一种白檀组织培养的培养基及其组织培养方法与流程

1.本发明涉及植物培养技术领域，尤其涉及一种白檀组织培养的培养基及其组织培养方法。


背景技术：

2.白檀属山矾科山矾属落叶灌木或小乔木，生长在海拔760-2500米的山坡、路边、疏林或密林中。白檀的叶可入药；白檀油在机械行业中用作润滑油，在纺织行业中用来软化羊毛和清除静电，在油墨工业中用作调和剂；白檀木是优质木材可作为家具用材；也是优良的水土保持树种之一。白檀应用广泛，开发前景广阔，但是白檀的种子具有休眠的特性，白檀的人工播种复杂且发芽率不高。在强烈人工或自然变温条件下，能使白檀当年播种出苗率达到44％左右，有些可能需要待第2年方可萌发；且种子繁殖不易保持母体的优良性状。单一、低效的繁殖方式是阻碍白檀研究工作和产业发展的瓶颈。
3.组织培养是一种高效的无性繁殖方法，既可以提高繁殖效率，又可以保留母株的优良性状，在种苗快繁、良种选育等方面发挥重要作用。开发白檀组织培养技术是解决白檀繁殖问题的快捷、有效途径，可在白檀种苗快繁、良种选育、种苗快繁等领域发挥重要作用。
4.白檀的组织培养中使用ms培养基作为基本培养基，根据白檀生长特性对钙、铁离子含量进行了调整，调整后的培养基更适合白檀组培苗的生长。白檀的组织培养效果主要从种子的萌发率、组培苗的平均出芽率、生长高度以及分化率四方面来评价。未经改良的ms培养基和浓度不适合的植物生长调节剂应用在白檀的组织培养中，会造成白檀的组织培养效果不佳。


技术实现要素：

5.本技术提供了一种白檀组织培养的培养基及其组织培养方法，来解决白檀的组织培养效果不佳的问题。
6.为解决白檀的组织培养效果不佳的问题，本技术提供了一种用于白檀组织培养的培养基，由改良的ms培养基、植物生长调节剂、硝酸钙、蔗糖和琼脂组成。
7.所述改良ms培养基各组分的含量为；
8.硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠26.11mg/l；硫酸亚铁19.46mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸0.5mg/l。
9.本技术通过将硫酸亚铁浓度降至19.46mg/l、乙二胺四乙酸二钠浓度降至26.11mg/l，改变了ms培养基中铁的含量，避免因铁元素含量过高，影响白檀的萌发、分化、生长。
10.可选的，所述蔗糖含量为30g/l，可以作为培养基的碳源，为植物的生长提供能量，
同时还可以作为培养基的渗透调节剂；所述琼脂的含量为6g/l，作为培养基的凝固剂，将液体培养基转化为固体培养基。
11.可选的，所述培养基ph值调整为5.8-6.0，更适合白檀种子的萌发和白檀组培苗的生长。
12.可选的，所述植物生长调节剂包括6-苄氨基嘌呤(6-ba)和激动素(kt)。所述6-苄氨基嘌呤浓度为1.1-1.3mg/l，所述激动素的浓度为0.1mg/l。6-苄氨基嘌呤可以促进细胞的生长，促进白檀芽的形成。激动素是细胞分裂素的一种，可诱导离体组织细胞的分裂和调节分化，促进白檀组培苗的生长、分化。
13.所述培养基通过添加硝酸钙至浓度160-200mg/l，改变了培养基中钙的含量，避免因为缺乏钙元素，影响白檀的组织培养效果。
14.为解决白檀的组织培养效果不佳的问题，本技术还提供了一种白檀的组织培养方法，包括：
15.取白檀种子，清洗后依次使用酒精消毒、次氯酸钠溶液浸泡、无菌水浸泡和冲洗，以获得消毒的种子；
16.将消毒后的种子，接种至白檀组织培养的培养基上；
17.在白檀组织培养的培养基上，对无菌种子进行萌发培养，获得无菌组培苗；
18.将无菌组培苗切成2-3cm的茎段，每个所述茎段上都带有至少1对腋芽，接种至白檀组织培养的培养基上进行组培苗继代培养。
19.本技术中用于种子萌发和组培苗继代培养的培养基都是上文方案中提供的用于白檀组织培养的培养基，包括改良的ms培养基、硝酸钙、植物生长调节剂、蔗糖和琼脂。使用改良后的适用于白檀组织培养的培养基，能提高种子的萌发率，组培苗的平均出芽率、生长高度以及分化率。
20.可选的，所述酒精消毒使用的酒精浓度为75％，消毒时间为30s，对种子的表面进行消毒，防止种子染菌。
21.可选的，所述次氯酸钠溶液为3％-5％的次氯酸钠溶液，所述白檀种子的浸泡时间为5-10min，提高种子的萌发率。
22.可选的，所述对种子进行萌发培养的条件为：在无菌培养室进行培养，光强5000lux，光照时间16h/d，温度光照时25℃，黑暗时18℃。
23.可选的，所述组培苗继代培养的培养条件为：在无菌培养室进行培养，光强5000lux，光照时间16h/d，温度光照时25℃，黑暗时18℃。
24.可选的，所述快繁培养基在121℃条件下灭菌，灭菌时间为18min，采用热压灭菌法消毒，能杀灭所有繁殖体和芽胞。
25.本发明提供了一种白檀组织培养的培养基，改变了ms培养基中钙和铁的含量，加入了植物调节剂6-苄氨基嘌呤和激动素，并调整到最适合白檀组织培养的浓度。本发明还提供了一种白檀组织培养方法，所述方法利用了上述的培养基。通过白檀种子的消毒、种子的萌发培养、无菌组培苗的获取、组培苗继代培养获得白檀的幼苗。其中种子的萌发培养和组培苗继代培养两个环节，利用了上述培养基，改善白檀的组织培养的效果，提高种子的萌发率，提高组培苗的平均出芽率、生长高度和分化率，改善组培苗的生长状态和生长稳定性。
附图说明
26.为了更清楚地说明本技术的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为白檀的组织培养流程图；
28.图2为白檀组培苗在a1培养基上第一次继代的生长情况；
29.图3为白檀组培苗在a1培养基上第二次继代的生长情况；
30.图4为白檀组培苗在a2培养基上第一次继代的生长情况；
31.图5为白檀组培苗在a2培养基上第二次继代的生长情况；
32.图6为白檀组培苗在a2培养基上第三次继代的生长情况；
33.图7为白檀组培苗在b6培养基上第一次继代的生长情况；
34.图8为白檀组培苗在b6培养基上第二次继代的生长情况；
35.图9为白檀组培苗在b6培养基上第三次继代的生长情况；
36.图10为白檀组培苗在b6培养基上第四次继代的生长情况。
具体实施方式
37.下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本技术相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本技术的一些方面相一致的系统和方法的示例。
38.针对白檀的组织培养效果不佳的问题，本发明提供了一种应用于白檀组织培养的培养基，培养基包括改良ms培养基、硝酸钙、植物生长调节剂、蔗糖和琼脂。
39.所述改良ms培养基各组分的含量为:
40.硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠26.11mg/l；硫酸亚铁19.46mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸0.5mg/l。
41.蔗糖可以作为碳源提供能量，还可以调节渗透压。加入琼脂后，可以得到固体或者半固体的培养基。植物生长调节剂可以调控细胞的生长和分化，促进白檀种子芽的形成和组培苗的生长。
42.本技术实施例中应用的改良ms培养基，在ms培养基的基础上，对铁元素的含量做了改良，适当地降低铁元素的浓度，以更好地适应白檀的组织培养。其中通过降低乙二胺四乙酸二钠和硫酸亚铁的含量，减少铁元素的浓度。
43.本技术的实施例采用不同浓度的铁盐、硝酸钙及植物生长调节剂，进行白檀的组织培养。通过对组培苗的分化率、平均出芽数量、平均株高、存活率的考察，评价白檀组织培养的效果。
44.实施例1
45.配置用于白檀组织培养的培养基，各组分含量如下：
46.硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；硝酸钙200mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠26.11mg/l；硫酸亚铁19.46mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸0.5mg/l；蔗糖30g/l；琼脂6g/l；6-苄氨基嘌呤1.3mg/l；激动素0.1mg/l。
47.需按以下组分称取所需药品：
48.硝酸钾1900mg；硝酸铵1650mg；磷酸二氢钾170mg；七水硫酸镁370mg；二水氯化钙440mg；硝酸钙200mg；碘化钾0.83mg；硼酸6.2mg；四水硫酸锰22.3mg；硫酸锌8.6mg；钼酸钠0.25mg；硫酸铜0.025mg；氯化钴0.025mg；乙二胺四乙酸二钠26.11mg；硫酸亚铁19.46mg；肌醇100mg；甘氨酸2mg；盐酸硫胺素0.1mg；盐酸吡哆醇0.5mg；烟酸0.5mg；蔗糖30g；琼脂6g。
49.将上述药品分别用纯水溶解，与加热溶解后的琼脂混合。用稀盐酸配置0.5mg/ml的6-苄氨基嘌呤母液，用0.4mol/l氢氧化钠溶液配置0.5mg/ml的激动素母液。取0.5mg/ml的6-苄氨基嘌呤母液2.6ml、0.5mg/ml的激动素母液0.2ml加入上述混合溶液。用稀盐酸和氢氧化钠溶液调整溶液ph至5.8-6.0。将上述溶液定容至1l。将定容后的溶液分装至组培瓶，每瓶约40ml。放入灭菌锅，0.1mpb压强下，121℃灭菌18min，冷却后取出存放至无菌室。
50.利用上述培养基进行组织培养，30天后种子萌发率可达61％，组培苗在快繁培养基上继代后，分化率可达92％，平均出芽2.3个，平均株高1.3cm，白化死亡的组培苗低于5％。
51.综上，相比于一般的白檀组织培养，种子的萌发率以及组培苗的分化率、平均出芽数量、平均株高、存活率都有了明显的提高，效果更好。
52.实施例2
53.白檀的组织培养流程如图1所示：取饱满白檀种子，去除果肉和表面杂质，用洗衣粉溶液搓洗、流水冲洗过夜后，依次用75％酒精消毒30s、用3％～5％的次氯酸钠溶液浸泡5～10min，之后再用无菌水浸泡和冲洗，最后用无菌滤纸吸干表面水份，获得消毒的种子。
54.将消毒好的种子，接种至实施例1中的培养基进行萌发，并在萌发过程中不断挑出染菌种子，保留无菌种子，最终获得无菌组培苗。种子萌发的培养条件为光照时间16h/d，光强5000lux，温度光照时25℃，黑暗时18℃。
55.从上述无菌组培苗中挑选出可用于继代的有效芽，切成2～3cm，每个茎段上都带有至少1对腋芽，接种至不同快繁培养基上进行所述组培苗继代培养。组培苗继代培养条件为光照时间16h/d，光强5000lux，温度光照时25℃，黑暗时18℃。
56.上述快繁培养基成份为：
57.a1:ms培养基 1.2mg/l6-苄氨基嘌呤 0.1mg/l激动素 30g/l蔗糖 6.0g/l琼脂；
58.a2:改良ms培养基 1.2mg/l6-苄氨基嘌呤 0.1mg/l激动素 30g/l蔗糖 6.0g/l琼脂；
59.其中a1中的ms培养基各组分的具体含量为：
60.硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠37.3mg/l；硫酸亚铁27.3mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸
0.5mg/l。
61.其中a2改良ms培养基各组分的具体含量为：
62.硝酸钾1900mg/l；硝酸铵1650mg/l；磷酸二氢钾170mg/l；七水硫酸镁370mg/l；二水氯化钙440mg/l；碘化钾0.83mg/l；硼酸6.2mg/l；四水硫酸锰22.3mg/l；硫酸锌8.6mg/l；钼酸钠0.25mg/l；硫酸铜0.025mg/l；氯化钴0.025mg/l；乙二胺四乙酸二钠26.11mg/l；硫酸亚铁19.46mg/l；肌醇100mg/l；甘氨酸2mg/l；盐酸硫胺素0.1mg/l；盐酸吡哆醇0.5mg/l；烟酸0.5mg/l。
63.将种子分别在a1和a2培养基上培养培养28天后，生长情况如图2-6所示。观察生长状态并调查分化率、平均出芽数、平均高度等生长数据，结果如表1所示。
64.表1白檀组培苗生长数据调查表
65.培养基代号分化率(％)平均出芽数(个)平均株高(cm)a11001.280.44a2951.711.06
66.从表1生长数据看，a2分化率为95％，a1的分化率为100％，a2稍低于a1，但是a2的平均出芽数为1.71个，平均株高为1.06cm，而a1的平均出芽数为1.28个，平均株高为0.44cm，a2的平均出芽数和平均株高相较于a1更好。
67.综上，降低硫酸亚铁含量的改良ms培养基，比原ms培养基更有利于白檀组培苗的生长。
68.实施例3
69.设计正交实验，对6-ba和硝酸钙进行浓度梯度实验，讨论白檀的组织培养效果与硝酸钙和6-ba浓度的关系。培养基b1-b9中的改良ms，即实施例2中a2使用的改良ms培养基。
70.从所述白檀无菌组培苗上挑选出生长健壮的芽，用于继代培养，将其切成2～3cm长度的茎段，每个茎段上都带有至少1对腋芽，分别接种至培养基b1-b9上，培养基成份见表2。在无菌培养室进行培养，光照时间16h/d，光强5000lux，温度光照时25℃，黑暗时18℃。28天后调查生长量，生长量分析见表2。
71.表2c1-c9培养基成分
72.[0073][0074]
表3白檀组培苗生长量正交分析表
[0075]
[0076][0077]
如表3所示，通过正交分析表中的极差分析可知，6-ba浓度对平均出芽数影响较大，极差达到0.260，硝酸钙极差只有0.120，最高均值出现在6-ba浓度第二水平和硝酸钙浓度第三水平时，分别达到2.683和2.650。硝酸钙对平均株高影响较大，极差0.384，高于6-ba的0.360，平均株高的最高均值也出现在6-ba第二水平时，和硝酸钙第三水平时，分别达到1.940和1.987。
[0078]
因此，当培养基中的6-ba浓度为1.2mg/l，同时硝酸钙的浓度为0.2g/l时，是最好的组合，也就是培养基b6的组合，生长情况如图7-10所示。从实验结果看，平均出芽数3.55个和平均株高1.37cm都达到9组实验的最高值。
[0079]
当6-ba的浓度在1.1mg/l-1.3mg/l的范围内时，随着6-ba浓度升高，平均出芽数和平均株高呈现先升后降趋势，在6-ba浓度1.2mg/l时达到最大值。硝酸钙浓度在0.16g/l-0.2g/l的范围内时，随着硝酸钙浓度升高，白檀组织培养的效果随硝酸钙浓度的升高而得到改善，平均出芽数和平均株高一直呈现上升趋势，在0.2g/l时达到最大值。
[0080]
综上，培养基中的6-ba有最佳浓度，为1.2mg/l；而白檀的组织培养效果随着硝酸钙的添加，一直呈现上升的趋势。
[0081]
本技术提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本技术总的构思下的几个示例，并不构成本技术保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本技术方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本技术的保护范围。