发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用。


背景技术：

2.近年来，血栓成为继高血压、心脏病之后的又一类老年人高发疾病。因此，抗血栓食品及其作用成分的研究不断增加。血栓形成是心血管疾病致命性的主要原因，慢性血栓形成后可引起脑缺血、缺氧和坏死等病变。然而，大多数心脑血管疾病在发病前并无明显体征，发病突然且严重，如不能得到及时治疗，有很高的死亡风险。
3.炎症是引起血栓形成的一个重要因素，并且随着炎症的加剧往往导致血栓更严重。同时血栓形成和发展过程中产生的炎症反应常伴有氧化应激造成的损伤和大量活性氧(ros)的产生，此过程进一步使炎症加剧和血栓程度的加重。研究显示肠道菌群处于健康的平衡状态下有利于体内的有毒物质排出和防止有害菌产生的有害物质影响机体免疫力，机体内的有益菌更多能预防多种炎性疾病和抑制体内的自由基异常增加。因此，保持肠道健康是调节炎症和氧化应激的有效方式，也有可能能够对血栓的形成和发展起到关键作用。
4.四川泡菜作为一种自然发酵的蔬菜，含有丰富的微生物，部分四川泡菜的保健作用可能在很大程度上与其所含的乳酸菌群有关。传统的四川泡菜在制作中由于使用不同的蔬菜，同时发酵温度和发酵时间等因素也存在差异，因此传统四川泡菜比工厂化生产的泡菜含有更丰富的微生物组成。有研究证实从四川泡菜中分离得到的乳酸菌在肠道内具有较好的定殖作用，对包括便秘、结肠炎在内的肠道疾病有很好的预防和干预作用。但是目前还没有关于乳酸菌在降低血栓产生的风险方面的报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供发酵乳杆菌在制备预防和/或治疗血栓产品中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，该发酵乳杆菌可以对血栓形成发挥良好的抑制作用。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种保藏编号为cgmcc no.14493的发酵乳杆菌(lactobacillusfermentum)cqpc04在制备预防和/或治疗血栓的产品中的应用。
8.进一步地，所述发酵乳杆菌cqpc04通过调节肠道微生物组成，增加有益菌，维持肠道健康，发挥对血栓形成的抑制作用。
9.进一步地，所述发酵乳杆菌cqpc04改善血栓造成的凝血异常。
10.进一步地，所述发酵乳杆菌cqpc04降低血栓引起的氧化损伤和炎症反应。
11.本发明公开了以下技术效果：
12.本发明公开了一株发酵乳杆菌cqpc04(lf-cqpc04)对血栓形成的抑制作用。实验结果表明，lf-cqpc04能有效调节凝血功能、血清和组织中的氧化应激和炎症水平。对肠道菌群的研究进一步显示lf-cqpc04可以调节肠道微生物组成，可能通过增加有益菌使肠道
健康，进而对血栓形成发挥良好的抑制作用。
附图说明
13.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
14.图1为血栓小鼠的黑尾形态；
15.图2为血栓小鼠的aptt、tt、fib和pt；
16.图3为血栓小鼠血清的sod、cat酶活性和mda水平；
17.图4为血栓小鼠血清的tnf-α、il-6、nf-κb和il-1β水平；
18.图5为血栓小鼠尾部组织的h&e染色切片；
19.图6为血栓小鼠结肠组织中cu/zn-sod、mn-sod、cat、nf-κb p65、il-6、tnf-α和 ifn-γ的mrna表达；
20.图7为血栓小鼠尾静脉组织中nf-κb p65、icam-1、vcam-1和e-selectin的mrna表达；
21.图8为血栓小鼠肠道内容物中基于16s rrna多样性分析的微生物组平均细菌组成(门级)；
22.图9为血栓小鼠肠道内容物中基于16s rrna多样性分析的微生物组平均细菌组成(属级)。
具体实施方式
23.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
24.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
25.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
26.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
27.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
28.实施例1
29.1材料与方法
30.1.1材料与试剂
31.发酵乳杆菌cqpc04是从泡菜中分离鉴定的，发酵乳杆菌cqpc04已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号)，保藏编号为cgmcc no.14493，保藏时间为2017年08月04日，分类命名为发酵乳杆菌lactobacillus fermentum。
32.spf级雄性昆明小鼠，6周龄，体重为23
±
2g，购于重庆医科大学实验动物中心(生产许可证号：scxk(渝)2018-0003)。本研究中实验经过重庆市功能性食品协同创新中心动物实验伦理委员会批准实施(批准号：2021070010b)。
33.肝素：美国sigma公司；tnf-α、il-6、nf-κb和检测试剂盒：上海酶联生物科技有限公司；sod、cat和mda：南京建成生物工程研究所；trizol试剂：美国invitrogen公司； sybr green pcr master mix、qpcr引物：美国thermo fisher scientific公司；其余试剂均为国产分析纯。
34.1.2仪器与设备
35.pun-2048a半自动血凝仪：北京普朗有限公司；bx43显微镜：日本奥林巴斯公司； varioskan lux多功能酶标仪、stoponeplus定量pcr仪：美国赛默飞世尔科技公司；agilent 2100生物分析仪：美国安捷伦公司。
36.1.3方法
37.1.3.1动物实验
38.昆明小鼠进行7d的适应性喂养后开始实验。适应性喂养后选出体重在23
±
2g的小鼠，选出的小鼠被随机进行分组，分为正常组、模型组、肝素组、lf-cqpc04低浓度(lf-cqpc04-l) 组和lf-cqpc04高浓度(lf-cqpc04-h)组，每组10只小鼠，共计50只。正常组的小鼠腹腔注射生理盐水(0.01ml/g bw
·
d)，其余各组的小鼠腹腔注射角叉菜胶溶液(0.2％、0.01 ml/g bw
·
d)诱导血栓形成，连续注射10d。注射角叉菜胶的10d中，肝素组小鼠灌胃肝素溶液(20mg/kg bw
·
d)，lf-cqpc04-l组和lf-cqpc04-h组小鼠实施灌胃lf-cqpc04(10
8 cfu/kg bw
·
d和109cfu/kg bw
·
d)。10d实验完成后采用颈椎脱臼法对小鼠实施处死，拍照测定小鼠尾部黑尾长度，然后解剖后取出结肠中的内容物，同时对小鼠取心脏血和结肠待用。
39.1.3.2血液凝血情况测定
40.将收集的小鼠血液置于离心管中，然后用半自动血凝仪测量小鼠血液的aptt、tt、fib 和pt。
41.1.3.3氧化指标测定
42.收集到的小鼠血液在4℃下以4000rpm的转速离心分离10min得到上清液血清，然后使用检测试剂盒对小鼠血清中的sod、cat活力和mda水平进行测定。
43.1.3.4炎症细胞因子测定
44.按1.3.3法制备小鼠的血清，然后使用细胞因子检测试剂盒对小鼠血清中的tnf-α、il-6、 nf-κb和il-1β水平进行测定。
45.1.3.5病理学观察
46.取解剖后小鼠的尾组织用10％福尔马林溶液固定。脱水处理48h，然后组织样品在石蜡中进行包埋后切片，并用苏木精-伊红(h&e)对组织进行染色。最后在光学显微镜下观察胃组织的病理学变化。
47.1.3.6定量聚合酶链反应实验
48.取小鼠结肠中段组织和剥离出小鼠尾静脉组织，分别取出100mg，用生理盐水洗净组织后再按1：9比例加入干净的生理盐水，组织匀浆后加入rnazol试剂(1.0ml)对小鼠组织中的rna进行提取，再将提取到的rna浓度调整到1μg/μl。进而进行反转录得到cdna，接着配制反应体系，体系溶液包含cdna(1μl)、sybr green pcr master mix(10μl)、无菌蒸馏水(7μl)、pcr引物(上下游各1μl，浓度为10μmol/l)。配置好的反应溶液进行扩增，扩增条件为95℃持续60s；95℃持续15s，进行40个循环；55℃持续30s；72℃持续 35s；95℃持续30s；55℃持续35s。gapdh被用作内参基因(表1)，并使用2-δδct
法分析各表达基因的相对量。
49.表1本实验中使用的引物序列
[0050][0051]
1.3.7高通量测序
[0052]
将取出的小鼠肠道内容物用ampure xp磁珠进行纯化和去除扩增产物中的游离引物和引物二聚体。使用通用illumina适配器和索引对待测样品进行推进和文库构建。测序前用 qubit 2.0green双链dna测定法测定各pcr产物的dna浓度，并使用生物分析仪进行质量控制。根据扩增子的浓度，将它们以等摩尔比合并，并根据制造商的说明使用illumina miseq 系统进行测序。最后使用在线majorbio云平台分析数据。
[0053]
1.4统计学分析
[0054]
完成三次平行实验得到的数据以平均值
±
标准偏差方式表示。然后采用单因素方差分析法对数据之间的显著差异性(p《0.05)进行分析。
[0055]
2结果与分析
[0056]
2.1小鼠黑尾长度
[0057]
小鼠腹腔注射角叉菜胶后，除正常组外，其余各组小鼠尾尖逐步出现黑色区域，提示尾部形成血栓，造成黑尾(图1)。其中模型组小鼠的黑尾最长(9.4
±
0.4cm)，显着高于其他组 (p《0.05)。lf-cqpc04-h组小鼠黑尾长度(3.2
±
0.4cm)与肝素组(3.0
±
0.2cm)相似，且无显著差异。而lf-cqpc04-h组和肝素组的黑尾长度明显短于lf-cqpc03-l组(7.8
±
0.5cm， p《0.05)。
[0058]
2.2小鼠的aptt、tt、fib和pt
[0059]
正常组小鼠aptt显着高于其他组(图2)，tt、fib和pt则显着低于其他组(p《0.05)。而模型组的aptt显着低于其他组，tt、fib、pt则显着高于其他组(p《0.05)。lf-cqpc04-h 组的aptt明显高于lf-cqpc04-l组；tt、fib、pt均显着(p《0.05)低于lf-cqpc04-l 组。lf-cqpc04-h组aptt、tt、fib、pt与肝素组相似，差异无统计学意义(p》0.05)。
[0060]
2.3小鼠血清的sod、cat活性和mda水平
[0061]
血清检测结果显示，正常组小鼠血清中的sod和cat酶活性在各组中最高(p《0.05)， mda水平最低(图3)。肝素组和lf-cqpc04-h组的sod和cat酶活性略低于正常组，高于lf-cqpc04-l组(p《0.05)。模型组小鼠sod和cat酶活性最低(p《0.05)。模型组mda 水平最高，lf-cqpc04-l组mda水平低于模型组，高于肝素组和lf-cqpc04-h组(p《0.05)。
[0062]
2.4小鼠血清的tnf-α、il-6、nf-κb和il-1β水平
[0063]
实验结果表明，正常组、肝素组、lf-cqpc04-h、lf-cqpc04-l和模型组小鼠血清中 tnf-α、il-6、nf-κb和il-1β水平呈现出由低到高的趋势(图4)。其中，肝素组和 lf-cqpc04-h组tnf-α、il-6、nf-κb、il-1β水平显着低于lf-cqpc04-l组(p《0.05)，但肝素组与lf-cqpc04-h组之间的差异无统计学意义(p》0.05)。
[0064]
2.5小鼠尾组织的病理学观察
[0065]
h&e染色切片显示，正常组小鼠尾部血管圆润干净，血管壁光滑(图5)。模型组观察到尾血管有炎性渗出、出血性病变、血小板聚集和血管内血栓形成的情况。lf-cqpc04和肝素均能减轻小鼠尾部血管的病变。lf-cqpc04-h和肝素的效果优于lf-cqpc04-l，且 lf-cqpc04-h和肝素的作用相似。
[0066]
2.6小鼠结肠组织的相关mrna表达
[0067]
定量聚合酶链反应(qpcr)实验结果显示，正常组小鼠结肠组织中cu/zn-sod、mn-sod 和cat的mrna表达最强(图6)，而在模型组中是最弱的。lf-cqpc04-h组和肝素组小鼠结肠组织中cu/zn-sod、mn-sod和cat的表达强度相似，且强于lf-cqpc04-l组。正常组小鼠结肠组织中nf-κb p65、il-6、tnf-α和ifn-γ的表达明显弱于其他组，而模型组则明显高于其他组(p《0.05)。lf-cqpc04和肝素均能下调血栓小鼠结肠组织中nf-κb p65、il-6、 tnf-α和ifn-γ的表达，lf-cqpc04-h与肝素的效果相似，两者的效果均显着优于 lf-cqpc04-l(p《0.05)。
[0068]
2.7小鼠尾静脉组织的相关mrna表达
[0069]
qpcr实验结果显示，模型组小鼠尾静脉血管中nf-κb p65、icam-1、vcam-1和 e-selectin的mrna表达最强(图7)。lf-cqpc04-l、lf-cqpc04-h和肝素可显着(p《0.05) 下调血栓小鼠尾静脉血管中nf-κb p65、icam-1、vcam-1和e-selectin的表达。同时，这些表达在lf-cqpc04-h和肝素组小鼠之间没有显着差异(p》0.05)，仅略高于正常组。
[0070]
2.8小鼠肠道内容物菌群多样性
[0071]
通过对alpha多样性指数进行分析，得到了小鼠肠道内容物菌群中菌群的丰富度、多样性等信息。结果如表2所示，各组之间的alpha多样性指数ace值、chao值、shannon指数及simpson值存在显著性差异(p《0.05)。与模型组相比，正常组、lf-cqpc04组和肝素组小鼠粪便中菌群的丰度更高，并且不同剂量lf-cqpc04组间的菌群丰度存在较大的差异。其中，lf-cqpc04-h组中菌群多样性指数高于lf-cqpc04-l组。同时，alpha多样性分析也表明，小鼠灌胃lf-cqpc04后，其肠道菌群的多样性也显著高于模型组。其中lf-cqpc04-h 组的粪便
菌群丰度最高，高于正常组和肝素组。
[0072]
表2阿尔法(alpha)多样性指数
[0073][0074]
2.9小鼠肠道内容物菌群组成
[0075]
根据微生物分类学分析结果可以观察到不同组小鼠肠道内容物中在各分类水平上的群落结构组成情况。如图8所示，5组的菌群组成在门的水平上，以拟杆菌门、厚壁菌门和放线菌门3个菌门为主。与模型组相比，厚壁菌门与拟杆菌门的比值在正常组中显著降低(1.28)。经过lf-cqpc04干预后，与模型组和未干预正常组相比，厚壁菌门与拟杆菌门的比值显著下降，lf-cqpc04-l组：0.82，lf-cqpc04-h组：0.78。阳性对照肝素组为0.40，各组存在显著性差异。厚壁菌门与拟杆菌门的比值随着lf-cqpc04剂量的提高而降低。
[0076]
图9显示了五个类群在属水平上的区系组成。模型组菌群主要为副杆菌、克雷伯菌和类杆菌。正常组的菌群包括类杆菌、乳酸杆菌和鼠杆菌科，lp-cqpc04-h组的菌群包括类杆菌、乳酸杆菌、alistipes和拉克诺菌科。口服lf-cqpc04后，小鼠肠道内乳酸菌含量显著增加 (p《0.05)。lp-cqpc04-h组显示出最显著的增加效应，与正常组接近。此外，与模型组相比，口服lp-cqpc04后，克雷伯菌等病原菌数量减少，且随着lp-cqpc04剂量的增加，其数量也呈下降趋势。
[0077]
角叉菜胶能够引起小鼠尾部血管内炎症相关血栓的形成，使小鼠尾部血管充满混合血栓，进而导致尾部组织缺血性坏死，在小鼠尾部肉眼可见为黑色。因此小鼠黑尾的长度是直观判断血栓形成程度的重要实验指标。本试验也证明了角叉菜胶可以在小鼠尾部形成明显的黑尾。肝素和lf-cqpc034均能减轻血栓引起的尾部发黑，且高浓度lf-cqpc04效果优于低浓度lf-cqpc04。此外，lf-cqpc03-h可以达到与常用抗血栓药物肝素相近的效果。
[0078]
在血栓形成过程中大量凝血因子被消耗，从而使pt延长，而失去凝血因子将会导致aptt 缩短。同时，在凝血酶的不断作用下，fib不断转化为纤维蛋白，而纤维蛋白作为血栓的主要成分则促使血液处于高凝状态。而血液由于持续保持高凝状态，加上血液中纤维蛋白含量也持续增加，机体被迫加强纤溶作用使纤维蛋白不断降解，从而使tt也延长。本试验中 lf-cqpc04和肝素均能调节aptt、tt、fib和pt，特别是lf-cqpc04-h和肝素能够使这些指标接近正常状态，改善血栓造成的小鼠凝血异常。
[0079]
自由基积累是诱发和加剧血栓形成的重要因素，ros可以直接激活血小板，增加血栓形成的风险。ros还可激活nf-κb信号通路，促进血栓分子分泌，导致静脉血栓的形成。研究表明自由基清除剂可以预防铁离子诱发的血栓形成，体现了氧化应激在血栓形成中的重要作用。sod可催化超氧阴离子自由基歧化生成氧气和过氧化氢，在体内平衡氧化和抗氧化方面起着至关重要的作用。cu/zn-sod和mn-sod是哺乳动物中存在的两种重要的sod类型。 cat是一种酶清除剂，可促进过氧化氢分解为分子氧和水，其酶活性为身体提供抗氧化防御。作为抗氧化酶，sod和cat既是防止ros对机体造成损害的重要酶，也是抑制氧化应激引起血栓形成的有效活性物质。在生物体中，自由基引起脂质引起过氧化，从而形成mda，能够
间接反映机体受到氧化应激损伤的程度，因此mda水平也可能是血栓形成的重要指标。本试验中，血栓形成后小鼠体内氧化应激水平升高，sod和cat抗氧化酶水平及mrna表达降低，mda水平升高，结果与以往研究相同。这些结果表明血栓形成与氧化应激密切相关。在高浓度下，lf-cqpc04可以促使这些与氧化相关的指标达到接近正常状态的水平，且 lf-cqpc04-h的效果达到了抗血栓药物肝素的水平。
[0080]
炎症在血栓的形成过程中有相互促进的循环作用，机体出现炎症后，tnf-α、il-6、nf-κb 和il-1β等炎症介质大量产生，其中tnf-α可以调节下游nf-κb信号通路，然后促进巨噬细胞释放il-6、il-1β和ifn-γ等炎症因子，从而加剧血管内皮细胞损伤，促使血栓的逐步形成。本试验中小鼠血栓形成后tnf-α、il-6、nf-κb、il-1β和ifn-γ的细胞因子水平或mrna表达也出现大幅度提升，lf-cqpc04显示出明显的细胞因子抑制效果，lf-cqpc04-h的效果能达到药物肝素的效果。小鼠体内的炎症和氧化应激反应导致尾部出现血栓，同时也会引起肠道炎症，导致肠道内皮细胞损伤。因此，观察肠道损伤程度也是判断角叉菜胶引起的实验性血栓形成程度的一种手段。本试验观察显示，小鼠尾部血栓形成后，小鼠结肠组织的炎症表达也出现变化，再次证明小鼠尾部血栓形成与肠道病变密切相关。药物肝素和lf-cqpc04 都可以抑制这些表达变化的激活和增强。因此，具有益生菌潜力的lf-cqpc04可以发挥与肝素相近的作用。
[0081]
血栓形成和发展的过程中nf-κb作为炎症关键因子具有非常重要的作用，nf-κb能够促进血小板的大量积累和炎症的加剧，使机体中的凝血平衡被打破，从而诱发血栓的形成。 icam-1在调节细胞基质的粘附中有很重要的作用，而vcam-1能够进一步促进血小板的积累，icam-1和vcam-1的激活和过表达都能够加剧炎症和诱发血栓。e-selectin的激活能够加剧内皮细胞的验证，导致内皮细胞出现损伤和影响其通透性，同时对血液中的总白细胞数产生影响，还可以调控血管内皮细胞之间的黏附性，这些影响均直接与血栓的形成相关。而 nf-κb则是icam-1、vcam-1和e-selectin关键调节基因，从而关联相关基因的表达，影响血栓的形成。本试验也显示lf-cqpc04对nf-κb、icam-1、vcam-1和e-selectin的表达具有明显的调控作用，从而调控血栓的发展。
[0082]
研究显示肠道菌群与炎症和氧化应激反应密切相关，临床数据显示疾病患者的肠道菌群与健康人群的肠道菌群存在较大差异，疾病患者肠道菌群中的有害菌增加，菌群的丰度相比正常状态会出现较大变化。肠道菌群失衡与心血管疾病密切相关，高脂血症、肥胖、2型糖尿病等疾病的发病过程中肠道菌群都出现明显变化。本发明实验显示血栓导致小鼠肠道菌群丰度发生变化，lf-cqpc04可以调节血栓小鼠的细菌丰度，恢复肠道健康，这可能在抑制血栓形成中发挥作用。
[0083]
副拟杆菌属(parabacteroides)是与促进肥胖有关微生物；克雷伯氏菌属(klebsiella) 是肠道中仅次于大肠杆菌的第二大有害菌。实验结果表明，模型小鼠肠道内的有害细菌较多，包括副拟杆菌和克雷伯氏菌。乳酸杆菌属(lactobacillus)是可用作益生菌的一类微生物，正常小鼠的肠道中含有较多有益的乳酸杆菌。另支菌属(alistipes)已被证明具有干扰炎症的作用，而毛螺菌科(lachnospiraceae)已显示出对造血系统和肠道系统的保护作用。乳酸杆菌属、另支菌属和毛螺菌科微生物都是人体中重要的有益细菌，lf-cqpc04能够增加血栓小鼠肠道中这些有益菌的数量，从而恢复肠道健康，减轻炎症，进而抑制血栓形成。
[0084]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。