用于肝再生的血浆级分的制作方法

用于肝再生的血浆级分
i.

背景技术：

1.本发明涉及包括疾病的预防和治疗，所述疾病包括与衰老相关的疾病。本发明涉及血液制品的用途，例如血浆和血浆级分来治疗和/或预防与衰老相关的与肝脏生长、维持和再生相关的病症。根据35 u.s.c.
§
119(e)，本技术要求2019年11月20日提交的美国临时专利申请序列第62/937965号；和2020年2月12日提交的美国临时专利申请序列第62/975637号的申请日的优先权；这些申请的公开内容通过引用并入本文。
ii.

技术实现要素：

2.肝衰竭是一个巨大的市场，目前只有一种治疗干预——肝移植。在十分之一的美国人中，大约3500万人患有某种形式的肝脏疾病。由于日益肥胖的人群中肝硬化的肝病盛行，这一数字正在增加。nafld(非酒精性脂肪肝病)是导致肝硬化的主要危险因素，可最终导致肝衰竭。由于普通人群的健康状况下降，可供移植的器官数量很少。结果，肝移植名单上只有约1/3的患者接受了移植。该名单通常不包括65岁以上的患者，因为与器官移植相关风险增加是与衰老相关的。对于等待肝移植的肝硬化患者，统计数据尤其可怕。美国每年有300000例基于肝硬化的住院治疗，36000例肝硬化死亡，其中一半以上的患者不符合移植条件。替代治疗方法的可用性可显著影响大部分本来无法获得治疗的肝脏疾病患者。
3.肝衰竭可以是急性或慢性的。急性肝衰竭通常由病毒感染(例如乙型和丙型肝炎)、过度使用药物或毒素(例如对乙酰氨基酚)以及代谢或血管疾病例如自身免疫性肝炎和威尔逊病引起。慢性肝衰竭通常归类为肝硬化，并且可由病毒感染、酗酒、nafld(由肥胖、高胆固醇和甘油三酯以及高血压引起)、自身免疫性疾病、管道例如从肝脏到肠道的胆管的阻塞或损坏、接触毒素或某些药物、寄生虫、心力衰竭导致肝脏中的血液积聚引起。
4.如上所述，可以对肝衰竭进行肝切除和移植，而移植更通常是针对慢性肝衰竭进行的。此外，这些过程可用于原发性和继发性恶性肿瘤(即癌症)。肝切除和移植的改善结果与对术前、围术期和术后护理的关注有关。(wrighton lj等人,j gastrointest oncol.,3(1):41-47,(2012))。这些包括外科手术和麻醉技术的进步、对肝脏生理学的更好理解、营养支持、血糖的控制和术后感染的减少。(同前。)在肝移植的情况下，最常用的是免疫抑制剂。主治医师在处理肝排斥反应以及治疗长期并发症如高血压和肥胖方面的作用一直是改善预后的重要部分。(参见,issa dh,cleveland clinic j of med.,82(6):361-72(2015))。
5.仍然严重缺乏新疗法来改善肝衰竭和/或接受切除或移植的患者的预后。此外，即使在肝移植手术的情况下，也没有足够的供体肝脏供所有患者使用。(例如，参见指出“移植的问题是器官分配。”的helwick c,the asco post,(sep 25,2017))
6.正在研究用于治疗肝硬化的一种化合物是白蛋白。这是为了弥补因肝硬化自身白蛋白产量的减少而导致的白蛋白产量的损失。基本原理是白蛋白有助于替代渗透压、结合有毒物质、调节体内平衡并起到抗炎作用。(carvalho jr等人,annals of hepatology,17(4):547-60(2018))。因此，该领域的常规想法是白蛋白越纯，浓度越高，产生的功效越好。
治疗性白蛋白通常通过血浆分级分离产生。分级分离可以产生白蛋白溶液，尽管其中含有不需要的蛋白质“污染物”或“杂质”。
7.本发明提供了使用血浆级分来改善和加速肝脏疾病患者患病、切除或移植肝脏的恢复的新疗法。此外，由于肝脏是唯一能够再生的内脏器官，本发明提供了刺激现有肝脏增殖和再生的方法，例如，在一些与肝脏相关的适应症中，这可以促进手术的恢复。此外，本发明利用衍生自血浆分级分离的被认为是“污染物”或“杂质”的物质来更有效地治疗肝脏疾病。
8.iii.通过引用并入
9.本说明书中所提及的所有出版物以及专利申请通过引用并入本文，引用的程度相当于每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指出通过引用并入。
iv.附图说明
10.图1示出了高脂饮食(“hfd”)的20月龄的c57bl/6小鼠体重进展的图。hfd 8.5周后，小鼠体重显著增加。
11.图2是如图1所述的小鼠肝脏的油红o染色。与正常饮食的小鼠相比，hfd的小鼠出现脂肪肝。
12.图3示出了评估ppf1对患有脂肪肝的20月龄c57bl/6小鼠的影响的实验设计。在用ppf1或载剂连续7天处理之前，将小鼠置于60％高脂饮食中7周。在最后一剂ppf1或载剂后的第二天进行手术(70％肝切除术)，并在肝切除术期间取出术前的正中叶和左叶(切除的)。肝切除术后48小时收获右叶和尾状叶(残余的)。
13.图4确定了如图3所述处理的小鼠70％肝切除术产生的切除的叶和残余的叶。
14.图5示出了在如图3所述处理的经载剂和经ppf1处理的肝切除小鼠中的肝脏切除部分的重量与体重比率的测定结果。
15.图6示出了在如图3所述处理的经载剂和经ppf1处理的小鼠中的肝脏切除部分的重量。
16.图7是示出了在肝切除术前在经ppf1处理的hfd的小鼠中血清alt水平正常且不受影响的图。
17.图8示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的小鼠中肝脏重量与体重比率的测定结果。
18.图9示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的小鼠中的肝脏重量。
19.图10示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的小鼠中的血清alt水平的结果。
20.图11报告了肝切除术后的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送，并通过edu阳性细胞的click-it标记来追踪增殖率。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的edu阳性细胞数。
21.图12报告了通过每个视野的ki67阳性细胞数测量的肝切除术后48小时的细胞增殖。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的ki67阳性细胞数。
22.图13报告了通过qpcr基因表达的残肝中的细胞增殖率。示出了细胞周期标志物细
胞周期蛋白b1的相对表达。在残肝切片中，经ppf1处理的小鼠与经载剂处理的小鼠相比，细胞周期蛋白b1的表达显著上调。
23.图14a至图14d报告了若干个标志物在切除的肝脏中的qpcr表达。示出了细胞周期标志物细胞周期蛋白b1(图14a)、细胞周期蛋白a2(图14b)和ki67(图14c)的相对表达。在作为术前对照的肝切除术期间取出的切除肝脏切片中，与具有所有三种细胞周期标志物的载剂对照相比，ppf1令人惊讶地显著地增加了细胞增殖。图14d报告了切除肝脏切片中tnfα的相对表达水平。已知tnfα通过在肝脏再生过程中驱动肝细胞增殖来促进功能性肝脏质量的恢复。
24.图15示出了如图14c中报告的切除肝脏中ki67免疫染色的代表性图像，这证实了与载剂对照相比，经ppf1处理的切除肝脏具有明显更高数量的ki67阳性细胞。
25.图16报告了来自图15的免疫染色的量化，示出了经ppf1处理的切除肝脏中ki67阳性细胞的数量的增加。
26.图17是示出了接受肝切除术的动物总数以及每种处理的存活率的图表。
27.图18示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个代表性共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织学切片用gfap抗体(星形细胞标志物)染色，并观察edu与gfap的共定位水平。根据edu和gfap之间缺乏共定位确定在星形细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
28.图19示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个代表性共聚焦显微镜视野(参见图3)。用cd68抗体(库普弗细胞标志物)对组织切片进行染色，并观察edu与cd68的共定位水平。根据edu和cd68之间缺乏共定位确定在库普弗细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
29.图20示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的代表性共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用hnf4a抗体(肝细胞标志物)染色，并观察edu与hnf4a的共定位水平。根据edu和hnf4a之间缺乏共定位确定在肝细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
30.图21示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的代表性共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用cd3抗体(t细胞标志物)染色，并观察edu与cd3的共定位水平。根据edu和cd3之间缺乏共定位确定在t细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
31.图22示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个代表性共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用cd31抗体(窦内皮细胞标志物)染色，并观察edu与cd31的共定位水平。根据edu和cd31之间的阳性共定位确定ppf1施用引起的细胞增殖与肝窦内皮细胞(lsec)相关。箭头指示包含edu阳性细胞的lsec。
32.图23示出了评估ppf1(血浆级分“pf”)和重组人白蛋白(rhalbumin)对20月龄的c57bl/6小鼠的影响的实验设计。在用ppf1、rhalbumin或载剂连续7天处理之前，将小鼠置于60％高脂饮食中8周。在最后一剂ppf1、rhalbumin或载剂后的第二天进行手术(70％肝切除术)，并在肝切除术期间取出术前的正中叶和左叶(切除的)。肝切除术后48小时收获右叶和尾状叶(残余的)。
33.图24报告了通过每个视野的ki67阳性细胞数测量的肝切除术后48小时的在切除的肝脏中的细胞增殖。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的ki67阳性细胞数。相比之下，经rhalbumin处理的动物与经载处理的动物没有显著差异。
34.图25报告了肝切除术后残肝中的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送，并通
过点击化学追踪增殖率。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的edu阳性细胞数。相比之下，与经载剂处理的动物相比，经rhalbumin处理的动物表现出不那么显著的增殖趋势。
35.图26示出了评估ppf1和has1对20月龄的c57bl/6小鼠的影响的实验设计。在用不同的血浆级分(pf)ppf1和has1或载剂连续7天处理之前，将小鼠置于60％的高脂饮食中8周。在经最后一剂ppf1、has1或载剂处理后的第二天进行手术(70％肝切除术)，并在肝切除术期间取出术前的正中叶和左叶(切除的)。肝切除术后48小时收获右叶和尾状叶(残余的)。
36.图27报告了肝切除术后24小时的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送。与残肝中的载剂相比，ppf1和has1都显著地增加了edu阳性细胞数。
37.图28示出了肝切除术后48小时的细胞增殖率。对肝切除术后48小时取出的残肝进行ki67免疫染色。虽然与对照动物相比，ppf1和has都显著增加了细胞增殖，但与经has1处理的动物相比，ppf1也显著诱导了更多的增殖。
38.图29示出了在最后一次给药后2小时评估ppf1对20月龄的c57bl/6小鼠的影响的实验设计。
39.图30示出了对如上述图29所述处理的小鼠的tnfα基因表达分析结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物通过qpcr显著地增加了tnfα基因表达。
40.图31示出了对如上述图29所述处理的小鼠的ki67免疫染色分析结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物在最后一次给药后2小时显著地增加了ki67阳性细胞，表明ppf1增加了肝细胞增殖。
v.具体实施方式
41.a.介绍
42.本发明涉及肝脏病症或疾病的治疗。包括血浆分级分离产物在内的血浆级分经证实在肝切除术后诱导肝脏恢复方面具有明显的活性。另外，血浆级分经证实激活静止和完整肝脏中的细胞增殖(肝切除术之前)。与全血浆血清相比，血浆级分具有若干优点，因为血浆分级分离过程可除去有问题的凝结因子以及消除对交叉配血的需要。另外，在某些分析中，与年轻血浆相比，血浆级分已在功效方面表现出出人意料的改善(参见，例如，美国专利申请第15/499694号和美国专利申请第16/432114号；二者均通过引用整体并入本文)。因此，从全血浆血清预测血浆分级分离产物的功效不具有合理可预测性。
43.在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于所述的特定方法或组合物，因而，当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并且不旨在是限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。
44.本文所论述的出版物仅针对它们在本技术提交日之前的公开内容而提供。本文中的任意信息都不应解释为承认本发明因为在先发明而不能先于这些出版物。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，实际的公开日可能需要独立地进行确认。
45.在提供数值范围的情况下，应理解的是，还明确地公开了该范围的上限与下限之间的每个中间值，至下限单位的十分之一，除非本文另外清楚地规定。在所述范围中的任意所述值或中间值与在该所述范围中的任意其他所述值或中间值之间的各个较小范围涵盖
在本发明内。这些较小范围的上下限可被独立地包括在所述范围中或排除在所述范围外，并且当每个范围的两个界限之一、都不或两者包括在所述较小范围中时该范围也涵盖在本发明内，除非所述范围中存在任意明确排除了的限值。当所述范围包含所述限值之一或两者时，则排除这些所含限值之一或两者的范围也包括在本发明内。
46.还应指出，可撰写权利要求来排除任意任选的要素。因而，这种陈述旨在充当结合权利要求要素的叙述来使用例如“仅仅”、“仅”等此类排他性术语或使用“否定”限制的前提基础。
47.本领域技术人员在阅读本公开时将明白，本文所述且说明的各个个别实施方案具有离散组分和特征，所述组分和特征可容易地与任意其他若干实施方案的特征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任意所陈述方法均可以所陈述事件的顺序或以逻辑上可能的任意其他顺序进行。
48.b.定义
49.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与由本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然在实践或测试本发明时可使用与本文所描述的那些类似或等效的任意方法和材料，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。本文中提及的所有出版物均通过引用并入本文以公开和描述与引用的公开相关的方法和/或材料。应理解，如果有矛盾，本公开取代所并入出版物的任意公开内容。
50.必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，除非上下文另有明确说明，否则不使用数量词包括复数指示物。因此，例如，本领域技术人员知道提及“细胞”包括多个此类细胞，提及“肽”包括提及一种或多于一种肽及其等效物，例如多肽，诸如此类。
51.在描述本发明的方法时，术语“宿主”、“对象”、“个体”和“患者”可互换使用，并且是指需要根据所公开的方法治疗的任意哺乳动物。哺乳动物包括例如人，绵羊、牛、马、猪、犬、猫、非人灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，对象是非人哺乳动物。在一些实施方案中，对象是家畜。在其他实施方案中，对象是宠物。在一些实施方案中，对象是哺乳动物。在某些实施方案中，对象是人。其他对象可包括家养宠物(例如，狗和猫)、牲畜(例如，牛、猪、山羊、马等)、啮齿动物(例如，小鼠、豚鼠和大鼠，例如，如在疾病的动物模型中)以及非人灵长类动物(例如，黑猩猩和猴)。因而，本发明的对象可包括但不限于哺乳动物，例如，人和其他灵长类动物，例如黑猩猩以及其他猿和猴物种等，其中在某些实施方案中对象是人。术语对象还意指包括任意年龄、体重或其他身体特征的人或生物体，其中对象可以是成人、儿童、婴儿或新生儿。
[0052]“年轻人”或“年轻个体”是指按时序年龄为40岁或小于40岁，例如35岁或小于35岁，包括30岁或小于30岁，例如25岁或小于25岁，或22岁或小于22岁的个体。在一些情况下，充当包含年轻血浆的血液制品的来源的个体是10岁或小于10岁，例如5岁或小于5岁，包括1岁或小于1岁的个体。在一些情况下，对象是新生儿，并且血浆制品的来源是脐带，其中血浆制品是从新生儿的脐带收获的。因而，“年轻”和“年轻个体”可以指0岁至40岁的对象，例如0岁、1岁、5岁、10岁、15岁、20岁、25岁、30岁、35岁或40岁的对象。在其他情况下，“年轻”和“年轻个体”可以指生物学(与时序不同的)年龄，例如未曾表现出在较年长的个体中表现出的血浆中的炎性细胞因子水平的个体。相反地，“年轻”和“年轻个体”可以指生物学(与时序不同的)年龄，例如相较于较年长的个体中的抗炎细胞因子水平表现出更高的抗炎细胞因子
水平的个体。作为示例而非限制，炎性细胞因子是嗜酸性粒细胞活化趋化因子，并且年轻对象或年轻个体与老年个体之间的倍数差异至少为1.5倍。类似地，老年个体与年轻个体之间的其他炎性细胞因子的倍数差异可用于指代生物学年龄。(参见美国专利申请第13/575437号，其通过引用并入本文)。通常，个体是健康的，例如，个体在采集时没有恶性血液病或自身免疫性疾病。
[0053]
如本文中所用，“治疗”是指(i)预防疾病或病症或(ii)减轻或消除疾病或病症的症状中任一项。治疗可以预防性地(在肝病或肝衰竭发作之前)进行并且包括：(a)防止对象发生病症；(b)抑制病症，即阻止病症发生；或(c)缓解病症，即使病症消退。治疗可引起多种不同的身体表现，例如，基因表达的调节、组织或器官的恢复活力、炎症减少等。治疗剂可以在病症发作之前、期间或之后施用。可在病症的症状期期间施用目标疗法，并且在某些情况下，在病症的症状期之后施用目标疗法。治疗还可以通过在肝切除或移植之前、肝切除/移植期间和/或肝切除/移植之后施用干预如血浆、血浆级分或包含血浆组分的血液制品来进行。
[0054]
与肝功能、再生或恢复相关的“改善”、“提高”或“增加”是指使用本领域已知的标准方法测量的肝功能的任意明显的增加。作为示例而非限制，这可以包括测量某些蛋白质的血液水平，例如丙氨酸转氨酶(alt)、天冬氨酸转氨酶(ast)、碱性磷酸酶(alp)、白蛋白和总蛋白、胆红素、γ-谷氨酰转移酶(ggt)，l-乳酸脱氢酶(ld)，凝血酶原时间(pt)。所述蛋白质的正常水平的实例可以是：alt(7u/l至55u/l)；ast(8u/l至48u/l)；alp(40u/l至129u/l)；白蛋白(3.5g/dl至5.0g/dl)；总蛋白(6.3g/dl至7.9g/dl)；胆红素(0.1毫克/分升至1.2毫克/分升)；ggt(8u/l至61u/l)；ld(122u/l至222u/l)；和pt(9.4秒到12.5秒)。
[0055]
包含血浆组分的血液制品。在实施目标方法时，将包含血浆组分的血液制品施用于有需要的个体，例如患有以下病症中的一种或多于一种的个体：肝病或肝衰竭。因而，根据本发明的实施方案的方法包括将包含来自个体(“供体个体”或“供体”)的血浆组分的血液制品施用于患有以下病症中的一种或多于一种的个体：肝病或肝衰竭(“受体个体”或“受体”)。“包含血浆组分的血液制品”意指源自血液的包含血浆的任意产品(例如全血、血浆或其级分)。术语“血浆”按其常规含义使用，是指血液的淡黄色/浅黄色液体组分，其由约92％的水、7％的蛋白质，例如白蛋白、γ球蛋白、抗血友病因子和其他凝血因子，以及1％的矿物质盐、糖、脂肪、激素和维生素组成。适用于目标方法的含血浆的血液制品的非限制性实例包括用抗凝剂(例如edta、柠檬酸盐、草酸盐、肝素等)处理过的全血、通过过滤全血以除去白细胞(“白细胞去除”)而产生的血液制品、由血浆除去法来源的(plasmapheretically-derived)或单采血浆法来源的(apheretically-derived)血浆组成的血液制品、新鲜冷冻血浆、基本上由纯化血浆组成的血液制品以及基本上由血浆级分组成的血液制品。在一些情况下，所使用的血浆制品是非全血浆制品，这意味着该制品不是全血，因此至少相对于在全血中存在的成分的程度上，该制品缺乏全血中发现的一种或多于一种组分，例如红细胞、白细胞等。在一些情况下，血浆制品如果不是完全无细胞的，则基本上是无细胞的，其中在此类情况下，细胞含量可以为5体积％或小于5体积％，例如1％或小于1％，包括0.5％或小于0.5％，其中在一些情况下无细胞血浆级分是完全缺乏细胞的组合物，即它们不包括细胞。
[0056]
包含血浆组分的血液制品的收集。本文描述的方法的实施方案包括施用包含血浆
组分的血液制品，所述血浆组分可源自供体，包括人志愿者。术语“源于人的”可以指此类制品。从供体收集包含血浆的血液制品的方法是本领域公知的。(参见，例如，aabb technical manual,(mark a.fung等人,eds.,18th ed.2014)，其通过引用并入本文)。
[0057]
在一个实施方案中，捐献是通过静脉穿刺获得的。在另一个实施方案中，静脉穿刺仅是单个静脉穿刺。在另一个实施方案中，不使用盐水体积置换。在优选实施方案中，将血浆除去法过程用于获得包含血浆的血液制品。血浆除去法可包括除去根据重量调整的体积的血浆，并使细胞组分返回供体。在优选实施方案中，在血浆除去法过程中使用柠檬酸钠以防止细胞凝结。在施用柠檬酸盐后，从供体收集的血浆的体积优选为690ml至880ml，并且优选与供体的重量相协调。
[0058]
c.血浆级分
[0059]
第二次世界大战期间产生了对士兵丧失大量血液时可用于战场的稳定的血浆扩容剂的需要。因此，开发了制备冻干血浆的方法。然而，由于复溶需要无菌水，因此在战斗情况下很难使用冻干血浆。作为替代方案，e.j.cohn博士建议可以使用白蛋白，并制备了可立即引入用于治疗休克的即时可用的稳定溶液。(参见johan,current approaches to the preparation of plasma fractions in(biotechnology of blood)165(jack goldstein ed.,1st ed.1991))。cohn博士的纯化血浆级分的方法利用冷乙醇的变性作用，并利用ph和温度的变化来实现分离。
[0060]
本文所述方法的实施方案包括向对象施用血浆级分。分级分离是籍以将某些蛋白质亚组与血浆分离的方法。分级分离技术是本领域已知的，并且依赖于cohn等人在1940年代开发的步骤。(e.cohn,preparation and properties of serum and plasma proteins.iv.a system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids.68 j am chem soc 459(1946)，其通过引用并入本文)。该过程中涉及若干步骤，每个步骤都涉及导致选择性蛋白质沉淀的特定的乙醇浓度以及ph、温度和渗透摩尔量的改变。沉淀物也通过离心或沉淀分离。最初的“cohn分级分离方法”涉及通过沉淀将蛋白质分离成五个级分，分别称为级分i、级分ii iii、级分iv-1、级分iv-4和级分v。白蛋白是该过程最初鉴定的终点(级分v)产物。根据本发明的实施方案，每个级分(或来自先前分离步骤的流出物)包含或潜在地包含治疗上有用的蛋白级分。(参见thierry burnouf,modern plasma fractionation,21(2)transfusion medicine reviews 101(2007)；adil denizli,plasma fractionation:conventional and chromatographic methods for albumin purification,4 j.biol.&chem.315,(2011)；和t.brodniewicz-proba,human plasma fractionation and the impact of new technologies on the use and quality of plasma-derived products,5 blood reviews 245(1991)，以及美国专利第3869431号、第5110907号、第5219995号、第7531513号和第8772461号，所述文件和美国专利通过引用并入本文)。可以调整上述实验参数以获得特定的蛋白质级分。
[0061]
最近，分级分离已达到进一步的复杂性，并且因而包含本发明的另外的实施方案。最近这种复杂性的增加已通过以下方式发生：引入色谱法，导致从现有级分如冷沉淀物、贫冷沉淀物的血浆(cryo-poor plasma)和cohn级分中分离出新蛋白质；通过整合色谱和乙醇分级分离过程提高igg的回收率；以及病毒减少/灭活/除去(同前)。为了在生理ph和离子强
度下捕获蛋白质，可使用阴离子交换色谱。这保持了蛋白质和/或蛋白质级分的功能活性。肝素和单克隆抗体也用于亲和色谱。另外，使用了通过凝胶过滤的分级分离、通过盐的分级和通过聚乙二醇的分级分离。(hosseini m iran j biotech,14(4):213-20(2016)，其通过引用并入本文)。本领域普通技术人员将认识到，可以调整上述参数和技术以获得特定期望的含蛋白的血浆级分。
[0062]
血浆分级分离也可以是基于硫酸铵的。(参见，例如，odunuga oo，biochem compounds，1:3(2013)；wingfield pt，curr protoc protein sci，appx.3(2001)，通过引用并入本文)。除了获得特定的血液级分外，还采用了基于硫酸铵的分级分离来减少血浆中的大量蛋白质。(saha s等人,j.proteomics bioinform,5(8)(2012)，通过引用并入本文)。
[0063]
在本发明的实施方案中，血浆在工业环境中分级。将冷冻的血浆在1℃至4℃解冻。对解冻的血浆进行连续冷冻离心，并分离出冷沉淀物。将回收的冷沉淀物在-30℃或低于-30℃的温度下冷冻并储存。立即处理贫冷沉淀物(“贫冷”)血浆，以(通过例如初步色谱)捕集不稳定的凝结因子，例如因子ix复合物，及其组分，以及蛋白酶抑制剂，例如抗凝血酶和c1酯酶抑制剂。连续离心和沉淀分离可用于后续步骤。此类技术是本领域普通技术人员已知的，并且描述于例如美国专利第4624780号、第5219995号、第5288853号和美国专利申请第20140343255号和第20150343025号中，其公开内容通过引用整体并入本文)。
[0064]
在本发明的实施方案中，血浆级分可包括含有高浓度的白蛋白的血浆级分。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分可包括含有高浓度的igg或静脉内免疫球蛋白(igiv)(例如)的血浆级分。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分可包括igiv血浆级分，例如已通过本领域普通技术人员公知的方法，例如蛋白a介导的耗尽，基本上耗尽了免疫球蛋白(igg)的(参见keshishian,h.等人，multiplexed,quantitative workflow for sensitive biomarker discovery in plasma yields novel candidates for early myocardial injury,molecular&cellular proteomics,14at 2375-93(2015))。在另外的实施方案中，血浆级分可以是其中基本上所有凝血因子都被除去以便保留级分的功效并降低血栓形成风险的血浆级分。例如，血浆级分可以是2016年8月18日提交的美国专利第62/376529号中描述的血浆级分；其公开内容通过引用整体并入本文。
[0065]
d.白蛋白制品
[0066]
对于本领域普通技术人员而言，白蛋白血浆制品(“app”)有两大类：血浆蛋白质级分(“ppf”)和人白蛋白溶液(“has”)。ppf源自具有比has更高的产率但最低白蛋白纯度低于has(对于ppf，》83％，对于has，》95％)的过程。(production of human albumin solution:a continually developing colloid,p.matejtschuk等人，british j.of anaesthesia 85(6):887-95,at 888(2000))。在一些情况下，ppf的白蛋白纯度为83％至95％，或者为83％至96％。白蛋白纯度可通过电泳或其他定量测定法例如通过光谱法确定。另外，一些人指出，ppf由于存在蛋白质“污染物”例如pka而具有不利方面。同前。因此，ppf制剂已不再作为白蛋白血浆制品普及，甚至已从某些国家的药典中除名。同前。与这些问题相反，本发明有益地利用了这些“污染物”。除了α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白以及上述的pka以外，本发明的方法还利用了“污染物”中的另外的蛋白质或其他因子，所述另外的蛋白质或其他因子促进例如细胞增殖和组织再生。
[0067]
本领域技术人员将认识到，有或已经有数种ppf的商业来源(“商业ppf制剂”)。这些商业来源包括plasma-plex
tm ppf(armour pharmaceutical co.,tarrytown,ny)、plasmanate
tm ppf(grifols,clayton,nc)、plasmatein
tm
(alpha therapeutics,los angeles,ca)和protenate
tm ppf(baxter labs,inc.deerfield,il)。
[0068]
本领域技术人员还将认识到，有或已经有数种has的商业来源(“商业has制剂”)。这些商业来源包括albuminar
tm
(csl behring)、alburx
tm
(csl behring)、albutein
tm
(grifols,clayton,nc)、buminate
tm
(baxatla,inc.,bannockburn,il)、flexbumin
tm
(baxatla,inc.,bannockburn,il)和plasbumin
tm
(grifols,clayton,nc)。
[0069]
1.血浆蛋白质级分(人)(ppf)
[0070]
根据美国食品和药物管理局(“fda”)，“血浆蛋白质级分(人)”或ppf是定义为“源自人血浆的由白蛋白和球蛋白构成的蛋白质的无菌溶液”的制品的专有名称。(联邦法规代码“cfr”21 cfr 640.90，其通过引用并入本文)。ppf的来源材料是从按照21 cfr 640.1
–
640.5(其通过引用并入本文)规定制备的全血或按照21 cfr 640.60
–
640.76(其通过引用并入本文)规定制备的源血浆中回收的血浆。
[0071]
对ppf进行测试，以确定其符合根据21cfr 640.92(其通过引用并入本文)的以下标准：
[0072]
(a)最终制品应为百分之5.0 /-0.30的蛋白质溶液；和
[0073]
(b)最终制品中的总蛋白应由至少百分之83的白蛋白和不超过百分之17的球蛋白构成。γ-球蛋白占蛋白质总量的比例不得超过百分之1。蛋白质组成通过已由美国食品药品管理局生物制品评估与研究中心主任为每个制造商批准的方法测定。
[0074]
如本文中所用，“血浆蛋白质级分”或“ppf”是指源自人血浆的由白蛋白和球蛋白构成的蛋白质无菌溶液，其中如通过电泳测定的，白蛋白含量为至少83％且球蛋白(包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白)和其他血浆蛋白不超过17％，并且γ球蛋白不超过1％。(hink,j.h.,jr.等人，preparation and properties of a heat-treated human plasma protein fraction,vox sanguinis 2(174)(1957))。ppf也可以指固体形式，当悬浮在溶剂中时，具有相似的组成。总球蛋白级分可通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定。(busher,j.,serum albumin and globulin,clinical methods:the history,physical,and laboratory examinations,chapter 10,walker hk,hall wd,hurst jd,eds.(1990))。
[0075]
2.白蛋白(人)(has)
[0076]
根据fda，“白蛋白(人)”(在本文中也称为“has”)是定义为“源自人血浆的白蛋白的无菌溶液”的制品的专有名称。(美国联邦法规代码“cfr”21 cfr 640.80，其通过引用并入本文)。白蛋白(人)的来源材料是从按照21 cfr 640.1-640.5(其通过引用并入本文)规定制备的全血或按照21 cfr 640.60-640.76(其通过引用并入本文)规定制备的源血浆中回收的血浆。白蛋白(人)的其他要求列于21 cfr 640.80
–
640.84(通过引用并入本文)中。
[0077]
对白蛋白(人)进行测试，以确定其符合按照21 cfr 640.82的以下标准：
[0078]
(a)蛋白质浓度。最终制品应符合以下浓度之一：百分之4.0 /-0.25；百分之5.0 /-0.30；百分之20.0 /-1.2；和百分之25.0 /-1.5的蛋白质溶液。
[0079]
(b)蛋白质组成。如通过已由美国食品药品管理局生物制品评估与研究中心主任
为每个制造商批准的方法所测定的，最终制品中至少百分之96的总蛋白质应为白蛋白。
[0080]
如本文中所用，“白蛋白(人)”或“has”是指源自人血浆的由白蛋白和球蛋白构成的蛋白质的无菌溶液，其中白蛋白含量为至少95％且球蛋白(包括α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白)和其他血浆蛋白不超过5％。has也可以指固体形式，当悬浮在溶剂中时，其具有相似的组成。总球蛋白级分可通过从总蛋白质中减去白蛋白来确定。
[0081]
如本领域普通技术人员可以认识到的，ppf和has级分也可被冷冻干燥或呈其他固体形式。具有适当添加剂的此类制剂可用于制备例如片剂、散剂、颗粒剂或胶囊剂。可通过使固体形式溶解、悬浮或乳化于含水或非含水溶剂，例如植物油或其他类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇酯，来将所述固体形式配制成供注射的制剂；并且若需要，包含常规添加剂例如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
[0082]
e.凝血因子减少的级分
[0083]
本发明的另一个实施方案使用从其中除去基本上所有凝血因子以保留级分的功效并降低血栓形成风险的血浆级分。方便地，血液制品可源自年轻供体或年轻供体群，并且可使其不含igm，以提供与abo相容的年轻血液制品。目前，输注的血浆与abo血型匹配，因为天然存在的针对a和b抗原的抗体的存在会导致输血反应。igm呈现出导致当患者接受abo不匹配的血浆时的输血反应。从血液制品或级分中除去igm有助于消除被施用本发明的血液制品和血浆级分的对象的输血反应。
[0084]
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗患有与以下任意肝病或肝衰竭相关的不希望的病症/适应症的对象的方法。该方法包括：向对象施用源自个体或个体群的全血的血液制品或血液级分，其中所述血液制品或血液级分基本上不含(a)至少一种凝血因子和/或(b)igm。在一些实施方案中，血液制品或血液级分所源自的个体是年轻个体。在一些实施方案中，血液制品基本上不含至少一种凝血因子和igm。在某些实施方案中，血液制品基本上不含纤维蛋白原(因子i)。在另外的实施方案中，血液制品基本上不含红细胞和/或白细胞。在另外的实施方案中，血液制品基本上是无细胞的。在其他实施方案中，血液制品源自血浆。2016年8月18日提交的美国专利申请第62/376529号进一步支持本发明的此类实施方案，所述专利申请通过引用整体并入本文。
[0085]
f.富含蛋白质的血浆蛋白制品处理
[0086]
本发明的另外的实施方案使用与ppf相比具有降低的白蛋白浓度，但是具有增加量的球蛋白和其他血浆蛋白(被称为“污染物”)的血浆级分。与ppf、has、流出物i和流出物ii/iii一样，所述实施方案都有效地不含凝血因子。在下文中将此类血浆级分称为“富含蛋白质的血浆蛋白制品”。例如，本发明的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由82％的白蛋白和18％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白以及其他血浆蛋白构成。本发明的另一个实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由81％的白蛋白和19％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和/或其他血浆蛋白构成。本发明的另一个实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由80％的白蛋白和20％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和/或其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由70％至79％的白蛋白和相应的21％至30％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由60％至69％的白蛋白和相应的31％至40％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施
方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由50％至59％的白蛋白和相应的41％至50％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由40％至49％的白蛋白和相应的51％至60％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由30％至39％的白蛋白和相应的61％至70％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由20％至29％的白蛋白和相应的71％至80％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由10％至19％的白蛋白和相应的81％至90％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由1％至9％的白蛋白和相应的91％至99％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白构成。本发明的另外的实施方案可使用富含蛋白质的血浆蛋白制品，其由0％的白蛋白和100％的α球蛋白、β球蛋白和γ球蛋白和其他血浆蛋白组成。
[0087]
上述本发明的实施方案还可具有1％至5％的总γ球蛋白浓度。
[0088]
血浆级分中蛋白质的特定浓度可使用相关领域普通技术人员公知的技术来确定。作为示例而非限制，此类技术包括电泳、质谱、elisa分析和蛋白质印迹分析。
[0089]
g.血浆级分的制备
[0090]
制备ppf和其他血浆级分的方法是本领域普通技术人员公知的。本发明的实施方案允许将用于制备人血浆蛋白质级分的血液收集在具有柠檬酸盐或抗凝柠檬酸盐葡萄糖溶液(或其他抗凝剂)的烧瓶中以抑制凝结，并按照hink等人公开的方法进一步分离级分i、ii iii、iv和ppf。(参见hink,j.h.,jr.等人，preparation and properties of a heat-treated human plasma protein fraction,vox sanguinis 2(174)(1957)，其通过引用并入本文)。按照这种方法，可将混合物收集到2℃至8℃。然后可通过在7℃下离心分离血浆，取出，并在-20℃下保存。然后可将血浆在37℃解冻并分级分离，优选在从-20℃储存中取出后的八小时内进行分级分离。
[0091]
可使用ph 7.2的8％乙醇和-2℃至-2.5℃的温度将血浆与级分i分离，蛋白质浓度为5.1％至5.6％。可在将血浆温度降至-2℃的过程中利用喷嘴以例如450ml/分钟的速率添加冷的百分之53.3乙醇(176ml/l血浆)与乙酸盐缓冲液(用h2o将200ml 4m乙酸钠，230ml冰醋酸定容至1l)。级分i可通过超速离心分离并从流出物(流出物i)中除去。可按照本领域普通技术人员公知的方法从级分i获得纤维蛋白原。
[0092]
通过将流出物调节至ph为6.8，温度为-6℃的百分之21乙醇并且蛋白质浓度为百分之4.3来从流出物i分离级分ii iii。在将流出物i的温度降至-6℃的过程中，可以使用喷嘴以例如500ml/分钟的速率添加冷的95％乙醇(176ml/l流出物i)和用于ph调节的10m乙酸。得到的沉淀物(级分ii iii)可通过在-6℃下离心除去。可使用本领域普通技术人员公知的方法从级分ii iii获得γ球蛋白。
[0093]
通过将流出物调节至ph为5.2，温度为-6℃的百分之19乙醇并且蛋白质浓度为百分之3来从流出物ii iii(“流出物ii/iii”)分离级分iv-1。可使用喷嘴添加h2o和用于ph调节的10m乙酸，同时将流出物ii/iii保持在-6℃持续6小时。可将沉淀的级分iv-1在-6℃下静置6小时，然后通过在相同温度下离心与流出物分离。通过将乙醇浓度调节至百分之30、
ph 4.65、温度-7℃并且蛋白质浓度为百分之2.5来从流出物iv-1回收稳定的血浆蛋白质级分。这可通过用冷酸-醇(两份2m乙酸和一份95％的乙醇)调节流出物iv-1的ph值来实现。在保持-7℃的温度的同时，向每升经调节的流出物iv-1中添加170ml冷乙醇(95％)。可将沉淀的蛋白质静置36小时，然后在-7℃下通过离心除去。级分iv-4糊状物也可使用cohn分级分离过程获得。实际上，级分iv-4及其制造方法先前已被描述(schopfer lm等人,plos one,14(1):e0209795(2018)，通过引用整体并入本文)(schopfer lm等人,plos one,14(1):e0209795(2018)和bertolini j,goss n,curlin j eds.,p
roduction of p
lasma p
roteins for t
herapeutic u
se
,16.4:231:232(2013)，通过引用整体并入本文)。
[0094]
可干燥(例如通过冷冻干燥)回收的蛋白质(稳定的血浆蛋白质级分)以除去乙醇和h2o。可将所得的干燥粉末溶于无菌蒸馏水中，例如使用15升水/kg粉末，并用1m naoh将溶液的ph调节至7.0。可通过添加含有乙酰色氨酸钠、辛酸钠和nacl的无菌蒸馏水，调节至乙酰色氨酸终浓度为0.004m、辛酸终浓度为0.004m以及钠终浓度为0.112m，以使蛋白质的终浓度达到百分之5。最后，可将溶液在10℃过滤以获得澄清溶液，然后在60℃热处理至少10小时以灭活病原体。
[0095]
本领域普通技术人员将认识到，上述每种不同的级分、流出物或糊状物可以与本发明的方法一起用于治疗例如肝病或肝衰竭的病症。例如但不限于，流出物i或流出物ii/iii可用于治疗例如肝病或肝衰竭的病症，并作为本发明的实施方案。另一个实例是级分i糊状物、级分ii iii糊状物、级分iv-1糊状物、级分iv-4糊状物和/或级分v糊状物或其悬浮液可用于治疗例如肝病或肝衰竭的病症，并作为本发明的实施方案。
[0096]
前述的制备血浆级分和血浆蛋白质级分(ppf)的方法仅是示例性的，并且仅涉及本发明的实施方案。本领域普通技术人员将认识到这些方法可以改变。例如，在本发明的不同实施方案和方法中，除其他外，可以调节ph、温度和乙醇浓度以产生血浆级分和血浆蛋白质级分的不同变化。在另一个实例中，本发明的另外的实施方案考虑使用纳米过滤从血浆级分和血浆蛋白质级分中除去/灭活病原体。
[0097]
本发明的另外的实施方案考虑使用和/或包含另外的血浆级分的方法和组合物。例如，除其他外，本发明考虑特定浓度的白蛋白对于治疗与肝病或肝衰竭相关的病症不是关键的。因此，本发明考虑具有降低的白蛋白浓度的级分，例如具有低于83％的白蛋白的级分。
[0098]
h.治疗
[0099]
本文所述的本发明的方法的方面包括用例如如上所述的包含血浆的血液制品例如血浆级分治疗对象。实施方案包括用包含血浆的血液制品治疗人对象。本领域技术人员将认识到，用包含血浆的血液制品治疗对象的方法是本领域公认的。作为示例而非限制，本文描述的本发明的方法的一个实施方案包括向对象施用血浆级分或新鲜冷冻血浆以治疗肝脏相关病症，例如急性衰竭或慢性衰竭。本发明的另外的实施方案包括其中急性肝衰竭与传染病如乙型或丙型肝炎、药物或毒素(如对乙酰氨基酚、异烟肼)的过度使用以及代谢或血管疾病如自身免疫性肝炎和威尔逊病有关。本发明的另外的实施方案包括其中慢性肝衰竭与病毒感染、酗酒、nafld(由肥胖、高胆固醇和甘油三酯以及高血压引起)、自身免疫性疾病、管道例如从肝脏到肠道的胆管的阻塞或损坏、接触毒素或某些药物、寄生虫、心力衰竭导致肝脏中的血液积聚有关。
[0100]
本发明的另外的实施方案包括与遗传疾病相关的肝病或肝衰竭，包括例如但不限于：α-1抗胰蛋白酶缺乏症；胆汁酸合成障碍(威尔逊病，进行性家族性肝内胆汁淤积3型)；糖代谢紊乱(遗传性果糖不耐受，iv型糖原贮积病)；氨基酸代谢紊乱(i型酪氨酸血症)；尿素循环障碍(精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬酸缺乏症
–
ctln2、niccd)；脂质代谢紊乱(胆固醇酯贮积病)；囊性纤维化；血色素沉着症；alstrom综合征；和先天性肝纤维化。(scorza m等人,int’l j hepatology,2014,article id 713754(2014))。
[0101]
本发明的另外的实施方案包括与传染原相关的肝病或肝衰竭，例如但不限于：病毒(爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、黄热病、登革热、乙型肝炎和丙型肝炎)；细菌(伤寒、结核分枝杆菌、布鲁氏菌病、q热、钩端螺旋体病、螺旋体——梅毒、疏螺旋体属)；寄生虫(血吸虫病、疟疾)；真菌(念珠菌)。(talwani r等人,clin liver dis.,15(1):111-30(2011))。
[0102]
本发明的另外的实施方案包括与药物或有毒物质相关的肝病或肝衰竭，药物或有毒物质例如但不限于：对乙酰氨基酚、异烟肼和由肝脏代谢的药物。
[0103]
本发明的另外的实施方案包括肝病，其中肝脏被部分或完全切除。另外的实施方案包括肝病，其中将供体肝脏移植到患有肝病的对象中。另外的实施方案包括在术前、围术期和术后向对象施用治疗剂，例如包含血浆的血液制品或血浆级分。
[0104]
在一个实施方案中，立即，例如在从供体收集的约12小时至48小时内，向患有肝病或肝衰竭病症的个体施用包含血浆的血液制品。在此类情况下，可将制品在例如0℃至10℃的冷藏条件下存储。在另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆是已经在-18℃或低于-18℃的条件下冷冻储存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且一旦解冻，在解冻过程开始后60分钟至75分钟向对象施用。每个对象优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200ml至250ml)，所述新鲜冷冻血浆优选源自处于预定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)年轻个体。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)相同性别的供体。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)年龄为18岁至22岁的供体。
[0105]
在本发明的实施方案中，在按血型捐献后，筛选包含血浆的血液制品。在本发明的另一个实施方案中，按照21cfr 640.33的要求和fda指南文件中包含的建议，筛选包含血浆的血液制品的例如hiv i&ii、hbv、hcv、htlv i&ii、抗-hbc的传染病病原体。
[0106]
在本发明的另一个实施方案中，用血浆级分治疗对象。在本发明的实施方案中，血浆级分是ppf、has、级分iv-1、级分iv-1糊状物、级分iv-4或级分iv-4糊状物。在本发明的另外的实施方案中，血浆级分是商业has制剂中的一种商业ppf制剂。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是源自特定年龄范围的个体例如年轻个体群的ppf、has、级分iv-4或级分iv-4糊状物，或者是已经过另外的分级分离或加工的经修饰的ppf、has、级分iv-4或级分iv-4糊状物级分(例如，其中一种或多于一种特定蛋白已被部分或基本上除去的ppf、has、级分iv-1、级分iv-1糊状物、级分iv-4或级分iv-4糊状物)。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是已基本上耗尽了免疫球蛋白(igg)的igiv血浆级分。“基本上耗尽的”或使特定蛋白质例如igg“基本上除去”的血液级分是指，如使用本领域公知的标准测定所测量的，含有少于存在于参考制品或全血浆中的量的约50％的量，例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、检测不到的水平或这些值之
间的任意整数的量的血液级分。
[0107]
i.施用
[0108]
本文所述的本发明的方法的方面包括用例如如上所述的包含血浆的血液制品，例如血浆或血浆级分，治疗对象。实施方案包括用包含血浆的血液制品治疗人对象。本领域技术人员将认识到，用包含血浆的血液制品治疗对象的方法是本领域公认的。作为示例而非限制，本文描述的本发明的方法的一个实施方案包括向对象施用新鲜冷冻血浆以治疗例如肝病或肝衰竭病症。在一个实施方案中，立即，例如在从供体收集的约12小时至48小时内，向患有不希望的病症例如肝病或肝衰竭的个体施用包含血浆的血液制品。在此类情况下，可将制品在例如0℃至10℃的冷藏条件下存储。在另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆是已经在-18℃或低于-18℃的条件下冷冻储存(冷冻保存)的血浆。在施用之前，将新鲜冷冻血浆解冻，并且一旦解冻，在解冻过程开始后60分钟至75分钟向对象施用。每个对象优选接受单个单位的新鲜冷冻血浆(200ml至250ml)，所述新鲜冷冻血浆优选源自处于预定年龄范围的供体。在本发明的一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)年轻个体。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)相同性别的供体。在本发明的另一个实施方案中，新鲜冷冻血浆捐献自(源自)年龄为18岁至22岁的供体。
[0109]
在本发明的实施方案中，在按血型捐献后，筛选包含血浆的血液制品。在本发明的另一个实施方案中，按照21 cfr 640.33的要求和fda指南文件中包含的建议，筛选包含血浆的血液制品的例如hiv i&ii、hbv、hcv、htlv i&ii、抗-hbc的传染病病原体。
[0110]
在本发明的另一个实施方案中，用血浆级分治疗对象。在本发明的实施方案中，血浆级分为ppf或has。在本发明的另外的实施方案中，血浆级分为商业ppf制剂或商业has制剂之一。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分为源自特定年龄范围的个体例如年轻个体群的ppf或has，或者是已经过另外的分级分离或加工的经修饰的ppf或has级分(例如，其中一种或多于一种特定蛋白已被部分或基本上除去的ppf或has)。在本发明的另一个实施方案中，血浆级分是已基本上耗尽了免疫球蛋白(igg)的igiv血浆级分。“基本上耗尽的”或使特定蛋白质例如igg“基本上除去”的血液级分是指，如使用本领域公知的标准测定法所测量的，含有少于存在于参考制品或全血浆中的量的约50％的量，例如少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、.25％、.1％、检测不到的水平或这些值之间的任意整数的量的血液级分。
[0111]
本发明的实施方案包括通过向对象施用有效量的血浆或血浆级分来治疗患有肝病或肝衰竭病症的对象。本发明的另一个实施方案包括施用有效量的血浆或血浆级分，并且随后监测对象的改善的肝功能、肝再生、标志物的存在、疼痛的减少或炎症的减少。本发明的另一个实施方案包括通过向对象施用有效量的血浆或血浆级分来治疗患有有关病症例如肝病或肝衰竭的对象，其中血浆或血浆级分施用的方式使得相对于最近施用的剂量，在已达到血浆蛋白或血浆级分蛋白的平均或中位半衰期后，使肝功能改善、肝再生、标志物存在、疼痛减少或炎症减少(在本文中称为“脉冲式给药”或“脉冲给药”)(参见美国专利申请第15/499697号和第62/701411号，其通过引用整体并入本文)。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续两天的给药方案来施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后至少3天监测对象的肝功能改善或hsc标志物水平。本发明的另外的实施方案包括通过至少连续3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天的给药方案来施用血浆或
血浆级分，并在最后一次施用的日期后监测对象的肝功能改善、肝再生、标志物的存在、疼痛的减少或炎症的减少至少3天。本发明的另一个实施方案包括通过至少连续2天的给药方案施用血浆或血浆级分，并在最后一次施用的日期后，监测当已达到血浆或血浆级分中蛋白质的平均半衰期时的肝功能改善、标志物的存在、疼痛的减少或炎症的减少。本发明的另一个实施方案包括通过非连续的2天至14天的给药方案施用血浆或血浆级分，其中给药之间的每个间隙可各自为0天至3天。
[0112]
在一些情况下，根据本发明的例如如上所述的脉冲式给药包括施用第一组剂量，随后是不给药期，例如“无给药期”，这之后接着是施用另一剂量或另一组剂量。“无给药期”的持续时间可以变化，但是在一些实施方案中是7天或多于7天，例如10天或多于10天，包括14天或多于14天，其中在一些情况下，无给药期为15天至365天，例如30天至90天，包括30天至60天。因而，方法的实施方案包括血浆制品的非长期(即，非连续)给药，例如非长期施用。在一些实施方案中，根据需要将脉冲式给药并随后进行无给药期的模式重复多次，其中在一些情况下，将该模式持续1年或多于1年，例如2年或多于2年，长达并包括对象的一生。本发明的另一个实施方案包括施用血浆或血浆级分是通过连续5天施用，2天至3天无给药期，随后连续施用2天至14天的给药方案：。
[0113]
本发明的另外的实施方案包括其中肝脏被部分或完全切除的肝病。另外的实施方案包括肝病，其中将供体肝脏移植到患有肝病的对象中。另外的实施方案包括在术前、围术期和术后向对象施用治疗剂，例如包含血浆的血液制品或血浆级分。切除和移植肝脏的方法在本领域中是众所周知的。
[0114]
在生物化学上，活性剂的“有效量”或“有效剂量”意指活性剂的量，该量将抑制、拮抗、减少、降低或消除约20％或多于20％，例如30％或多于30％、40％或多于40％或50％或多于50％，在一些情况下60％或多于60％、70％或多于70％、80％或多于80％或90％或多于90％，在一些情况下约100％，即，至可以忽略的量，以及在一些情况下，逆转不希望的病症例如肝病或肝衰竭。
[0115]
j.血浆蛋白质级分
[0116]
在实施本发明的方法时，向对象施用血浆级分。在实施方案中，血浆级分是血浆蛋白质级分(ppf)。在另外的实施方案中，ppf选自商业ppf制剂。
[0117]
在另一个实施方案中，ppf由如通过电泳测定的88％的正常人白蛋白、12％的α球蛋白和β球蛋白以及不超过1％的γ球蛋白构成。用于实施本发明方法的实施方案的另外的实施方案包括，例如，用碳酸钠缓冲并用0.004m辛酸钠和0.004m乙酰色氨酸稳定的5％的ppf溶液的实施方案。实施本发明的方法时，可使用另外的制剂，包括改变了溶液中ppf的百分比(例如，约1％至约10％、约10％至约20％、约20％至25％、约25％至30％)以及溶剂和稳定剂的浓度的制剂。
[0118]
k.特定供体年龄的血浆级分
[0119]
本发明的另外的实施方案包括施用源自某些年龄范围的个体的血浆的血浆蛋白质级分。实施方案包括施用源自年轻个体的血浆的ppf或has。在本发明的另一个实施方案中，年轻个体具有单个特定年龄或特定年龄范围。在另一个实施方案中，供体的平均年龄小于对象的年龄或小于接受治疗的对象的平均年龄。
[0120]
本发明的某些实施方案包括汇集来自特定年龄范围的个体的血液或血浆，并如上
所述分级分离血浆以获得血浆蛋白质级分制品，例如ppf或has。在本发明的替代实施方案中，从符合特定年龄范围的特定个体获得血浆蛋白质级分或特定血浆蛋白质级分。
[0121]
l.适应症
[0122]
本发明的一个实施方案为使用血浆级分和血浆分级分离制品对经诊断患有可得益于改善的肝脏增殖或再生的肝病或肝衰竭的对象施用。本发明的另一个实施方案包括当所述疾病与：急性肝衰竭、慢性肝衰竭或慢加急性肝衰竭相关时。慢加急性肝衰竭发生在慢性肝病相对稳定，但突然转变为急性肝衰竭的患者中。这通常会导致非常高的死亡率。本发明的另一个实施方案是其中急性肝衰竭与传染病如乙型或丙型肝炎、药物或毒素(如对乙酰氨基酚、异烟肼)的过度使用以及代谢或血管疾病如自身免疫性肝炎和威尔逊病有关。本发明的另外的实施方案包括其中慢性肝衰竭与病毒感染、酗酒、nafld(由肥胖、高胆固醇和甘油三酯以及高血压引起)、自身免疫性疾病、管道例如从肝脏到肠道的胆管的阻塞或损坏、接触毒素或某些药物、寄生虫、心力衰竭导致肝脏中的血液积聚有关。
[0123]
本发明的另外的实施方案包括与遗传疾病相关的肝病或肝衰竭，例如但不限于：α-1抗胰蛋白酶缺乏症；胆汁酸合成障碍(威尔逊病，进行性家族性肝内胆汁淤积3型)；糖代谢紊乱(遗传性果糖不耐受，iv型糖原贮积病)；氨基酸代谢紊乱(i型酪氨酸血症)；尿素循环障碍(精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症、柠檬酸缺乏症
–
ctln2、niccd)；脂质代谢紊乱(胆固醇酯贮积病)；囊性纤维化；血色素沉着症；astrom综合征；和先天性肝纤维化。(scorza m等人,int’l j hepatology,2014,article id 713754(2014))。
[0124]
本发明的另外的实施方案包括与传染原相关的肝病或肝衰竭，例如但不限于：病毒(爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒和其他疱疹病毒、黄热病、登革热、乙型肝炎和丙型肝炎)；细菌(伤寒、结核分枝杆菌、布鲁氏菌病、q热、钩端螺旋体病、螺旋体——梅毒、疏螺旋体)；寄生虫(血吸虫病、疟疾)；真菌(念珠菌)。(talwani r等人,clin liver dis.,15(1):111-30(2011))。
[0125]
本发明的另外的实施方案包括与药物或有毒物质相关的肝病或肝衰竭，例如但不限于：对乙酰氨基酚、异烟肼和由肝脏代谢的药物。
[0126]
本发明的另外的实施方案包括其中肝脏被部分切除的肝病。另外的实施方案包括其中将供体肝脏移植到患有肝病的对象中的肝病。另外的实施方案包括在术前、围术期和术后向对象施用治疗剂，例如包含血浆的血液制品或血浆级分。
[0127]
m.试剂、装置和试剂盒
[0128]
还提供了用于实施一种或多于一种上述方法的试剂、装置及其试剂盒。目标试剂、装置及其试剂盒可以有很大的不同。
[0129]
目标试剂和装置包括以上关于制备输注到有需要的对象的含血浆的血液制品的方法中所提到的试剂和装置，例如抗凝剂、低温贮存剂、缓冲液、等渗溶液等。
[0130]
试剂盒还可包括血液收集袋、管、针头、离心管等。在其他实施方案中，本文所述的试剂盒包括两个或多于个血浆制品例如血浆蛋白质级分的容器，例如三个或多于三个、四个或多于四个、五个或多于五个、包括六个或多于六个血浆制品的容器。在一些情况下，试剂盒中血浆制品的不同容器的数量可以是9个或多于9个，12个或多于12个，15个或多于15个，18个或多于18个，21个或多于21个，24个或多于24个，30个或多于30个，包括36个或多于36个，例如48个或多于48个。每个容器可具有与其相关联的识别信息，识别信息包括关于其
中所包含的血浆制品的多种数据，该识别信息可包括血浆制品的供体年龄、关于血浆制品的加工细节，例如血浆制品是否经处理以除去高于平均分子量的蛋白质(例如上文所述的)、血型详细信息等中的一项或多于一项。在一些情况下，试剂盒中的每个容器都包括关于其中所包含的血浆的识别信息，并且识别信息包括关于血浆制品的供体年龄的信息，例如识别信息提供确认血浆制品供体的年龄相关数据(其中，识别信息可以是采集时供体的年龄)。在一些情况下，试剂盒的每个容器都包含来自年龄基本上相同的供体的血浆制品，即，所有容器均包含来自年龄如果不是相同的，则基本上相同，的供体的制品。基本上相同的年龄意指从其获得试剂盒的血浆制品的不同供体在一些情况下各自相差5岁或小于5岁，例如4岁或小于4岁，例如3岁或小于3岁，包括2岁或小于2岁，例如1岁或小于1岁，例如9个月或小于9个月，6个月或小于6个月，3个月或小于3个月，包括1个月或小于1个月。识别信息可以存在于容器的任意方便的部件上，例如标签、rfid芯片等。根据需要，识别信息可以是人可读的、计算机可读的等。容器可具有任意方便的配置。尽管容器的体积可以变化，但在一些情况下，容积为10ml至5000ml，例如25ml至2500ml，例如50ml至1000ml，包括100ml至500ml。容器可以是刚性的或柔性的，并且可以由任意方便的材料制成，例如聚合材料，包括医用级塑料材料。在一些情况下，容器具有袋或小袋配置。除了容器以外，所述试剂盒还可包括例如如上所述的施用装置。所述试剂盒的组件可以以任意合适的包装提供，例如，盒或类似的结构，其配置为容纳容器和其他试剂盒的组件。
[0131]
除了上述组件以外，目标试剂盒还可包括用于实施目标方法的说明书。说明书可以以多种形式存在于目标试剂盒中，其中的一种或多于一种可以存在于试剂盒中。说明书可存在的一种形式是在适合的介质或基底例如在其上打印信息的一张或多于一张纸上、试剂盒的包装中、包装插页等上的打印信息。另一种方式可以是在其上记录信息的计算机可读介质，例如软盘、cd、便携式闪存驱动器等。另一种可能存在的方式是网站地址，其可以通过互联网使用以在远端位点访问信息。任意适宜的装置都可存在于试剂盒中。
[0132]
n.实验实施例
[0133]
1.实施例1
[0134]
a)20月龄的c57bl/6小鼠肝脏在70％部分肝切除术后的ppf1诱导的功能恢复
[0135]
使用20月龄的雄性c57bl/6j小鼠(the jackson laboratory,sacramento,ca)。在12小时光照、12小时黑暗的循环下，将所有小鼠单独饲养在特定的无病原体条件下，所有动物的处理和使用均符合机构动物护理和使用委员会批准的标准指南。给动物喂食60％高脂饮食(bio-serv f3282)7周至8周，并根据饮食后的体重和alt水平随机分为载剂组与ppf1处理组，以确保组之间的平均体重和血清alt水平相同。以如前所述的微小修改进行了手术(nevzorova,y.等人,lab.anim.49,81
–
88(2015))。切除的肝脏(左叶和正中叶)作为术前对照，而残肝(尾状叶和右叶)在手术后48小时收获。手术后二十四(24)小时，以30mg/kg体重腹膜内注射edu(生理盐水中的2.5mg/ml储备液)。手术后四十六(46)小时，以30mg/kg体重腹膜内注射brdu(生理盐水中的10mg/ml储备液)。手术后48小时，对所有动物称重，并收集残脏(尾状叶和右叶)和血清用于alt分析。
[0136]
可商购获得的ppf(“ppf1”)，例如上述在5％溶液中的商业ppf制剂，在4℃下储存。ppf1是通过电泳测定具有约88％的正常人白蛋白(相对于总蛋白)、12％的α和β球蛋白以及不超过1％的γ球蛋白的ppf。除非另有说明，否则在本文的实施例中使用5％溶液(重量/体
积，50g/l)施用ppf1。
[0137]
对于qpcr分析，从用液氮和研钵/杵粉化的切除或残余的肝脏中提取rna。随后用trizol(ambion/fisher 15-596-018)和rneasy mini kit(qiagen 74106)进行提取。用iscript reverse transcription supermix(bio-rad 1030)扩增cdna。使用ssoadvanced universal sybr green master mix(bio-rad 1725272)扩增qpcr，并使用quant studio 6flex(applied biosystem)进行。基因表达被归一化为rps18(核糖体蛋白s18)。
[0138]
对于免疫染色，包埋在oct化合物(sakura 4583)中的12微米厚的冷冻肝切片用于免疫荧光染色。使用柠檬酸盐缓冲液(sigma c9999)在95℃下修复抗原30分钟。对于edu标记，使用click-it plus edu alexa fluor 555(fisher c10638)。使用hoechst 33342在ddh2o中以1比100000标记细胞核3分钟(fisher h3570)。进行油红o染色以可视化肝脏中的甘油三酯积累。简而言之，将冷冻肝切片浸入含0.375％油红o的异丙醇中5分钟。将切片在流动的自来水下冲洗30分钟，并用prolong gold antifade reagent(invitrogen p36934)固定。
[0139]
图1示出了高脂饮食(“hfd”)的20月龄的c57bl/6小鼠体重进展的图。hfd 8.5周后，小鼠体重显著增加。平均值
±
sem，****p《0.0001，普通单因素方差分析。
[0140]
图2是如图1所述的小鼠肝脏的油红o染色。与正常饮食的小鼠(“正常饮食”)相比，hfd的小鼠出现脂肪肝。
[0141]
图3示出了评估ppf1对如上所述的高脂饮食的20月龄c57bl/6小鼠的影响的实验设计。
[0142]
图4确定了如图3所述处理的小鼠70％肝切除术产生的切除的叶和残余的叶。
[0143]
图5示出了在来自如图3所述处理的小鼠的经载剂和经ppf1处理的切除的肝脏的肝脏重量与体重的比率的测定结果。
[0144]
图6示出了在来自如图3所述处理的小鼠的经载剂和经ppf1处理的切除的肝脏的肝脏重量。
[0145]
图7是示出了在肝切除术前在经ppf1处理的hfd的小鼠中血清alt水平正常且不受影响的图。当alt水平低于每升50单位至每升60单位时，则认为它们是正常的。(例如，参见,mazzaccara c等人,plos one,3(11):e3772(2008))。
[0146]
图8示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的具有残肝的小鼠中肝脏重量与体重的比率的测定结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物在肝切除术后48小时肝脏重量显著增加。平均值
±
sem，**p《0.001使用whitney校正的非配对t检验。
[0147]
图9示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的具有残肝的小鼠中的肝脏重量。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物在肝切除术后48小时肝脏重量显著增加。平均值
±
sem，*p《0.05使用whitney校正的非配对t检验。
[0148]
图10示出了在如图3所述的肝切除术后48小时，在经载剂和经ppf1处理的具有残肝的小鼠中的血清alt水平的结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物在肝切除术后48小时的血清alt水平显著降低，表明用ppf1处理的动物的肝损伤程度也显著降低。平均值
±
sem，**p《0.001使用whitney校正的非配对t检验。
[0149]
相比之下，经载剂处理和经ppf1处理的动物之间的切除的肝脏重量、肝脏重量/体
重比和alt水平的差异未能达到显著水平。
[0150]
图11报告了肝切除术后的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送，并通过edu阳性细胞的click-it标记来追踪增殖率。与经载剂处理的动物的残肝相比，ppf1显著地增加了每个视野的edu阳性细胞数。
[0151]
图12报告了通过每个视野的ki67阳性细胞数测量的肝切除术后48小时的细胞增殖。与经载剂处理的动物的残肝相比，ppf1显著地增加了每个视野的ki67阳性细胞数。
[0152]
图13报告了通过qpcr基因表达的残肝中的细胞增殖率。示出了细胞周期标志物细胞周期蛋白b1的相对表达。在残肝切片中，经ppf1处理的小鼠与经载剂处理的小鼠相比，细胞周期蛋白b1的表达显著上调。平均值
±
sem，*p《0.05使用whitney的非配对t检验。
[0153]
图14a至图14d报告了若干个标志物在切除的肝脏中的qpcr表达。示出了细胞周期标志物细胞周期蛋白b1(图14a)、细胞周期蛋白a2(图14b)和ki67(图14c)的相对表达。在作为术前对照的肝切除术期间去除的切除肝脏切片中，与具有所有三种细胞周期标志物的载剂对照相比，ppf1令人惊讶地显著地增加了细胞增殖。图14d报告了切除肝脏切片中tnfα的相对表达水平。已知tnfα通过驱动肝细胞增殖和肝脏再生来促进功能性肝脏质量的恢复。总之，与载剂对照相比，ppf1处理导致在其他静止和完整肝脏(肝切除术之前)中细胞增殖的激活。平均值
±
sem，*p《0.05使用whitney校正的非配对t检验。
[0154]
图15示出了如图14c中报告的切除肝脏中ki67的免疫染色，这证实了与载剂对照相比，经ppf1处理的切除肝脏具有明显更高数量的ki67阳性细胞。
[0155]
图16报告了来自图15的免疫染色的量化，示出了经ppf1处理的切除肝脏中ki67阳性细胞的数量的增加。平均值
±
sem，*p《0.05使用whitney校正的非配对t检验。
[0156]
图17是示出了接受肝切除术的动物总数以及接受每种处理的动物的存活率的图表。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物表现出存活率增加的趋势。
[0157]
图18示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织学切片用gfap抗体(星形细胞标志物)染色，并观察edu与gfap之间的共定位水平。根据edu和gfap之间缺乏共定位确定，在星形细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
[0158]
图19示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个共聚焦显微镜视野(参见图3)。用cd68抗体(库普弗细胞标志物)对组织切片进行染色，并观察edu与cd68的共定位水平。根据edu和cd68之间缺乏共定位确定，在库普弗细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
[0159]
图20示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用hnf4a抗体(肝细胞标志物)染色，并观察edu与hnf4a的共定位水平。根据edu和hnf4a之间缺乏共定位确定，在肝细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
[0160]
图21示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用cd3抗体(t细胞标志物)染色，并观察edu与cd3的共定位水平。根据edu和cd3之间缺乏共定位确定，在t细胞中未发生与ppf1施用相关的细胞增殖。
[0161]
图22示出了肝切除术后24小时与edu结合的残肝的两个共聚焦显微镜视野(参见图3)。组织切片用cd31抗体(窦内皮细胞标志物)染色，并观察edu与cd31的共定位水平。根据edu和cd31之间的阳性共定位确定，ppf1施用引起的细胞增殖与肝窦内皮细胞(lsec)相
关。这些结果表明，ppf1增加了肝脏毛细血管细胞的增殖，使更多的血液被带至损伤部位，这表明了在经ppf1处理后组织修复和再生如何发生的机制。(箭头表示包含edu阳性细胞的lsec)。
[0162]
2.实施例2
[0163]
a)ppf1、重组人白蛋白和has1对70％部分肝切除术后20月龄c57bl/6小鼠肝脏的影响
[0164]
重组人白蛋白
[0165]
如上文实施例1中所述处理了雄性c57bl/6j，不同的是用重组人白蛋白(“rhalbumin”)处理了另外一组。进行了ppf1处理组、rhalbumin处理组和载剂处理组之间的比较。
[0166]
图23示出了评估ppf1(血浆级分“pf”的类型)和重组人白蛋白(rhalbumin)对高脂饮食的20月龄的c57bl/6小鼠的影响的实验设计。在用ppf1、rhalbumin或载剂连续7天处理之前，将小鼠置于60％高脂饮食中8周。在最后一剂ppf1、rhalbumin或载剂后的第二天进行手术(70％肝切除术)，并在肝切除术期间取出手术前的正中叶和左叶(切除的)。肝切除术后48小时收获右叶和尾状叶(残余的)。
[0167]
图24报告了通过每个视野的ki67阳性细胞数测量的肝切除术后48小时的在切除的肝脏中的细胞增殖。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的ki67阳性细胞数。相比之下，经rhalbumin处理的动物与经载剂处理的动物没有显著差异。平均值
±
sem，***p《0.0001使用whitney校正的非配对t检验，ns＝不显著。
[0168]
图25报告了肝切除术后残肝中的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送，并通过点击化学追踪增殖率。与经载剂处理的动物相比，ppf1显著地增加了每个视野的edu阳性细胞数。相比之下，与经载剂处理的动物相比，经rhalbumin处理的动物在增殖方面没有达到显著性。
[0169]
这些结果表明，白蛋白作为ppf1最丰富的组分可能不是ppf1中负责其增殖、组织修复和再生活性的成分。相反，这表明通常被认为是血浆分级分离留下的杂质的ppf1的其他组分，令人惊讶地驱动了ppf1的这些活性。
[0170]
人白蛋白溶液(has)
[0171]
如上文实施例1中所述又处理了雄性c57bl/6j，不同的是用人白蛋白溶液(“has1”)处理了另外一组。进行了ppf1处理组、has1处理组和载剂处理组之间的比较。
[0172]
图26示出了评估ppf1和has1对高脂饮食的20月龄c57bl/6小鼠的影响的实验设计。在用ppf1、rhalbumin或载剂连续七天处理之前，将小鼠置于60％高脂饮食中8周。在最后一剂ppf1、has1或载剂后的第二天进行手术(70％肝切除术)，并在肝切除术期间取出手术前的正中叶和左叶(切除的)。肝切除术后48小时收获右叶和尾状叶(残余的)。
[0173]
图27报告了肝切除术后24小时的细胞增殖率。edu在肝切除术后24小时递送。与残肝中的载剂相比，ppf1和has1都显著地增加了edu阳性细胞数。*p《0.05，韦尔奇的t检验。误差线＝s.e.m.has1是可商购获得的has，例如上述在5％溶液中的商业has制剂，并在4℃下储存。
[0174]
图28示出了肝切除术后48小时的细胞增殖率。对肝切除术后48小时取出的残肝进行ki67免疫染色。虽然与对照动物相比，ppf1和has都显著增加了细胞增殖，但与经has1处
理的动物相比，ppf1也显著诱导了更多的增殖。*p《0.05,**p《0.005,***p《0.0005韦尔奇的t检验。误差线＝s.e.m.
[0175]
这些结果表明，在经has1和经ppf1处理的脂肪肝中均观察到血浆级分诱导的肝细胞增殖。然而，尽管与载剂相比两种不同的血浆级分(has1和ppf1)在24小时后均显著诱导了增殖，但48小时后ppf1的效果与has1相比更为显著，与载剂相比甚至更显著。这再次表明，与ppf1相比，has1中更纯且更丰富的白蛋白令人惊讶地不是导致血浆级分对增殖、组织修复和再生的影响的主要组分。相反，这表明血浆级分的其他组分或血浆分级分离留下的杂质出人意料地驱动了ppf1的这些活性。
[0176]
3.实施例3
[0177]
a)ppf1在最后一次治疗给药后两小时对20月龄c57bl/6小鼠肝脏的影响
[0178]
将二十月龄的雄性c57bl/6j小鼠根据体重随机分为载剂组与ppf1处理组，以确保各组之间的平均体重相同。小鼠是在正常饮食而不是高脂饮食下饲养的。通过静脉注射连续7天每天向动物给药150μl载剂或ppf1。在第七天，在给药后2小时取出肝脏。对于基因表达分析，提取rna并逆转录，并对tnfα进行sybr qpcr。基因表达被归一化为rps18。对于免疫染色，用ki67抗体标记收获的肝脏中的增殖细胞。
[0179]
图29示出了在最后一次给药后2小时评估ppf1对20月龄的c57bl/6小鼠的影响的实验设计。
[0180]
图30示出了对如上述图29所述处理的小鼠的tnfα基因表达分析结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物通过qpcr显著地增加了tnfα基因表达。**p《0.005。韦尔奇的t检验，误差线＝s.e.m.
[0181]
图31示出了对如上述图29所述处理的小鼠的ki67免疫染色分析结果。与经载剂处理的动物相比，经ppf1处理的动物在最后一次给药后2小时显著地增加了ki67阳性细胞，表明ppf1增加了肝细胞增殖。*p《0.05。韦尔奇的t检验，误差线＝s.e.m.
[0182]
这些结果表明，即使在健康的、非脂肪变性的老年肝脏中，ppf1等血浆级分也可以有效地诱导增殖和再生。
[0183]
4.实施例4
[0184]
a)级分iv-1糊状物悬浮液对70％部分肝切除术后20月龄c57bl/6小鼠肝脏的影响
[0185]
使用20月龄的雄性c57bl/6j小鼠(the jackson laboratory,sacramento,ca)。在12小时光照、12小时黑暗的循环下，将所有小鼠单独饲养在特定的无病原体条件下，所有动物的处理和使用均符合机构动物护理和使用委员会批准的标准指南。给动物喂食60％高脂饮食(bio-serv f3282)7周至8周，并根据饮食后的体重和alt水平随机分为载剂组与级分iv-1糊状物悬浮液处理组，以确保组之间的平均体重和血清alt水平相同。以如前所述的微小修改进行了手术(nevzorova,y.等人,lab.anim.49,81
–
88(2015))。切除的肝脏叶(左叶和正中叶)作为术前对照，而残肝叶(尾状叶和右叶)在手术后48小时收获。手术后二十四(24)小时，以30mg/kg体重腹膜内注射edu(生理盐水中的2.5mg/ml储备液)。手术后四十六(46)小时，以30mg/kg体重腹膜内注射brdu(生理盐水中的10mg/ml储备液)。手术后48小时，对所有动物称重，并收集残脏(尾状叶和右叶)和血清用于alt分析。将级分iv-1糊状物悬浮液对这些实验内容的影响与载剂进行了比较。此外，将级分iv-1糊状物悬浮液对这些实验内容的影响与其他血浆级分进行了比较。