的细胞可以作为受体细胞进行转化。用于制备本公开的转基因植物的实用转化方法和材料(例如，各种培养基和受体靶细胞，未成熟胚胎的转化，以及随后可育转基因植物的再生)被公开于，例如，美国专利6,194,636和6,232,526以及美国专利申请公开2004/0216189中，其全部内容通过引用并入本文。
[0236]
tsna降低
[0237]“生物碱”是在植物中天然存在的复杂的含氮化合物，并且在人和动物中具有药理学作用。“烟碱”是商品化香烟烟草中主要的天然生物碱，占普通烟草中生物碱含量的约90％。烟草中的其他主要生物碱包括可替宁、降烟碱、麦斯明、二烯烟碱、假木贼碱和新烟草碱。次要烟草生物碱包括烟碱-n-氧化物、n-甲基新烟草碱、n-甲基假木贼碱、假氧化烟碱、2,3联吡啶和其他。
[0238]
生物碱水平可以通过本领域已知的方法测定，例如通过基于气液色谱法、高效液相色谱法、放射免疫测定法和酶联免疫吸附测定法的定量。例如，烟碱生物碱水平可以通过基于coresta推荐的方法no.7,1987的gc-fid方法和用于使用配备有毛细管柱和fid检测器
的气液色谱法的iso标准(iso tc 126n 394e。亦参见，hibi等，plant physiology 100:826-35(1992))来测量。
[0239]
或者，烟草总生物碱可使用被开发用于分析烟草样品的分段流动比色法测量，该方法由skalar instrument co.(west chester,pa)改进并描述于collins等，tobacco science 13:79-81(1969)中。简言之，在分析总生物碱和还原糖之前，将烟草样品干燥、研磨并提取。然后，该方法采用乙酸/甲醇/水提取和木炭进行脱色。总生物碱的测定基于氯化氰与烟碱生物碱在芳族胺存在下反应形成有色络合物，其在460nm下测量。
[0240]
在一个方面中，使用具有串联质谱法的液相色谱(lc/ms/ms)基于冷冻干燥的熟化叶样品测量总tsna或单独tsna的含量。
[0241]
在另一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的第二烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入第二烟草品种会降低至少一种烟草特异性亚硝胺(tsna)的水平。tsna包括n-亚硝基降烟碱(nnn)和4-(甲基亚硝胺)-l-(3-吡啶基)-l-丁酮(nnk)、n
’‑
亚硝基安他那品(nat)和n
’‑
亚硝基假木贼碱(nab)。
[0242]
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括nnn降低。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括nnk降低。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括nat降低。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括nab降低。
[0243]
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少1％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少2％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少3％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少4％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少5％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少10％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少15％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少20％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少25％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少50％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低至少75％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至99％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至90％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至80％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至70％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至60％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至50％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至40％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比
nnn降低1％至30％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至20％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至10％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnn降低1％至5％之间。
[0244]
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少1％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少2％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少3％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少4％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少5％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少10％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少15％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少20％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少25％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少50％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低至少75％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至99％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至90％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至80％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至70％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至60％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至50％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至40％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至30％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至20％之间。一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至10％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nnk降低1％至5％之间。
[0245]
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少1％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少2％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少3％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少4％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少5％。
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少10％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少15％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少20％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少25％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少50％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低至少75％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至99％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至90％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至80％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至70％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至60％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至50％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至40％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至30％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至20％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至10％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nat降低1％至5％之间。
[0246]
在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少1％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少2％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少3％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少4％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少5％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少10％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少15％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少20％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少25％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少50％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低至少75％。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至99％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至90％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至80％之间。在
一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至70％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至60％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至50％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至40％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至30％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至20％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至10％之间。在一个方面中，至少一种tsna水平降低包括与缺乏py qtl或py性状的对照烟草品种相比nab降低1％至5％之间。
[0247]
叶片分级
[0248]
在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种提高了后代植物的usda叶等级指数。
[0249]
在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少1％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少2％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少3％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少4％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少5％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少10％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少15％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少20％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少25％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少30％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少50％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少75％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少100％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少200％。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至20％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或
py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至30％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至40％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至50％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至60％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至70％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至80％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至90％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至100％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至150％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至200％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1％至300％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高10％至50％之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高10％至30％之间。
[0250]
在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少1。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少2。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少3。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少4。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少5。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少6。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少7。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少8。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少9。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少10。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状
基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少11。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少12。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少13。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少14。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少15。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少16。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少17。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少18。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少19。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少20。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少25。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少30。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少40。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高至少50。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至90之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至80之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至70之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至60之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至50之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至40之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至30之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至20之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至10之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高1至5之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状
基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高5至10之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高5至15之间。在一个方面中，与缺乏py qtl或py性状的低生物碱烟草品种相比，将py qtl或py性状基因渗入低生物碱烟草品种将usda叶等级指数提高10至20之间。
[0251]
如本文所用，“低生物碱品种”指包含等于、低于或不超过高于在已知低生物碱品系(如cs15和ln ky171)中测得的生物碱水平的20％的生物碱水平的烟草品种。
[0252]
如本文所用，“usda等级指数”、“等级指数”或“数字等级指数”是指根据群组、质量和颜色对类型进行细分。在一个方面中，usda等级质量分数被量化为由官方usda分级员确定的等级的0-100数字表示，并且是所有茎位置的加权平均值。等级指数越高表示质量越高。或者，叶等级可以通过高光谱成像确定。参见例如，wo 2011/027315(公开日2011年03月10日，并且其全部内容通过引用并入)。
[0253]
如本文所用，“经认证的烟叶分级员”是指受过培训以按照美国农业部(usda)农业营销系统(在7cfr
§
29中公布的)定义的官方标准等级对烟叶进行分级的人员。如本文所用，“官方usda等级”可由员工、前雇员或受过其他培训以按照usda官方标准等级对烟叶进行分级的人员指定。商业检验服务标准操作的示例性步骤开始于种植者将烟草运送到市场，然后将烟草按照批次排列在扁平篮子上。每个批次均经过称量，然后由usda官方分级员进行检查。检查后，分级员为每个批次分配一个等级，这成为一个等级证书，其表明群组、质量和颜色。对实验批次进行分级的步骤类似；但是，实验性烟草不会投放市场或以其他方式用于商业目的。
[0254]
基于以下因素评价烟草等级，所述因素包括但不限于叶茎位置、叶尺寸、叶颜色、叶均匀性和完整性、成熟度、质地、弹性、光泽(与叶的着色强度和深度以及光泽有关)、吸湿性(烟叶吸收并保持环境水分的能力)和绿色细微差别或落叶病(cast)。例如，可以使用美国农业部农业营销服务部公布的官方标准等级(7u.s.c.
§
511)来确定叶等级。参见例如official standard grades for burley tobacco(u.s.type 31 and foreign type 93),1990年11月5日生效(55f.r.40645)；official standard grades for flue-cured tobacco(u.s.types 11,12,13,14 and foreign type 92),1989年3月27日生效(54f.r.7925)；official standard grades for pennsylvaniseedleaf tobacco(u.s.type 41),1965年1月8日生效(29f.r.16854)；official standard grades for ohio cigar-leaf tobacco(u.s.types 42,43,and 44),1963年12月8日生效(28f.r.11719 and 28 f.r.11926)；official standard grades for wisconsin cigar-binder tobacco(u.s.types 54 and 55),1969年11月20日生效(34 f.r.17061)；official standard grades for wisconsin cigar-binder tobacco(u.s.types 54and 55),1969年11月20日生效(34f.r.17061)；official standard grades for georgiand floridshade-grown cigar-wrapper tobacco(u.s.type 62),1971年4月生效。usda等级指数值可根据行业认可的等级指数确定。参见例如bowman等,tobacco science,32:39-40(1988)；legacy tobacco document library(bates document#523267826-523267833,july 1,1988,memorandum on the proposed burley tobacco grade index)；和miller等,1990,tobacco intern.,192:55-57(所有上述参考文献通过引用以其全部并入)。
[0255]
除非另有说明，本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的叶等级指数值、生物碱或烟碱水平的测量值是指平均测量值，其包括，例如，单个植物的多个叶片的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物种群的平均测量值。用于确定平均测量值(例如，叶等级或生物碱或烟碱水平)的烟草植物种群或烟叶集合可以是任何尺寸，例如，5、10、15、20、25、30、35、40、50或更多。使用至少5株或更多烟草植物的种群来确定标准偏差。遵循行业认可的标准方案来确定平均测量值或等级指数值。
[0256]
如本文所用，“usda等级的叶片群组”、“叶片群组”或“群组”是基于与茎的位置、植株或总体质量相关的某些特征，涵盖密切相关等级的类型的划分。群组是usda等级的第一个因素。群组确定是分级程序的一部分，由usda官方分级员指定。
[0257]
除非另有说明，本文提及的烟草植物、品种、栽培品种或品系的生物碱或烟碱水平(或其他叶化学或性质表征)或叶等级指数值的测量值是指平均测量值，其包括，例如，单个植物的多个叶片的平均值或来自单个品种、栽培品种或品系的烟草植物种群的平均测量值。
[0258]
除非另有说明，烟草植物的烟碱或生物碱水平(或其他叶化学或性质表征)是在打顶后在从打顶后的3、4和5号叶子收集的汇集叶样品中测量的。如本文所用，每当提到来自两种植物(例如，突变植物与对照植物)的叶子之间的比较时，来自相同或可比较的茎位置和发育阶段的叶子是为了使比较可以证明由于基因型差异而不是其他因素造成的影响。作为非限制性说明，野生型对照植物的叶3旨在作为与包含py性状的植物的叶3进行比较的参考点。
[0259]
如本文所用，叶子编号基于烟草茎上的叶子位置，叶子编号1是打顶后最新的叶子(顶部)，最高的叶子编号分配给最老的叶子(底部)。
[0260]
除非另有说明，所有与对照植物的比较都需要相似的生长条件或被比较的两种植物的可比较的生长条件。如本文所用，“相似的生长条件”或“可比较的生长条件”是指相似的环境条件和/或农艺实践，其用于生长和在两种或多种植物基因型之间进行有意义的比较，使得环境条件和农艺实践都不会影响或解释两种或多种植物基因型之间观察到的任何差异。环境条件包括例如光照、温度、水(湿度)和营养(例如，氮和磷)。农艺实践包括，例如播种、修剪、底切、移栽、打顶和抹杈。参见tobacco,production,chemistry and technology的第4b和4c章，davis&nielsen编著，blackwell publishing,oxford(1999),pp 70-103。
[0261]
熟化/产品
[0262]“熟化”是减少水分并导致叶绿素的破坏的陈化过程，使烟叶呈现金黄色，淀粉转化为糖。因此，与收获的绿叶相比，熟化烟草具有更高的还原糖含量和更低的淀粉含量。在一个方面中，本文提供的烟草植物或烟草组分可以使用常规方法进行熟化，例如，烤制熟化、仓房熟化(barn-cured)、明火烤制熟化、晾制熟化或晒制熟化。对于不同类型的熟化方法的描述，参见，例如，tso(1999,chapter 1 in tobacco,production,chemistry and technology,davis&nielsen,eds.,blackwell publishing,oxford)。熟化烟草通常在水分含量为10％至约25％的压缩条件下在木桶(例如，大桶)或纸板箱中陈化数年(例如，2至5年)。参见，美国专利号4,516,590和5,372,149。然后，可以进一步加工熟化和陈化的烟草。进一步加工包括在引入或不引入各种温度的蒸汽、巴氏杀菌和发酵的情况下在真空下调制
烟草。
[0263]
有关白肋烟和深色烟草品种收获的信息可在肯塔基大学、田纳西大学、弗吉尼亚理工大学和北卡罗来纳州立大学出版的《2019-2020年白肋烟和深色烟草生产指南》(2018年12月)中找到，其全部内容通过引用并入本文。
[0264]
在一个方面中，本公开提供了来自本文提供的任何植物的熟化烟草材料。
[0265]
在一个方面中，熟化烟草材料包括选自以下的烟草材料：叶材料、茎材料、芽材料、花材料和根材料。
[0266]
在一个方面中，本文提供的熟化烟叶选自以下：晾制熟化烟叶、明火烤制熟化烟叶、晒制熟化烟叶和烤制熟化烟叶。在另一个方面中，本文提供的熟化烟草材料选自以下：晾制熟化烟草材料、明火烤制熟化烟草材料、晒制熟化烟草材料和烤制熟化烟草材料。在一个方面中，熟化烟叶来自选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、东方烟品种和土耳其烟品种。在另一个方面中，熟化烟草材料来自选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0267]
发酵的典型特征是初始水分含量高、产生热量和干重损失10％到20％。参见，例如，美国专利号4,528,993、4,660,577、4,848,373、5,372,149；美国专利公开号2005/0178398；以及tso(1999,chapter 1 in tobacco,production,chemistry and technology,davis&nielsen,eds.,blackwell publishing,oxford)。可以进一步对熟化、陈化和发酵的烟草进行加工(例如，切割、切碎、膨化或混合)。参见，例如，美国专利号4,528,993；4,660,577；4,987,907。在一个方面中，本公开提供了来自本文提供的任何烟草植物的发酵的烟草材料。
[0268]
从本公开的烟草品系、品种或杂种获得的烟草材料可用于制造烟草产品。如本文所用，“烟草产品”被定义为任何由烟草制成或衍生的供人类使用或消费的产品。在一个方面中，本公开提供了一种烟草产品，其包含来自本文提供的烟草植物的植物材料。在另一个方面中，本公开提供了一种包含熟化烟草材料的烟草产品。在另一个方面中，本公开提供了一种包含发酵的烟草材料的烟草产品。
[0269]
本文提供的烟草产品包括但不限于卷烟产品(例如，卷烟和比迪烟)、雪茄产品(例如，雪茄包皮烟和小雪茄)、烟斗烟产品、衍生自烟草的产品、来自烟草的烟碱产品、无烟烟草产品(例如，湿鼻烟、干鼻烟、嚼烟)、膜、可嚼的、标签、成形部分、凝胶、消费品单元、不溶性基质、中空形状、再造烟草、膨化烟草等。参见例如美国专利公开号us 2006/0191548。
[0270]
如本文所用，“卷烟”是指具有“棒”和“填料”的烟草产品。卷烟“棒”包括卷烟纸、滤嘴、滤棒(用于容纳过滤材料)、将卷烟纸(包括填料)固定在滤嘴上的接装纸，以及将这些部件固定在一起的所有胶水。“填料”包括(1)所有烟草，包括但不限于再造烟草和膨化烟草，(2)非烟草替代品(包括但不限于草药、非烟草植物材料和可能伴随烟草卷入卷烟纸的其他香料)，(3)外壳，(4)调味料，和(5)(混入烟草和替代品并卷入卷烟的)所有其他添加剂。
[0271]
如本文所用，“再造烟草”是指加工成片状并切成条状以模拟烟草的由烟草粉末和其他烟草废料制成的一部分烟草填料。除了节省成本之外，再造烟草由于通过使用氨和糖之间的反应加工风味发展有助于香烟味道的贡献而非常重要。在一个方面中，本文提供的烟草产品包括再造烟草。
[0272]
如本文所用，“膨化烟草”是指一部分烟草填料，其通过合适气体的膨胀进行处理，使得烟草“膨化”，导致密度降低和填充能力增加。其减少了卷烟中使用的烟草的重量。在一个方面中，烟草产品包括膨化烟草。
[0273]
来自本公开的植物的烟草产品还包括卷烟和其他吸烟产品，特别是那些包括过滤元件的吸烟产品，其中可吸烟材料棒包括烟草混合物中的熟化烟草。在一个方面中，本公开的烟草产品选自小雪茄、未通气的凹槽过滤嘴香烟、通气的凹槽过滤嘴香烟、雪茄、鼻烟、烟斗烟草、雪茄烟草、卷烟烟草、咀嚼烟草、烟叶、水烟烟草、切碎的烟草和生切烟丝。在另一个方面中，本公开的烟草产品是无烟烟草产品。无烟烟草产品不燃烧，并且包括但不限于咀嚼烟草、潮湿无烟烟草、鼻烟和干鼻烟。嚼烟是粗分的烟叶，其通常包装在大袋状包装中并用于塞子或捻。潮湿无烟烟草是一种潮湿的、更细分的烟草，以松散的形式或以小袋的形式提供，并且通常包装在圆形罐中并用作夹(pinch)在或放置在成人烟草消费者的脸颊和牙龈之间的小袋中。鼻烟是经过热处理的无烟烟草。干鼻烟是放在嘴里或用于鼻腔的精细研磨的烟草。在另一个方面中，本公开的烟草产品选自以下：电子加热的卷烟、电子烟和电子雾化装置。
[0274]
在一个方面中，无烟烟草产品选自以下：散叶咀嚼烟草、塞式咀嚼烟草、湿鼻烟、鼻烟、干鼻烟和口含烟。
[0275]
在一个方面中，本公开的烟草产品可以是混合烟草产品。
[0276]
在另一个方面中，本公开提供了一种烟草混合物，其包含熟化烟草材料。烟草混合物可以包含熟化烟草、非熟化烟草、发酵烟草、未发酵烟草、膨化烟草和再造烟草的任何组合。
[0277]
在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少5％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少10％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少15％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少20％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少25％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少30％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少35％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少40％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少45％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少50％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少55％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少60％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少65％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少70％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少75％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少80％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少85％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少90％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以重量计至少95％的熟化烟草。
[0278]
在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少5％的熟化烟草。
[0279]
在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少10％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少15％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少20％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少25％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少30％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以
体积计至少35％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少40％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少45％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少50％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少55％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少60％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少65％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少70％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少75％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少80％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少85％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少90％的熟化烟草。在一个方面中，烟草混合物包含以体积计至少95％的熟化烟草。
[0280]
序列
[0281]
如本文所用，关于两个或更多个核苷酸或氨基酸序列的术语“同一性百分比”或“相同百分比”通过以下方式计算：(i)在比较窗口(一个或多个“可比对”区域)上比较两个最佳比对的序列(核苷酸或氨基酸)，(ii)确定在两个序列中出现同一的核酸碱基(对于核苷酸序列)或氨基酸残基(对于蛋白和多肽)的位置数以产生匹配位置数，(iii)将匹配位置数除以比较窗口中总位置数，然后(iv)将该商乘以100％以产生同一性百分比。如果“同一性百分比”是在没有指定特定比较窗口的情况下相对于参考序列计算的，那么通过将比对区域上匹配位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本技术的目的，当将两个序列(查询和主题)最佳比对(在其比对中允许空位)时，查询序列的“百分比同一性”等于两个序列之间相同位置数除以查询序列在其长度(或比较窗口)上的总位置数，然后乘以100％。
[0282]
当参照氨基酸使用序列同一性百分比时，一般认为不同一的的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，因此不改变分子的功能性质。当序列的保守取代不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性。由于这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。
[0283]
为了对序列进行最佳比对以计算它们的同一性百分比，各种成对或多重序列比对算法和程序是本领域已知的，例如可用于比较两个或多个核苷酸或氨基酸序列之间的序列同一性或相似性的clustalw或基于局部比对算法的搜索(blast
tm
)等。尽管其他比对和比较方法是本领域已知的，但是两个序列之间的比对和同一性百分比(包括上述同一性百分比范围)可以通过clustalw算法测定，参见例如，chenna等，“multiple sequence alignment with the clustal series of programs,”nucleic acids research 31:3497-3500(2003)；thompson等，“clustal w:improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice,”nucleic acids research 22:4673-4680(1994)；larkin ma等，“clustal w and clustal x version 2.0,”bioinformatics 23:2947-48(2007)；和altschul等，“basic local alignment search tool.”j.mol.biol.215:403-410(1990)，其全部内容和公开内容通过引用并入本文。
[0284]
如本文所用，关于两个核苷酸序列的术语“互补性百分比”或“互补百分比”类似于同一性百分比的概念，但是是指当查询序列和主题序列线性排列并且最佳碱基配对而没有
二级折叠结构(如环、茎或发夹)时，与主题序列的核苷酸最佳碱基对或杂交的查询序列的核苷酸的百分比。这种互补性百分比可以在两条dna链、两条rna链或一条dna链和一条rna链之间。“互补性百分比”可以通过以下方式计算：(i)在比较窗口上以线性和完全延伸的排列(即，没有折叠或二级结构)最佳碱基配对或杂交两个核苷酸序列，(ii)在比较窗口上确定两个序列之间的碱基对位置数以产生互补的位置数，(iii)将互补的位置数除以比较窗口中总位置数，和(iv)将该商乘以100％以得到两个序列的互补性百分比。两个序列的最佳碱基配对可以基于核苷酸碱基的已知配对，例如g-c、a-t和a-u，通过氢结合来确定。如果相对于参考序列计算“互补性百分比”而不指定特定的比较窗口，那么通过将两个线性序列之间的互补的位置数除以参考序列的总长度来确定同一性百分比。因此，为了本技术的目的，当两个序列(查询和主题)是最佳碱基配对(允许错配或非碱基配对的核苷酸)时，查询序列的“互补性百分比”等于两个序列之间碱基配对位置数除以查询序列在其长度上的总位置数，然后乘以100％。
[0285]
使用术语“多核苷酸”或“核酸分子”并非旨在将本公开限制为包含脱氧核糖核酸(dna)的多核苷酸。例如，还设想了核糖核酸(rna)分子。本领域普通技术人员将意识到多核苷酸和核酸分子可以包括核糖核苷酸以及核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成类似物。本公开的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，其中包括但不限于单链形式、双链形式、发夹、茎环结构等。在一个方面中，本文提供的核酸分子是dna分子。在另一个方面中，本文提供的核酸分子是rna分子。在一个方面中，本文提供的核酸分子是单链的。在另一个方面中，本文提供的核酸分子是双链的。核酸分子可以编码多肽或小rna。
[0286]
如本文所用，“重组核酸”是指通过遗传重组的实验室方法(例如但不限于分子克隆)形成的核酸分子。
[0287]
可以使用本领域常规技术分离核酸。例如，可以使用任何方法分离核酸，所述方法包括但不限于，重组核酸技术，和/或聚合酶链反应(pcr)。一般pcr技术被描述在例如pcr primer:a laboratory manual,dieffenbach&dveksler,eds.,cold spring harbor laboratory press,1995中。重组核酸技术包括，例如，限制性酶消化和连接，其可用于分离核酸。分离的核酸也可以化学合成，或者作为单个核酸分子，或者作为一系列寡核苷酸。多肽可以通过已知方法例如deae离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石层析从天然来源(例如，生物样品)中纯化。例如，还可以通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。此外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。可以使用任何适合的方法来测量多肽的纯度，例如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或hplc分析。
[0288]
在一个方面中，本公开提供了检测植物细胞中重组核酸和多肽的方法。不受限制地，也可以使用杂交来检测核酸。在sambrook等(1989,molecular cloning:a laboratory manual，第2版，cold spring harbor laboratory press,cold spring harbor,ny)中详细讨论了核酸之间的杂交。
[0289]
在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少70％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少75％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少80％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。
在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少85％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少90％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少95％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少96％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少97％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少98％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有至少99％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。在一个方面中，本文提供的核酸序列与选自以下的序列具有100％同一性：seq id no:1-27、34-42、44、45、48和49。
[0290]
如本文所用，术语“多肽”指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可以是由本文提供的多核苷酸编码的。本文提供的蛋白可以由本文提供的核酸分子编码。蛋白可以包含本文提供的多肽。如本文所用，“蛋白”指能够为细胞提供结构或酶活性的氨基酸残基的链。
[0291]
可以使用抗体检测多肽。使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(elisa)、western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可以使用本领域熟知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和性的抗体。可以使用本领域熟知的方法将本文提供的抗体附接至固体支持物，如微量滴定板。
[0292]
可以使用可检测标记完成检测(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的检测)。术语“标记”旨在涵盖直接标记和间接标记的使用。可检测标记包括酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。
[0293]
在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少70％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少75％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少80％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少85％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少90％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少95％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少96％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少97％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少98％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列至少99％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。在一个方面中，本文提供的氨基酸序列与选自以下的序列100％同一性或相似：seq id no:28-33、46、47和50。
[0294]
设想了以下示例性、非限制性实施方案：
[0295]
1.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含在多核苷酸中的非天然突变，所述多核苷酸与选自以下的核苷酸序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或100％同一性：seq id no:18、16、17、19-21和48，其中所述修饰的烟草植物包含浅
黄色表型，并且其中所述突变是与相同烟草品种的对照烟草植物相比的。
[0296]
2.根据实施方案1所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述修饰的烟草植物是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0297]
3.根据实施方案1或2所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述修饰的烟草植物是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8所列的烟草品种的品种。
[0298]
4.根据实施方案1-3中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物或其部分对于所述突变是杂合的。
[0299]
5.根据实施方案1-3中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物或其部分对于所述突变是纯合的。
[0300]
6.根据实施方案1-5中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述修饰的烟草植物是杂种。
[0301]
7.根据实施方案1-6中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述修饰的烟草植物是雄性不育的或细胞质雄性不育的。
[0302]
8.根据实施方案1-7中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非天然突变导致与所述对照植物相比所述基因的表达水平降低。
[0303]
9.根据实施方案1-8中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中与由缺乏所述非天然突变的所述多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，所述非天然突变导致由包含所述非天然突变的所述多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平降低。
[0304]
10.根据实施方案1-7中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非天然突变导致与所述对照烟草植物相比所述基因的表达水平增加。
[0305]
11.根据实施方案1-7或10中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中与由缺乏所述非天然突变的所述多核苷酸编码的蛋白或多肽相比，所述非天然突变导致由包含所述非天然突变的所述多核苷酸编码的蛋白或多肽的活性水平增加。
[0306]
12.根据实施方案1-11中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非天然突变包含在选自以下的序列区域中的突变：启动子、5’utr、内含子、外显子、3’utr、终止子及其任何组合。
[0307]
13.根据实施方案1-12中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非天然突变包含选自以下的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任何组合。
[0308]
14.根据实施方案1-13中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非天然突变包含选自以下的突变：相对于选自seq id no:18、16、17、19-21和48的野生型基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、重复和倒位。
[0309]
15.根据实施方案1-14中任一项所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物包含赋予烟碱水平降低的突变或转基因。
[0310]
16.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述烟草植物是低生物碱烟草植物。
[0311]
17.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述突变包含nic1突变、nic2突变或者两者。
[0312]
18.根据实施方案17所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述nic1突变、所述nic2突变或者两者基因渗入或来源于选自以下的品种：la burley 21、lafc53、ln b&w和ln ky171。
[0313]
19.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述突变包含在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(adc)、甲基腐胺氧化酶(mpo)、nadh脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)、腐胺n-甲基转移酶(pmt)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(qpt)、s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)、a622、nbb1、bbl、myc2、nic1_erf、nic2_erf、乙烯响应因子(erf)转录因子、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。
[0314]
20.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述突变包含在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：erf101、erf110、erfnew、erf199、erf19、erf130、erf16、erf29、erf210和erf91l2。
[0315]
21.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述突变包含在编码选自以下的蛋白的基因或基因座中的突变：erf32、erf34、erf39、erf189、erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168。
[0316]
22.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：天冬氨酸氧化酶、鲱精胺脱亚氨酶(aic)、精氨酸酶、二胺氧化酶、精氨酸脱羧酶(adc)、甲基腐胺氧化酶(mpo)、nadh脱氢酶、鸟氨酸脱羧酶(odc)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶(prai)、腐胺n-甲基转移酶(pmt)、喹啉酸磷酸核糖基转移酶(qpt)、s-腺苷-甲硫氨酸合成酶(sams)、a622、nbb1、bbl、myc2、nic1_erf、nic2_erf、乙烯响应因子(erf)转录因子、烟碱吸收透性酶(nup)和mate转运蛋白。
[0317]
23.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：erf101、erf110、erfnew、erf199、erf19、erf130、erf16、erf29、erf210和erf91l2。
[0318]
24.根据实施方案15所述的修饰的烟草植物或其部分，其中赋予烟碱水平降低的所述转基因包含靶向并抑制编码选自以下的蛋白的基因的转基因：erf32、erf34、erf39、erf189、erf115、erf221、erf104、erf179、erf17和erf168。
[0319]
25.一种修饰的烟草植物或其部分，其包含重组核酸构建体，所述构建体包含与编码非编码rna分子的多核苷酸可操作地连接的异源启动子，其中所述非编码rna分子能够结合至编码氨基酸序列的rna，所述氨基酸与选自以下的氨基酸序列具有至少80％序列同一性：seq id no:28-33、46、47和50，其中所述非编码rna分子抑制所述氨基酸序列的表达，并且其中所述修饰的烟草植物包含浅黄色表型。
[0320]
26.根据实施方案25所述的修饰的烟草植物或其部分，其中所述非编码rna分子是microrna分子。
[0321]
27.来自实施方案1-25中任一项所述的烟草植物的熟化烟草材料。
[0322]
28.根据实施方案27所述的熟化烟草材料，其中所述熟化烟草材料采用选自以下的熟化工艺制成：烤制熟化、晾制熟化、明火烤制熟化和晒制熟化。
id no:1-5组成的组的基因座的15cm内连锁的。
[0341]
41.根据实施方案37所述的方法，其中步骤(a)的所述烟草植物或烟草种子包含在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的10cm内连锁的标记基因座。
[0342]
42.根据实施方案37所述的方法，其中步骤(a)的所述烟草植物或烟草种子包含在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的5cm内连锁的标记基因座。
[0343]
43.根据实施方案37所述的方法，其中步骤(a)的所述烟草植物或烟草种子包含在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的1cm内连锁的标记基因座。
[0344]
44.根据实施方案37所述的方法，其中步骤(a)的所述烟草植物或烟草种子包含在选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的0.5cm内连锁的标记基因座。
[0345]
45.根据实施方案38所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的500,000个核苷酸内。
[0346]
46.根据实施方案38所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的250,000个核苷酸内。
[0347]
47.根据实施方案38所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的100,000个核苷酸内。
[0348]
48.根据实施方案38所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座位于选自由seq id no:1-5组成的组的基因座的50,000个核苷酸内。
[0349]
49.根据实施方案37或38中任一项所述的方法，其中所述浅黄色表型包括平均至少25％的后代植物的叶子的至少80％变黄。
[0350]
50.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述基因座是seq id no:1。
[0351]
51.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述基因座是seq id no:2。
[0352]
52.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述基因座是seq id no:3。
[0353]
53.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述基因座是seq id no:4。
[0354]
54.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中所述基因座是seq id no:5。
[0355]
55.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述基因分型包括检测一个或多个标记基因座。
[0356]
56.根据实施方案55所述的方法，其中所述一个或多个标记基因座选自以下：一个或多个单核苷酸多态性(snp)标志物、一个或多个插入缺失(indel)标志物、一个或多个简单序列重复(ssr)标志物、一个或多个限制性片段长度多态性(rflp)标志物、一个或多个随机扩增多态性dna(rapd)标志物和一个或多个扩增片段长度多态性(aflp)标志物。
[0357]
57.根据实施方案55所述的方法，其中所述基因分型包括使用寡核苷酸探针。
[0358]
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述寡核苷酸探针包含与选自以下的核酸序列具有至少80％同一性的核酸序列：seq id no:34-42。
[0359]
59.根据实施方案57所述的方法，其中所述寡核苷酸探针与所述标记基因座的多态性核苷酸位置邻近。
[0360]
60.根据实施方案37-49中任一项所述的方法，其中步骤(a)的所述基因分型包括检测单倍型。
[0361]
61.根据实施方案60所述的方法，其中所述单倍型包含至少两种选自以下的snp：在seq id no:1的核苷酸位置121处的鸟嘌呤、在seq id no:2的核苷酸位置121处的鸟嘌
no:4的核苷酸位置121处的胸腺嘧啶以及在seq id no:5的核苷酸位置121处的鸟嘌呤。
[0386]
71.根据实施方案66-69中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性是在seq id no:1的核苷酸位置121处的鸟嘌呤。
[0387]
72.根据实施方案66-69中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性是在seq id no:2的核苷酸位置121处的鸟嘌呤。
[0388]
73.根据实施方案66-69中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性是在seq id no:3的核苷酸位置101处的鸟嘌呤。
[0389]
74.根据实施方案66-69中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性是在seq id no:4的核苷酸位置121处的胸腺嘧啶。
[0390]
75.根据实施方案66-69中任一项所述的方法，其中所述单核苷酸多态性是在seq id no:5的核苷酸位置121处的鸟嘌呤。
[0391]
76.根据实施方案66-75中任一项所述的方法，其中所述烟草植物是选自以下的烟草品种：烤烟品种、浅色烟品种、白肋烟品种、弗吉尼亚烟品种、马里兰烟品种、深色烟品种、品种、东方烟品种和土耳其烟品种。
[0392]
77.根据实施方案66-75中任一项所述的方法，其中所述烟草植物是选自表2、表3、表4、表5、表6、表7和表8所列的烟草品种的品种。
[0393]
78.根据实施方案67所述的方法，其中所述后代植物或种子针对所述非天然突变是杂合的。
[0394]
79.根据实施方案67所述的方法，其中所述后代植物或种子针对所述非天然突变是纯合的。
[0395]
80.根据实施方案67所述的方法，其中所述非天然突变导致与所述对照烟草植物相比所述基因的表达水平降低。
[0396]
81.根据实施方案67所述的方法，其中所述非天然突变导致与所述对照烟草植物相比所述基因的表达水平增加。
[0397]
82.根据实施方案67所述的方法，其中所述非天然突变包含在选自以下的序列区域中的突变：启动子、5’utr、内含子、外显子、3’utr、终止子及其任何组合。
[0398]
83.根据实施方案67所述的方法，其中所述非天然突变包含选自以下的一种或多种突变类型：无义突变、错义突变、移码突变、剪接位点突变及其任何组合。
[0399]
84.根据实施方案67所述的方法，其中所述非天然突变包含选自以下的突变：相对于选自seq id no:16-21和48的野生型核酸序列的一个或多个核苷酸的取代、缺失、插入、重复和倒位。
[0400]
85.根据实施方案66所述的方法，其中所述后代植物或种子与缺乏所述py qtl的第二烟草植物相比包含至少一种烟草特异性亚硝胺(tsna)的水平降低。
[0401]
86.根据实施方案85所述的方法，其中所述至少一种tsna选自以下：n-亚硝基降烟碱和4-(甲基亚硝胺)-l-(3-吡啶基)-l-丁酮、n
’‑
亚硝基安他那品和n
’‑
亚硝基假木贼碱。
[0402]
87.根据实施方案66所述的方法，其中所述后代植物或种子与缺乏所述py qtl的第二烟草植物相比包含增加的usda叶等级指数。
[0403]
现在已经总体上描述了本公开，通过参考以下实施例将更容易理解本公开，所述实施例以说明方式提供，除非另有说明，否则并不旨在限制本公开。
[0404]
实施例
[0405]
实施例1：绘制烟草中的浅黄色(py)基因座
[0406]
已知浅黄色(py)基因座会加速烟草的衰老。然而，烟草基因组内py基因座的位置尚不清楚。
[0407]
为确定py基因座的位置，f2作图种群是由窄叶madole lc(nl madole lc，缺乏py性状)与ti1372(py性状来源)之间的杂交产生的。f2个体通过在打顶后的成熟过程的目视观察以及通过在用乙烯利处理每株植物的叶子之前和之后通过目视观察评分而在田间进行表型评分。见表9-12。将叶子从植物中取出并浸入乙烯利处理(1.2g ai/l)中，使其彻底润湿。
[0408]
在乙烯利处理后连续五天的每一天对叶子进行筛选。乙烯利在植物中转化为乙烯，从而诱导成熟，带有py性状的植物在施用乙烯利后表现出更快或加速的变黄。
[0409]
表9：未处理烟叶的表型评分量表
[0410]
表型评分表型描述是肯定是浅黄色否绝对不是浅黄色？可能是浅黄色，但强度不足以评分为“是”患病由于存在疾病，未确定分数
[0411]
表10：乙烯利处理烟叶的表型评分量表
[0412]
表型评分表型描述0叶子保持深绿色1叶子变为淡绿色，或叶缘变黄2整个叶子都发黄，但仍存在绿色斑点3整个叶子呈亮黄色x未获得评分
[0413]
表11：f2作图个体的表型评分。表9和表10提供了该表中使用的评分的说明。
[0414]
[0415]
[0416]
[0417]
[0418]
[0419][0420]
表12：对照植物的表型评分。表10中提供了该表中使用的评分的描述。所有对照植物是nl madole lc植物。
[0421][0422]
使用定制的烟草公理阵列对在表12中评分的93个f2个体以及亲本系(nl madole lc和ti1372)进行基因分型，该阵列包含位于整个烟草基因组中的大约170,000个snp。将基因型和表型数据结合起来鉴定数量性状基因座以鉴定浅黄色性状的遗传控制。烟草假分子15号染色体上的qtl(py qtl)解释了该分析中确定的py性状变异的75％。py qtl位于公开可用的ssr/微卫星标志物pt51549和pt55414之间。py qtl位于公开可用的ssr/微卫星标志物pt51549和pt55414之间。参见bindler等，“a high density genetic map of tobacco(nicotiana tabacum l.)obtained from large scale microstatellite marker development,”theor.appl.genet.,123:219-230(2011)，其全部内容通过引用并入本文。其他可公开获得的烟草标志物可以参见tong等，“large-scale development of ssr markers in tobacco and construction of a linkage map in flue-cured tobacco,”breed sci.,66:381-390(2016)，其全部内容也通过引用并入本文。
[0423]
实施例2：高通量kasp
tm
测定的设计和验证
[0424]
kasp
tm
是一种基于竞争性等位基因特异性pcr的基因分型分析系统，能够对特定基因座的snp进行双等位基因评分。kasp
tm
引物被设计用于实施例1中鉴定的qtl内的五个snp标志物。见表13。
[0425]
表13：使用kasp
tm
测定的py qtl内的snp。snp位置在表的序列列中用粗体加下划线表示。
[0426]
[0427][0428]
在上文表13中鉴定的snp基因座处筛选实施例1中表型的80个f2个体，以鉴定与py性状相关的snp标志物。见表14。
[0429]
表14：kasp
tm snp标志物结果。基因型列表示在每个py_snp标志物的snp位置处观察到的核苷酸，如上文表13中所述。“？”表示数据不确定。“wt”指野生型或非py基因型。
[0430]
[0431]
[0432]
[0433][0434]
表15提供了本文鉴定的snp标志物的物理位置，与公开可用的标志物pt51549(genbank登录号；pr032530969)、pt55414(genbank登录号pr032533458)、pt50034(genbank登录号pr032529969)和pt53131(genbank登录号pr032531997)比较。
[0435]
表15：在烟草基因组15号染色体上标志物和候选基因的物理位置
[0436][0437]
实施例3：负责py性状的候选基因的鉴定
[0438]
在温室中种植深色烟草品种ky171(缺乏py性状)和pyky171(ky171包含从ti1372基因渗入的py性状)和ti1372直到植物达到开花期。在达到开花期后，将所有植物打顶，在打顶后24小时、打顶后48小时、打顶后72小时、打顶后一周和打顶后两周从植物中采集叶子样品。
[0439]
在每个时间点针对每个品种从所有打顶的样品以及非打顶的对照样品收集rna。以每个样品大约60,000,000个双末端读数的深度，在illumina hiseq上对收集的rna进行2x100个核苷酸双末端测序，。
[0440]
根据rnaseq结果，在15号染色体上鉴定出六个候选基因。见表16。g61524不属于py qtl，但在两个测试的烟草品种之间表现出显著变化的表达。
[0441]
表16：候选基因
[0442][0443]
实施例4：已鉴定的候选基因的验证
[0444]
来自在上述f2作图种群中评分的相同种子批次的植物(参见实施例1)被用于追踪上述实施例3中提供的候选基因的表达。用亲本品系作为对照。在由kasp
tm snp标志物结果确定的纯合py、杂合py和wt评分的植物中检测基因表达(参见表14)。每组大约24个f2个体(纯合py、杂合py和wt)被筛选为候选基因表达。
[0445]
使用定量rt-pcr(qpcr)、taqman
tm
基因表达测定和rna seq在叶组织中测量候选基因的表达。在打顶前和打顶后的几个时间点(例如，打顶后24小时、打顶后48小时、打顶后72小时、打顶后一周、打顶后两周)从每个f2个体收集叶组织。此处使用实施例3的rnaseq研究中使用的相同品系。
[0446]
taqman
tm
基因表达测定(引物和探针参见表17)旨在追踪上述实施例3中鉴定出的候选基因的表达。
[0447]
使用qpcr，g61524和g58917的表达在ky171、浅黄色ky171和ti1372中显示是相似的。见图2和图3。然而，与ky171相比，g58899在浅黄色ky171和ti1372中的表达明显较低。见图1。
[0448]
表17：taqman
tm
引物和探针
[0449][0450]
实施例5：过表达候选基因的修饰的烟草植物的转化和再生
[0451]
表现出与py性状相关的表达增加的候选基因(例如，ti1372，对于py性状是纯合的f2个体)在非py背景(例如，nl madole nc)中过表达，并观察到产生的表型。
[0452]
将表达载体用作骨架以产生包含重组dna构建体的多个转化载体以过表达候选基因(例如，编码seq id no:28-33、46、47和50的任一个的核酸序列；亦参见seq id no:53和54)。表达载体包含camv 35s启动子、nos终止子以及包含可操作地连接到actin2启动子和nos终止子的卡那霉素选择标志物(npt ii)的盒。通过农杆菌转化将包含目的转基因的核酸载体引入烟草叶盘。参见，例如，mayo等，2006,nat protoc.1:1105-11和horsch等，1985,science227:1229-1231。
[0453]
nl madole lc烟草植物在magenta
tm ga-7盒子中生长，叶盘被切割并放入培养皿中。通过在50ml离心管中以3500rpm离心20ml细胞悬液10分钟来收集包含转化载体的根癌农杆菌细胞。去除上清液，在40ml液体重悬培养基中重悬根癌农杆菌细胞沉淀。避开中脉，用#15剃须刀片将烟草叶切成8个0.6cm的盘，倒置在培养皿中。将含有b5维生素液体重悬培养基的薄层murashige&skoog(ms)添加到培养皿中，并用细尖针均匀地戳叶盘。将约25ml根癌农杆菌悬液添加到培养皿中，并将叶盘在悬液中孵育10分钟。
[0454]
将叶盘转移到共培养培养皿(1/2ms培养基)中，将盘倒置，使其与覆盖在共培养tom培养基(含有30g/l蔗糖的ms培养基；0.1mg/l 1-萘乙酸(naa)；和1mg/l 6-苄基氨基嘌呤(bap))上的滤纸接触。用封口膜密封培养皿，然后在黑暗中孵育两天。
[0455]
孵育后，将叶盘转移到再生/选择tom-hyg培养基培养皿中(tom培养基，加200mg/l头孢噻肟和50mg/l潮霉素)。在24℃下，由叶盘形成的愈伤组织每两周在暗光(在60me/ms和80me/ms之间)下被传代培养至新鲜的tom-hyg培养基中，光周期为18小时光照、6小时黑暗，直到嫩芽(秧苗)成为可切除的。用镊子取出由愈伤组织形成的秧苗并传代培养至ms生根培养基中(含3g/l蔗糖的ms培养基；7g/l葡萄糖；200mg/l头孢噻肟；50mg/l潮霉素)。在24℃下用暗光以及18小时光照、6小时黑暗的光周期孵育ms生根培养基上的嫩芽以诱导生根。
[0456]
当包含嫩芽和根的秧苗长到足够大时(例如，超过magenta
tm ga-7盒子高度的一
半)，将其转移到jiffy泥炭颗粒中以适应生长室。一旦确立，将幼苗转移到温室中进行进一步生长、繁殖和分析。
[0457]
如上文实施例1中所述，通过目视观察或乙烯利筛选来评价所得植物。
[0458]
图4描绘了来自检测过表达g58899(seq id no:24，其编码seq id no:30)的13个t0烟草品系的半定量rt-pcr结果(使用从幼叶中提取的rna)。与野生型(wt)对照相比，一些品系(例如，品系3、11)展现出表达沉默，而其他品系(例如，品系9、12)展现出表达增加。不受任何科学理论的限制，本领域公知单个转基因的多个拷贝的插入可导致基因沉默。
[0459]
图4中测试的t0品系经过表型检测。显示过表达g58899的品系9和12显示完全绿色的叶子。见图5。相反，显示g58899表达降低的品系3和11在老叶中显示出py表型。见图5，黑色箭头。
[0460]
实施例6：候选基因的敲低
[0461]
表现出与py性状相关的表达降低的候选基因(例如，ti1372，对于py性状是纯合的f2个体)是在非py背景(例如，nl madole nc)中表达被敲低或敲除的靶点。
[0462]
产生人工mirna或其他rnai构建体以产生能够降低每个候选基因(例如，seq id no:22-27)的表达的mirna或另一种非编码rna。将人工mirna或rnai构建体插入到受camv 35s启动子控制的质粒中。质粒还包含nos终止子以及包含可操作地连接至actin2启动子和nos终止子的卡那霉素选择标志物(npt ii)的盒。
[0463]
转化烟草叶盘，并使烟草植物再生，如实施例5中所述。
[0464]
在从magenta
tm ga-7盒中取出之前，包含设计为抑制g58899的构建体(seq id no:51和52)的秧苗的一些叶子上开始表现出py表型。见图6；特别是黑色箭头。在表达g58905(seq id no:26)rnai抑制构建体的植物中或在野生型对照中未观察到这一效果。
[0465]
使用从幼株中提取的rna，检测了17个包含g58899抑制构建体的转基因品系的g58899表达水平。见图7。图8描绘了与野生型对照相比，在包含不同水平g58899抑制的植物中观察到的表型。与野生型对照相比，表现出g58899抑制的所有植物在老叶中表现出py表型。
[0466]
实施例7：候选基因的突变
[0467]
表现出与py性状相关的表达降低的候选基因(例如，ti1372，对于py性状是纯合的f2个体)是在非py背景(例如，nl madole nc)中表达被敲低或敲除的靶点。
[0468]
在每个候选基因(例如，seq id no:16-21和48)的基因组序列中产生突变。使用聚乙二醇(peg)利用质粒转染烟草原生质体，所述质粒编码crispr蛋白或者crispr蛋白和靶向特定位置的单个基因的特异性指导rna(grna)。
[0469]
然后将转染的原生质体固定在1％琼脂糖微球中并进行组织培养。当愈伤组织长到直径大约1毫米时，它们被铺在tom2板上。使用片段分析在靶位置对愈伤组织进行突变筛选(例如，插入或缺失(插入缺失))。选择与野生型对照相比显示出尺寸变化的候选用于进一步培养，并通过片段分析再次测试随后的嫩芽，以确认突变的存在。
[0470]
如上文实施例1中所述，通过目视观察或乙烯利筛选来评价所得植物。
[0471]
实施例7：包含浅黄色性状的品种的叶片质量
[0472]
2018年，在美国弗吉尼亚州的田间，从烤烟(表18)、白肋烟(表19)和深色(表20)烟草品种中获得叶片质量值。每个测试包括3或4个随机化区组设计的重复。烘烤完成后进行
分级。每个重复都由经认证的烟叶分级员给出usda等级指数。对几个叶片位置(a至d)中的每一个分别进行分级。在收获时，将叶子分成每三片叶子增量的位置。将前三片叶子(例如，最嫩的叶子)指定为位置“a”，将叶子4至6指定为位置“b”，将叶子7至9指定为位置“c”，将叶子10至12指定为位置“d”，将叶子13至15指定为位置“e”，以此类推到最后一片叶子。
[0473]
表18：烤烟的叶等级指数值。py指包含浅黄色性状的品种。la指包含低生物碱水平的品种。
[0474]
品种位置a位置b位置c位置dk326100959090k32670808080k32635908585k32635808075la fc 53407011la fc 531111la fc 533535301la fc 5310358080py la k326-16085801py la k326-170808080py la k326-150704040py la k326-180908590py la k326-260808585py la k326-260703080py la k326-250808085py la k326-280908090la k32680859585la k326ng9011la k32650708080la k32635858080
[0475]
表19：白肋烟的叶等级指数值。py指包含浅黄色性状的品种。la指包含低生物碱水平的品种。
[0476]
[0477][0478]
表20：深色烟草的叶等级指数值。py指包含浅黄色性状的品种。ln指包含低烟碱水平的品种。ng指未给出等级。
[0479][0480]
实施例8：已鉴定候选基因的其他验证
[0481]
在打顶前(ut)和打顶后24小时(24hr)的烟草品种窄叶madole(nlm；缺乏浅黄色性状)、ds1771(由nlm与ti1327杂交产生的f2种群)、野生型(wt；无浅黄色表型)、针对浅黄色性状的ds1771杂合子(ht)、针对浅黄色性状的ds1771纯合子(hm)和ti1372(浅黄色性状的来源)中进一步检测了候选基因g58899、g58917和g61524的表达。
[0482]
使用在表13中鉴定的snp标志物对ds1771品系进行基因分型，并且如实施例4所
述，在打顶前和打顶后24小时进行表达分析。
[0483]
与nlm和ds1771-wt相比，在品种ds1771-ht、ds1771-hm和ti1372中g58899的表达显著更低。参见图9。g58917和g61524的表达水平在所有品系中相似。分别参见图10和图11。
[0484]
实施例9：g58899的其他序列分析
[0485]
基因g58899显示出与番茄(solanum lycopersicum)stay-green基因(genbank登录号.np_001358338.1；seq id no:43)87.77％的序列同一性。见表16。在番茄中，需要stay-green蛋白在叶片衰老和果实成熟期间触发叶绿素降解。
[0486]
对缺乏py性状的窄叶madole(seq id no:44)和包含py性状的ti1372(seq id no:45)中的g58899的cdna序列进行测序，结果表明这些序列在核苷酸水平上具有100％同一性。因此，由seq id no:44和45编码的氨基酸在蛋白(分别为seq id no:46和47)水平上也具有100％同一性。
[0487]
ti1372cdna(seq id no:45)与内部烟草基因组组装的比对表明最佳匹配是g58899。类似地，窄叶madole cdna(seq id no:44)与内部烟草基因组组装的比对表明最佳匹配也是g58899。
[0488]
tn90品种g58899氨基酸序列(seq id no:30)与拟南芥蛋白叶绿素代谢平衡1(bcm1)和bcm2的比对表明g58899与bcm1(seq id no:55)具有66.21％同一性且与bcm2(seq id no:56)具有64.13％同一性。参见图12。bcm1和bcm2已被证明与防止或减弱叶绿素降解有关。参见wang等，nature communications,11:1254(2020)。
[0489]
nlm g58899氨基酸序列(seq id no:46)、tn90g58899氨基酸序列(seq id no:30)和k326g58899氨基酸序列(seq id no:57)的比对能够鉴定g58899共有氨基酸序列(seq id no:58)。参见图13。
[0490]
实施例10：g58899的表达谱
[0491]
在烟草品系k326、浅黄(py)k326、ky 171、浅黄(py)k171、tn90和浅黄(py)tn 90中使用qpcr检测g58899(seq id no:24)的表达谱。在打顶前和打顶后24小时从叶子中收集rna样品。还检测了g61524(seq id no:27)和g58917(seq id no:25)的表达谱。使用肌动蛋白作为对照。在图14a、图14b和图14c中描绘了结果。