一种HDAC6抑制剂在重症感染中的应用

一种hdac6抑制剂在重症感染中的应用
技术领域
1.本发明涉及hdac6抑制剂在防治重症感染中的应用。


背景技术：

2.细菌、病毒等病原微生物引起的重症感染(severe infection)会导致机体免疫功能低下，继发其他多种病原的混合感染或者迁延不愈的慢性感染，严重影响患者的生存质量。重症感染引起的免疫抑制会损害淋巴细胞群的功能，其中自然杀伤细胞(natural killer cell，nk细胞)数目减少和反应性降低与感染后期机体免疫功能低下密切相关，因而改善重症感染过程中nk细胞数目以及反应性降低程度是提高重症感染生存率的有效方法之一。
3.研究表明，nk细胞经组蛋白去乙酰化酶广谱抑制剂丙戊酸(valproic acid)处理之后，表面nkg2d的表达下降，杀伤功能受到了很大程度的抑制(ni l,wang l,yao c,et al.the histone deacetylase inhibitor valproic acid inhibits nkg2d expression in natural killer cells through suppression of stat3 and hdac3.rep,2017,7:45266.)，而组蛋白去乙酰化酶广谱抑制剂entinostat可以通过上调nkg2d及其配体增强nk细胞对癌细胞的杀伤(shiguo,zhu,cecele,et al.the narrow-spectrum hdac inhibitor entinostat enhances nkg2d expression without nk cell toxicity,leading to enhanced recognition of cancer cells.pharmaceutical research,2015.)。组蛋白去乙酰化酶抑制剂还可以发挥保护脓毒症急性肺损伤的作用，其机制可能是通过降低炎症反应和减少细胞凋亡(陈隆望等.组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古霉素a对脓毒症小鼠急性肺损伤的保护作用.中华急诊医学杂志,2018,27(03):275-282.)。但是曲古霉素a等广谱的去乙酰化抑制剂，其毒性和副作用限制了在临床上的应用。
4.研究表明，组蛋白去乙酰化酶6(histone deacetylase 6，hdac6)是一种对非组蛋白底物具有去乙酰化酶活性且定位于细胞质中的重要调控分子，参与机体炎症反应过程中多种免疫细胞的功能调控。例如应用hdac6抑制剂cay10603后，可通过抑制lps诱导的小鼠腹腔巨噬细胞内stat1(try701)活化及irf-1合成，从而抑制i nos过表达及no过量生成(王艳.hdac6通过调控巨噬细胞一氧化氮生成促进脓毒症发展的机制研究.吉林大学,2020.doi:10.27162/d.cnki.gjlin.2020.007259.)。但目前尚未见hdac6参与调控重症感染诱导的nk细胞功能低下的报道。同时tubastatin a作为一种特异性的hdac6抑制剂对nk细胞功能的影响未见报导。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供hdac6抑制剂在重症感染中的应用。
6.为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
7.本发明通过小鼠腹腔注射1
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金黄色葡萄球菌(6.2
×
108cfu)或大肠杆菌(3.5
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107cfu)，构建c57bl/6j野生型小鼠重症感染模型。在细菌感染后1h给予hdac6抑制剂，观
察记录不同组染菌小鼠临床症状，并统计小鼠存活率及检测腹腔载菌量；取不同组染菌小鼠的肺脏、肝脏、肾脏，制作石蜡切片后观察组织病理变化；流式细胞术检测不同组染菌小鼠脾脏中nk细胞数目、比例及反应性变化情况。结果表明，给予hdac6抑制剂(例如tubastatin a等选择性抑制剂，靶向抑制hdac6活性)的重症感染小鼠与给予对照溶剂的重症感染小鼠相比，nk细胞数目和反应性降低的程度明显减弱，并且小鼠的存活率得到提高，临床症状评分得到改善，组织损伤程度减轻。
8.本发明进一步对重症感染后期存活的不同组染菌小鼠进行二次感染，观察记录小鼠临床症状和组织病理变化，并统计二次感染后小鼠存活率。结果表明，给予hdac6抑制剂后存活的重症感染小鼠与给予对照溶剂后存活的重症感染小鼠相比，在二次感染后的存活率明显提高，并且小鼠的临床症状评分明显更低，组织损伤程度更轻。
9.本发明的有益效果体现在：
10.本发明采用hdac6抑制剂对nk细胞在严重病原体(例如致病菌)感染中抗感染作用和调控机体炎症反应平衡作用的发挥进行了有效干预，可以减少由重症感染等导致的死亡情况的发生，为重症感染的预防及治疗提供新思路。本发明采用的hdac6抑制剂显著提高了重症感染机体在存活后抵抗二次感染的能力。
11.进一步的，本专利采用的tubastatin a(或其药学上可接受的盐，例如tubastatin a hydrochloride、tubastatin a trifluoroacetate salt等)作为特异性的hdac6抑制剂，在存在炎症细胞因子刺激的情况下可以提高重症感染机体中nk细胞的数目、比例及反应性。
附图说明
12.图1为hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠体征和抗感染能力影响的结果；其中a、b为小鼠感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌后不同时间存活率；c、d为小鼠感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌后不同时间临床症状评分；e、f为小鼠感染金黄色葡萄球菌、大肠杆菌后48h腹腔细菌数目；*、**表示相对于“s.aureus dmso”或“e.coli dmso”组具有统计学显著性差异。
13.图2为hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠肺组织病理变化的影响结果。
14.图3为hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠肝组织病理变化的影响结果。
15.图4为hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠肾组织病理变化的影响结果。
16.图5为流式细胞术检测hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠nk细胞的影响结果；其中a为小鼠感染金黄色葡萄球菌后脾脏nk细胞比例和数目的变化情况；b为小鼠感染大肠杆菌后脾脏nk细胞比例和数目的变化情况；*表示相对于对照组(dmso)p《0.05，**表示相对于对照组(dmso)p《0.01，
##
表示相对于给予dmso的感染组p《0.01。
17.图6为流式细胞术检测hdac6抑制剂tubastatin a对重症感染小鼠nk细胞反应性的影响结果；其中a为小鼠脾脏淋巴细胞(金黄色葡萄球菌感染后48h分离)在给予il-2和il-12体外刺激6h下的nk细胞ifn-γ阳性率及nk细胞ifn-γ表达水平；b为小鼠脾脏淋巴细胞(大肠杆菌感染后48h分离)在给予il-2和il-12体外刺激6h下的nk细胞ifn-γ阳性率及nk细胞ifn-γ表达水平；**表示相对于对照组(dmso)p《0.01；
##
表示相对于给予dmso(未给予tubastatin a)的低剂量感染组p《0.01；
&
表示相对于给予dmso(未给予tubastatin a)的
高剂量感染组p《0.05。
18.图7为hdac6抑制剂tubastatin a干预对存活小鼠二次感染后体征影响的结果；其中a、b为小鼠二次感染后的存活率(以二次感染的开始时间作为0h)；c、d为小鼠二次感染后的临床症状评分(以一次感染的开始时间作为0h)，**表示相对于对照组(dmso)p《0.01。
19.图8为小鼠(一次感染金黄色葡萄球菌)二次感染大肠杆菌后主要脏器组织病理学观察结果。
20.图9为小鼠(一次感染大肠杆菌)二次感染金黄色葡萄球菌后主要脏器组织病理学观察结果。
具体实施方式
21.下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。
22.本发明首先通过对小鼠腹腔注射1
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金黄色葡萄球菌(s.aureus)或大肠杆菌(e.coli)，构建小鼠重症感染模型。在细菌感染后1h，给予hdac6抑制剂(例如特异性的抑制剂tubastatin a，简称tub a)干预，观察记录小鼠临床症状，测定感染后48h小鼠腹腔细菌数目和观察肺脏(lung)、肝脏(liver)、肾脏(kidney)组织病理变化，同时通过流式细胞术检测小鼠脾脏中nk细胞数目、比例及反应性变化情况。之后进一步对重症感染后期存活小鼠进行细菌二次感染，对二次感染后的小鼠进行临床症状和组织病理学观察。上述金黄色葡萄球菌、大肠杆菌采用分离株(经过16s测序及进行基因进化树分析，结果显示该金黄色葡萄球菌分离株与genbank登录号为cp049545.1的致病性金黄色葡萄球菌属于近缘发育分枝，该大肠杆菌分离株与genbank登录号为cp027103.1的致病性大肠杆菌属于近缘发育分枝)。(一)小鼠重症感染模型的建立及分组
23.c57bl/6小鼠对照组(ctrl)，每只健康小鼠腹腔注射0.5ml 0.9％无菌生理盐水，注射生理盐水后1h腹腔注射等体积的dmso(未感染溶剂对照)或tub a(未感染抑制剂对照)；c57bl/6小鼠高剂量感染干预组(s.aureus或e.coli tub a或dmso)，每只健康小鼠按照1
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腹腔注射6.2
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108cfu的金黄色葡萄球菌菌液或3.5
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107cfu的大肠杆菌菌液，细菌感染后1h腹腔注射hdac6抑制剂tub a(70mg/kg，溶剂为dmso)或等体积dmso；c57bl/6小鼠低剂量感染干预组，每只健康小鼠腹腔注射6.2
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106cfu的金黄色葡萄球菌菌液或3.5
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105cfu的大肠杆菌菌液，细菌感染后1h腹腔注射hdac6抑制剂tub a(70mg/kg，溶剂为dmso)或等体积dmso；c57bl/6小鼠重症感染组，每只健康小鼠腹腔注射6.2
×
108cfu的金黄色葡萄球菌菌液或3.5
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107cfu的大肠杆菌菌液。
24.(二)临床症状观察
25.分别在细菌感染后的4h、8h、12h、24h、48h、96h、192h观察记录试验小鼠的临床症状，并根据小鼠临床症状评分标准进行半定量评分(okeke et al.2014)：0，没有表现出明显临床症状；1，小鼠被毛杂乱但很活泼；2，小鼠被毛杂乱，精神沉郁，行动迟缓；3，小鼠出现弓腰，移动困难，病重；4，小鼠眼角有大量分泌物，便秘，垂死；5，死亡。绘制临床评分均值曲线，在试验结束后，统计小鼠死亡情况。
26.结果显示，在金黄色葡萄球菌或大肠杆菌感染后给予hdac6抑制剂tub a，显著提高了重症感染小鼠的存活率(图1a、图1b)，以及减轻了重症感染小鼠的临床症状(图1c、图
1d)。
27.(三)腹腔载菌量测定
28.细菌感染后48h剖杀小鼠，通过计数小鼠腹腔内的细菌数来评估机体的抗感染能力：在无菌超净台中，小鼠腹腔注射4ml无菌生理盐水，对小鼠腹部进行充分按摩后吸取腹腔液体，之后将腹腔吸取液进行梯度稀释，梯度稀释后均匀涂布于lb琼脂平板上，37℃培养过夜，计数平板细菌数。
29.结果显示，给予hdac6抑制剂tub a的重症感染小鼠在感染后48h腹腔细菌数目显著降低(图1e、图1f)。
30.(四)组织病理学观察
31.细菌感染后48h，对小鼠进行剖检，经由以下步骤完成he染色石蜡组织切片的制作：
32.取材及固定：摘取试验小鼠的肺脏、肝脏及肾脏，将所取组织置于广口瓶中用4％中性甲醛进行固定，固定时间48h，保证固定液和组织的比例至少为10:1。
33.修块：将固定完全的组织块修成适当大小(大小不超过0.5cm3)，之后将修好的组织块放入组织包埋框中，流水冲洗过夜。
34.脱水、透明及浸蜡：将装有组织块的包埋框依次经过70％、80％、90％、95％酒精溶液(各1h)，100％酒精i、ii(各30min)，二甲苯i、ii(各2～5min)，石蜡i、ii(各1h)，从而完成脱水、透明、浸蜡。
35.不同组织的透明时间不同，肝脏：二甲苯i(5min)，二甲苯ii(5min)；肺脏：二甲苯i(3min)，二甲苯ii(2min)；肾脏：二甲苯i(5min)，二甲苯ii(2min)。
36.包埋：把熔蜡倒入模具内，再用镊子夹取组织块，使切面朝下平整的置放于模具底面的中央处，之后覆盖一次性包埋盒，注入石蜡少许，以不溢出为宜，稍置片刻后移入冷凝台面上，自然凝固。
37.切片、展片及烘片：修样切片，切片厚度一般为5μm；将切下的切片选取部分置于38℃温水中，待切片充分展开后，以载玻片捞取切片，尽量使切片黏附于载玻片靠中间部位；将黏附好的切片烘干，置于展片板上，37℃恒温箱中过夜烘干。
38.染色：将烘干的切片依次放入二甲苯i、ii(各10min)，100％、95％、90％、80％、70％酒精溶液(各3min)，苏木精染液(15min)，自来水冲洗(5min)，再经1％盐酸酒精分化(10s)，自来水冲洗(5min)，伊红染色(15s)，90％酒精溶液(2min)，95％酒精溶液(1.5min)，100％酒精i、ii(各1.5min)，二甲苯i、ii(各10min)。
39.封片：自二甲苯中取出切片，滴少量的中性树胶于组织片中央，用镊子夹取盖玻片封片，封片后放置在通风橱中自然干燥，贴好标签，he染色石蜡组织切片制作完成。置于显微镜下观察并记录各组织脏器的病理变化。
40.经he染色后置显微镜下进行观察。结果显示，健康小鼠注射tub a或对照溶剂dmso后未出现明显组织病变。在金黄色葡萄球菌或大肠杆菌感染后，给予dmso的重症感染小鼠肺组织表现为瘀血、明显的肺泡壁增厚和大量炎性细胞浸润；肝细胞索紊乱，部分细胞变性、坏死，少量炎性细胞浸润；肾小管上皮细胞肿胀、变性。而与给予dmso的重症感染小鼠相比，给予tub a干预明显减轻了重症感染小鼠肺、肝、肾的组织损伤(图2、图3、图4)。
41.(五)脾淋巴细胞悬液制备
42.用颈椎脱臼法处死小鼠，酒精消毒小鼠整个皮肤表面，在超净工作台中剪开小鼠左腹侧的皮肤和腹膜，小心摘取脾脏，用4℃预冷含2％血清的pbs冲洗脾脏两次，置于200目不绣钢筛网上进行研磨，研磨后用含2％血清的pbs冲洗过滤，收集滤液并转移至50ml离心管中。350
×
g室温离心7min，弃去上清，加入4ml红细胞裂解液，加入裂解液后立即重悬沉淀，每隔1min轻轻晃动一次使裂解更加充分，在室温下裂解2～4min后加入25ml含2％血清的pbs终止裂解。350
×
g室温离心7min，弃去上清(如裂解不完全，可再次进行裂解)，含2％血清的pbs冲洗两次，4ml含2％血清pbs重悬沉淀，即为脾淋巴细胞悬液。
43.(六)流式细胞术检测nk细胞比例和ifn-γ产生水平
44.收集脾淋巴细胞悬液后进行细胞计数，计数后吸取100μl细胞悬液(2
×
106个细胞)于1.5ml离心管中，加入标记细胞表面特异性抗原的抗体(cd3-fitc、nk1.1-pe)，4℃避光放置30min，4℃预冷的pbs洗2次，500μl pbs重悬，细胞重悬之后通过流式细胞术检测分析nk细胞比例。
45.结果显示，与未感染小鼠相比，金黄色葡萄球菌诱导(6.2
×
108cfu)的重症感染小鼠(给予dmso)脾脏nk细胞数目显著减少，而给予tub a的重症感染小鼠nk细胞数目和比例明显高于未给予tub a(给予了dmso)的重症感染小鼠nk细胞数目和比例(图5a)；在利用大肠杆菌诱导(3.5
×
107cfu)的重症感染小鼠模型中也显示出相同的结果(图5b)。以上结果提示，hdac6抑制剂tub a可以显著减弱重症感染诱导的小鼠脾脏nk细胞比例、数目减少程度。
46.收集脾淋巴细胞悬液后进行细胞计数，计数后吸取100μl细胞悬液，分别接种于24孔板中，每孔中分别加入1ml rpmi-1640细胞培养基、rmil-2(100u/ml)和rmil-12(5ng/ml)，轻轻混合均匀后置于细胞培养箱中培养2h，之后每孔加入1μl莫能菌素，继续培养4h后收集细胞至1.5ml离心管中，pbs洗两次，并依据流式细胞术检测细胞表面标志步骤进行cd3、nk1.1染色，在细胞表面染色完成后，pbs洗两次，之后每管中加入200μl细胞固定液，轻轻重悬细胞，4℃固定4h以上。固定后pbs洗两次，每管中加入200μl通透液重悬细胞，透膜7min，450
×
g室温离心7min，弃去上清，重复一次透膜步骤。加入特异性的胞内标记抗体ifn-γ抗体，常温避光放置40min。pbs洗2次，用500μl pbs重悬细胞，通过流式细胞仪对重悬后的细胞进行检测和分析。
47.检测分析后发现，不同组未感染小鼠(tub a抑制剂对照组和dmso溶剂对照组)nk细胞在给予il-2和il-12刺激后ifn-γ (阳性)nk细胞的百分比和nk细胞ifn-γ的表达水平没有显著差异；6.2
×
108cfu或6.2
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106cfu的金黄色葡萄球菌感染均可显著增加ifn-γ (阳性)nk细胞比例和ifn-γ表达水平，但给予dmso的高剂量(high dose)感染组(6.2
×
108cfu)小鼠ifn-γ (阳性)nk细胞比例和ifn-γ表达水平显著低于给予dmso的低剂量(low dose)感染组(6.2
×
106cfu)小鼠(图6a)，提示轻度感染能够显著刺激nk细胞产生ifn-γ，而重度感染不仅没有进一步增强nk细胞产生ifn-γ的能力，反而减弱了nk细胞产生ifn-γ的能力，诱导了nk细胞低反应性的形成；同样，在大肠杆菌感染组中也得到了类似结果(图6b)。在6.2
×
106cfu金黄色葡萄球菌感染后，tub a干预组的nk细胞在给予il-2和il-12刺激后ifn-γ (阳性)nk细胞百分比和nk细胞ifn-γ表达水平与tub a未干预(给予dmso)组相比没有显著差异，而在6.2
×
108cfu金黄色葡萄球菌感染后，给予tub a干预的重症感染小鼠nk细胞在经il-2和il-12刺激后ifn-γ (阳性)nk细胞百分比和nk细胞ifn-γ
表达水平显著高于未给予tub a(给予了dmso)重症感染小鼠(图6a)；同样，在大肠杆菌感染组中也得到了类似结果(图6b)。以上结果说明，hdac6抑制剂tub a能够用于减弱重症感染引起的nk细胞反应性降低。
48.(七)重症感染小鼠二次感染模型的建立及对分组的临床症状、组织病理学观察
49.c57bl/6小鼠金黄色葡萄球菌感染对照组，每只小鼠腹腔注射6.2
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108cfu的金黄色葡萄球菌菌液，在细菌感染1h后腹腔注射等体积的dmso，之后对感染金黄色葡萄球菌后存活下来的小鼠进行二次感染非致死剂量的大肠杆菌(3.5
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105cfu)，细菌感染后观察记录小鼠临床症状、存活情况以及组织病理变化；c57bl/6小鼠金黄色葡萄球菌感染干预组，每只小鼠腹腔注射6.2
×
108cfu的金黄色葡萄球菌菌液，细菌感染后1h腹腔注射tub a(70mg/kg)，之后对存活下来的小鼠采用上述剂量的大肠杆菌进行二次感染。
50.c57bl/6小鼠大肠杆菌感染对照组，每只小鼠腹腔注射3.5
×
107cfu的大肠杆菌菌液，在细菌感染1h后腹腔注射等体积的dmso，之后对感染大肠杆菌后存活下来的小鼠进行二次感染非致死剂量的金黄色葡萄球菌(6.2
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106cfu)，细菌感染后观察记录小鼠临床症状、存活情况以及组织病理变化；c57bl/6小鼠大肠杆菌感染干预组，每只小鼠腹腔注射3.5
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107cfu的大肠杆菌菌液，细菌感染后1h腹腔注射tub a(70mg/kg)，之后对存活下来的小鼠进行采用上述剂量的金黄色葡萄球菌进行二次感染。
51.结果显示，在第一次(1st)感染后给予tub a的小鼠在第二次(2nd)感染后的存活率显著高于在第一次感染后给予dmso的对照组小鼠(图7a、图7b)；同样，在第一次(1st)感染后给予tub a的小鼠在第二次(2nd)感染后的临床评分亦显著低于在第一次感染后给予dmso的对照组小鼠(图7c、图7d)。以上结果表明，hdac6抑制剂能够显著提高重症感染后存活小鼠抵抗二次感染的能力。
52.结果还显示，在第一次(1st)感染后给予tub a的小鼠在第二次(2nd)感染后，肺脏，肝脏以及肾脏的损伤均显著轻于在第一次感染后给予dmso的对照组小鼠(图8、图9)。上述结果提示，二次感染后小鼠的肺脏、肝脏、肾脏病理损伤进一步加重，而hdac6抑制剂tub a能够减轻二次感染后小鼠肺脏、肝脏、肾脏的病理损伤。
53.总之，本发明通过试验获得的结果表明，运用hdac6抑制剂可以显著恢复重症感染小鼠脾脏nk细胞的数量和反应性，降低重症感染小鼠临床症状评分和肺脏、肝脏、肾脏的组织病理损伤，且可以显著增强重症感染小鼠抗二次感染的能力。