oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
8.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述细胞发挥功能，包括但不限于在所述细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述细胞的生长、在所述细胞中诱导凋亡、抑制所述细胞的存活、抑制所述细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述癌细胞中拮抗nr4a1、在所述癌细胞中靶向nr4a1、在所述癌细胞中拮抗nr4a2、在所述癌细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述细胞在癌细胞中包括nr4a1和nr4a2中的至少一种。在一些实施方案中，所述癌细胞对应于癌症，包括但不限于脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌及其组合。在一些实施方案中，所述疾病包括但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
9.在另外的实施方案中，本公开涉及在肿瘤中诱导抗癌活性的方法。通常，所述方法包括给予对其有需要的受试者双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
10.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述肿瘤细胞发挥功能，包括但不限于在所述细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述肿瘤细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述肿瘤细胞的生长、在所述肿瘤细胞中诱导凋亡、抑制所述肿瘤细胞的存活、抑制所述肿瘤细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述肿瘤包括细胞，包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1
配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述肿瘤细胞中拮抗nr4a1、在所述肿瘤细胞中靶向nr4a1、在所述肿瘤细胞中拮抗nr4a2、在所述肿瘤细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述肿瘤的细胞是癌性的。在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于脑肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤及其组合。
11.在进一步的实施方案中，本公开涉及在多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞中诱导抗癌活性的方法。通常，所述方法包括给予对其有需要的受试者双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
12.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述gbm细胞发挥功能，包括但不限于在所述gbm细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述gbm细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述gbm细胞的生长、在所述gbm细胞中诱导凋亡、抑制所述gbm细胞的存活、抑制所述gbm细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述gbm细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述gbm细胞中拮抗nr4a1、在所述gbm细胞中靶向nr4a1、在所述gbm细胞中拮抗nr4a2、在所述gbm细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述gbm细胞是癌性细胞。在一些实施方案中，所述癌性细胞包括但不限于脑癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞及其组合。
13.在另一个实施方案中，本公开涉及用于通过诱导细胞中的活性来治疗疾病的化合物。通常，所述化合物包括双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，诱导所述细胞中的活性是抗癌活性和抗炎活性中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟
基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
14.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物发挥功能，包括但不限于在细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制细胞的生长、在细胞中诱导凋亡、抑制细胞的存活、抑制细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述细胞在细胞中包括nra1和nr4a2中的至少一种。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞包括但不限于脑癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于拮抗nr4a1、靶向nr4a1、拮抗nr4a2、靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述疾病包括但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
附图说明
15.当结合附图时，通过参考以下具体实施方式，可以获得对本公开的主题的更完整的理解，其中：图1a-1d说明双吲哚类似物和喹啉衍生物对血管活性肠肽(vip)基因表达的作用；图2a-2c说明在成胶质细胞瘤细胞中核受体4a (nr4a) 2的表达和功能；图3a-3c说明nr4a3的表达和功能；图4a-4c说明对反式激活的nr4a2配体依赖性作用；图5a-5d说明nr4a2拮抗剂诱导的应答；图6a-6c说明在成胶质细胞瘤细胞中nr4a2拮抗剂诱导凋亡；图7a-7b说明nr4a2拮抗剂抑制迁移/侵袭和成胶质细胞瘤肿瘤生长；图8说明2,4-二氯苯基类似物与nr4a1和nr4a2的结合；图9说明3-氯-5-甲氧基苯基类似物与nr4a1和nr4a2的结合；图10说明原型nr4a2配体。
具体实施方式
16.应当理解，以下公开提供了用于实施各种实施方案的不同特征的许多不同实施方案或实例。下面描述部件和布置的具体实例以简化本公开。当然，这些仅仅是实例而不旨在限制。本文所用的章节标题是出于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
17.孤儿核受体4a (nr4a1)家族含有三种受体nr4a1 (nur77)、nr4a2 (nurr1)和
nr4a3 (nor1)，它们在配体结合结构域(lbd)和dna bd中表现出显著的结构相似性，而它们的含有激活功能1 (af1)的n-末端(a/b)结构域是高度趋异的。nr4a受体的最初发现与其在各种组织/细胞和器官中由多重刺激导致的快速诱导有关。这些应答在应对外源和内源应激物以及组织特异性表达和诱导nr4a受体(这有助于受体的特异性)中起到重要作用。正在进行的研究已经鉴定了nr4a受体在维持细胞稳态和病理生理学中的多种作用，所述病理生理学包括但不限于癌症。敲除小鼠模型的初步研究显示nr4a1和nr4a3的组合缺失导致小鼠中急性髓样白血病的发生，提示这些受体对白血病的肿瘤抑制物样活性。相反，有大量证据显示nr4a1在大多数实体瘤中高度表达，并且在来自肺癌、结肠癌和乳腺癌患者的肿瘤中nr4a1的过表达是不利预后因素，而对nr4a2和nr4a3在实体瘤中的功能知之甚少。正在进行的对乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌以及横纹肌肉瘤(rms)细胞的研究显示nr4a1通过调节驱动癌细胞生长、存活和迁移/侵袭的基因在这些应答中起重要作用。此外，最近的研究显示转化生长因子β (tgfβ)诱导的乳腺癌和肺癌细胞的侵袭也是nr4a1依赖性的，并且是由于促进smad7的蛋白酶体依赖性降解的受体的核输出。
18.nr4a2在癌症中的作用和合成nr4a2配体的作用没有明确，尽管大多数现有数据表明与nr4a1类似，nr4a2在大多数癌细胞系中也是原致癌的。此外，在许多这些肿瘤中，nr4a2是患者存活的不利预后因素，并且在各种类型的癌症中nr4a2和nr4a1的总体特征是相似的。两种孤儿受体也结合并灭活p53。
19.nr4a2已经在脑的亚细胞区域得到广泛表征，并且nr4a2-/-小鼠不产生中脑多巴胺能神经元，并且在出生后不久死亡。若干实验室已经研究了nr4a2在帕金森病中的作用，并且研究已经证明nr4a2激动剂1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷[dim-c-pphcl (c-dim12)]穿过血脑屏障并在脑中积累，并且体内研究显示dim-c-pphcl抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)诱导的多巴胺能神经元和其它神经变性标记物的损失。
[0020]
在成胶质细胞瘤和其它神经元肿瘤中nr4a受体的表达和这些受体的配体的潜在作用尚未研究，尽管一项研究显示在多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞系中的药物诱导的nr4a1表达。因此，nr4a表达最初在若干已建立的gbm细胞系和五种患者衍生的gbm细胞系中筛选。细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示四种已建立的细胞系表达nr4a1、nr4a2和nr4a3；在患者衍生的细胞中，nr4a1和nr4a3的表达是可变的，而nr4a2在所有五种细胞系中高度表达。因此，成胶质细胞瘤细胞用作用于研究nr4a2在该肿瘤中的作用和nr4a2配体(例如dim-c-pphcl)的作用的理想模型。结果证明，nr4a2在成胶质细胞瘤中是原致癌的，并且nr4a2配体用作拮抗剂，并因此代表一类新的用于治疗这种致命疾病的化疗剂。
[0021]
工作实施例现在将参考本公开的更具体的实施方案和对这样的实施方案提供支持的数据。然而，应当注意，以下公开内容仅用于说明性目的，并且不旨在以任何方式限制所要求保护的主题的范围。
[0022]
细胞系、抗体和试剂。在实验室中合成1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷[dim-c-pphcl (c-dim12)]、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf3-4-cl)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基苯基)甲烷(2-oh-4-br)。由从新诊断的未预先进行化疗或放疗治疗的患者收集的新鲜肿瘤标本产生来自人神经胶质瘤细胞系17008、15037、14104s、14015s和15049的患者衍生的异种移植物(pdx)。已建立的人恶性神经胶质
瘤细胞系u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1购自美国典型培养物保藏中心(manassas, va)。将pdx细胞维持在补充l-谷氨酰胺、10%胎牛血清(fbs)、1
×
mem非必需氨基酸和10 μg/ml庆大霉素(gibco, dublin, ireland)的dulbecco's modified eagle's 培养基 (dmem)/hams f-12 50/50混合物中。将u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1维持在补充10% fbs的dmem1x中。在5% co2存在下，所有细胞维持在37℃下，并且在实验中使用的溶剂(二甲基亚砜；dmso)≤0.2%。dmem、dmem f-12 50/50混合物、fbs、甲醛和胰蛋白酶购自sigma-aldrich (st. louis, mo)。裂解的聚(adp-核糖)聚合酶(cparp，cat# 9541t)、裂解的胱天蛋白酶-8 (cat# 9496t)、裂解的胱天蛋白酶-7 (cat# 9491t)、抗兔alexa fluor 488缀合物(cat# 4412s)和抗小鼠alexa fluor 488缀合物(cat# 4408s)抗体从cell signaling (boston, ma)获得；nr4a1 (cat# ab109180)抗体购自abcam (cambridge, ma)；nr4a2 (cat# sc-991)、ki67 (sc-23900)和nr4a3 (cat# sc-133840)抗体从santa cruz biotechnology (santa cruz, ca)获得，并且β-肌动蛋白(cat# a5316)抗体从sigma-aldrich (st. louis, mo)获得。用于蛋白质印迹成像的化学发光试剂(immobilon western)购自millipore (billerica, ma)。凋亡、坏死和健康细胞定量试剂盒购自biotium (hayward, ca)，侵袭室(cat # 354480)购自corning inc. (corning, ny)，并且xtt细胞活力试剂盒从cell signaling (boston, ma)获得。lipofectamine 2000购自invitrogen (carlsbad, ca)。萤光素酶试剂(cat# e1483)购自promega (madison, wi)。nr4a2特异性的反义寡核苷酸3和4购自aum biotech (philadelphia, pa)。购自sigma-aldrich的在研究中使用的sirna复合物如下：sigl2-5'：cgu acg cgg aau acu ucg a (seq id no:1)、sinr4a1 (sasi_hs02_00333289)、sinr4a2 (sasi_hs02_00341055)和sinr4a3 (sasi_hs01_00091655)。
[0023]
反式激活测定。在补充2.5%活性炭处理的fbs和0.22%碳酸氢钠的dmem/f-12中，将细胞(8
×
104)/孔铺板在12孔板上。生长24小时后，根据制造商的方案，通过lipofectamine 2000试剂(invitrogen, carlsbad, ca)将不同量的dna [即，uas
x5-luc (400 ng)、gal4-nurr1 (40 ng)和β-gal (40 ng)]共转染到每个孔中。转染5-6小时后，用含有溶剂(dmso)或指定浓度的化合物的铺板培养基(如上所述)处理细胞24小时。随后使用冻融方案裂解细胞，并将30 μl细胞提取物用于萤光素酶和β-gal测定。lumicount (packard, meriden, ct)用于定量萤光素酶和β-gal活性。萤光素酶活性值针对相应的β-gal活性值以及通过lowry方法确定的蛋白质浓度来标准化。
[0024]
细胞活力测定。将细胞以10,000/孔的密度用含有2.5%活性炭处理的fbs的dmem和dmem f-12 50/50铺板于96孔板中。用dmso (溶剂对照)和不同浓度的c-dim 12、3-cf
3-4-cl和2-oh-4-br与含有2.5%活性炭处理的fbs的dmem处理细胞0-48小时。处理后，向每个孔中加入25 μl (xtt，具有1%电子偶合溶液)，并如制造商的说明书(cell signaling, boston, ma)中所述孵育4小时。在37℃下在5% co2中孵育4小时后，在96孔板读数器中在450 nm波长下测量吸光度。
[0025]
凋亡的测量(膜联蛋白v染色)。将癌细胞以1.5
×
105/ml的密度接种在6孔板中，并用媒介物(dmso)或化合物处理24小时。随后将细胞染色，并根据制造商的方案(invitrogen, carlsbad ca)使用死亡细胞凋亡试剂盒和alexa fluor 488测定试剂盒通过流式细胞术来分析。
[0026]
划痕和侵袭测定。在6孔板中保持80%汇合，使用无菌移液管尖端产生划痕，并且24小时后确定细胞向划痕处的迁移。bd-matrigel侵袭室(24-transwell，具有8 μm孔径的聚碳酸酯膜)用于改进的boyden室测定。下室中的培养基含有gbm的完全培养基，其用作化学引诱物。将无血清培养基中的pdx细胞(5
×
104个细胞/插入物)铺板于含有或不含各种浓度的化合物的上室中，并在37℃、5% co2下孵育24小时；用湿棉签从膜的上表面去除非侵袭细胞。用10%福尔马林将侵袭细胞固定在下表面10分钟，在苏木精和曙红y溶液(h&e)中染色。洗涤和干燥后，计数五个相邻视野中的细胞数。
[0027]
小干扰rna干扰测定。将细胞(2
×
105个细胞/孔)在完全培养基中铺板于6孔板中。24小时后，按照生产商的方案，使用lipofectamine rnaimax试剂(invitrogen, carlsbad, ca)，用100 nm每种sirna双链体转染细胞6小时。靶向nr4a2的反义寡核苷酸直接用于6孔板中，并使最终浓度为10 μm。对于sirna介导的转染，将培养基更换为含有10% fbs的新鲜培养基，而对于反义寡核苷酸不更换培养基。两种转染条件都孵育42小时。孵育后，用媒介物(dmso)或不同浓度的化合物处理细胞，并收集细胞用于进一步实验。
[0028]
免疫荧光。将15037、14015s和u87-mg细胞(1.0
×
105/ml)铺板于完全培养基中，并用dmso或c-dim 12处理24小时或用sict或sinr4a2处理48小时。随后用37%福尔马林固定细胞，封闭，用荧光ki67第一抗体处理24小时。随后用pbs洗涤细胞，并用抗小鼠igg fab2 alexa fluor 488第二抗体在室温下处理2小时。最后，用zeiss共焦荧光显微镜观察细胞。
[0029]
蛋白质印迹分析。将17008、15037、14104s、14015s、15049、u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1细胞以1.5
×
105/ml的密度接种在6孔板中，并用各种浓度的化合物处理，并用ripa裂解缓冲液提取全细胞蛋白质，所述ripa裂解缓冲液含有10 mm tris-hcl (ph 7.4)、150 mm nacl、1 mm乙二胺四乙酸(edta)、1% triton x-100 (w/v)、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠(sds)，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。使用lowry方法测量蛋白质浓度，并在10%和15% sds-page中分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜。将pvdf膜在4℃下用第一抗体在5%脱脂乳中孵育过夜，并用缀合有辣根过氧化物酶(hrp)的第二抗体孵育2-3小时。随后将膜暴露于hrp-底物，并用化学发光试剂检测免疫反应的蛋白质。
[0030]
三维(3d)肿瘤球体侵袭测定。将细胞悬浮在完全培养基中(2
×
104个细胞/ml)。通过将200 μl细胞悬浮液接种到96孔圆底超低附着培养板(costa，#7007)的孔中来产生球体。在37℃下在5% co2培养箱中孵育24小时后，从球体板中去除100 μl/孔的生长培养基，并在每个孔的底部加入100 μl/孔的matrigel (corning，#356234)。将板转移到培养箱中1小时，并补充100 μl含有3倍于期望的最终浓度的化合物的完全培养基，并随后孵育3-5天，随后在4%甲醛中固定。通过用imagej测量被侵袭细胞的球体中心和边缘的横截面积来确定球体侵袭。
[0031]
异种移植物研究。雌性无胸腺nu/nu小鼠(4-6周龄)购自harlan laboratories (houston, tx)。在100 μl的dmem中收获u87-mg细胞(1
×
106)，并悬浮在冰冷的matrigel (1:1比率)中，并皮下注射至小鼠的胁腹区域的任一侧。在肿瘤细胞接种一周后，将小鼠分成两组，每组5只动物。第一组接受100 μl媒介物(玉米油)，而第二组动物接受30 mg/kg/天在100 μl体积玉米油中的c-dim 12的腹膜内注射三周。在治疗过程中每周对所有小鼠称重一次以监测体重的变化。在治疗期间不能确定肿瘤体积，因为异种移植的肿瘤相对深。治疗
三周后，处死小鼠并确定肿瘤重量。
[0032]
统计分析。使用单向anova和dunnett检验来确定两组之间的统计学显著性。为了证实数据的再现性，实验至少独立地进行三次，并且结果表示为平均值
±
标准偏差(sd)。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。
[0033]
结构活性研究。在结构活性研究中，两种喹啉衍生物(氯喹(cq)和阿莫地喹(aq))用作“对照
”ꢀ
nr4a2配体，其以前已经在帕金森病模型中进行研究。研究了双吲哚和喹啉衍生物对nr4a2调节的基因血管活性肠肽(vip)的激活的作用。用双吲哚类似物(5 μm、10 μm和15 μm)、cq (100 μm、150 μm和200 μm)或aq (50 μm、75 μm和100 μm)处理panc1 (图1a和图1b)和panc28 (图1c和图1d)细胞。通过定量pcr分析确定vip的相对表达水平。对于每种处理，结果表示为至少六个单独测定的平均值
±
sd。星号(*)指示最高浓度处理相对溶剂对照(dmso)的显著基因诱导(p《0.01)。图1a显示双吲哚化合物显著诱导panc1细胞中的vip，使用2-oh-4-br观察到高达330倍的诱导(图1a)。尽管cq和aq在panc1细胞中诱导vip (2.3-4.1倍)，但应答的幅度显著低于nr4a2活性双吲哚化合物(图1b)。双吲哚和喹啉之间在panc28细胞中诱导vip的差异(分别为图1c和图1d)与在panc1细胞中观察到的相似。活性最低的双吲哚化合物n-me-4-oh在panc1和panc28细胞中是比cq或aq更有效的vip的诱导剂。因此，已经鉴定了比dim-c-pphcl (4-cl)和dim-c-pphbr (4-br)更有效的新nr4a2配体。
[0034]
通过直接配体结合淬灭nr4a1色氨酸荧光。如本文所述获得色氨酸荧光光谱。简言之，将nr4a1的带组氨酸标签的配体结合结构域(lbd)以0.5 μmol/l的最终浓度在1.0 ml磷酸盐缓冲的盐水(pbs，ph 7.4)中用于荧光测量。在温度受控的(quantum northwest tc125)荧光分光光度计(varian cary eclipse)中，在25℃下将蛋白质孵育3分钟。使用285 nm的激发波长(激发狭缝宽度=5 nm)和300-420 nm范围的发射波长(发射狭缝宽度=5 nm)获得荧光光谱。随后将配体的等分试样(0.1 μl/等分试样) (10 mmol配体/l乙醇)加入到含有nr4a1的比色皿中，使配体的最终浓度为30 μmol配体/l。在各等分试样的配体后，将nr4a1/配体溶液在25℃下孵育3分钟，并如上所述测量nr4a1色氨酸荧光。仅加入乙醇(直至最终体积为3.0 μl)对nr4a1色氨酸荧光没有作用(数据未显示)。根据上面列出的参考文献，通过测量nr4a1色氨酸在330 nm发射波长下的荧光强度，确定与nr4a1的配体结合亲和力(kd)。如以上参考文献所述，在各配体浓度下仅配体的荧光强度用于校正nr4a1色氨酸荧光强度。
[0035]
与nr4a1 lbd的配体结合：bisans置换测定。bisans (molecular probes, inc/thermofisher)在水性溶液中基本上是无荧光的；然而，当结合到蛋白质(例如nr4a1)时，bisans荧光显著增加。nr4a1/bisans的结合亲和力(kd)和结合化学计量(bmax)基本上如在febs journal, 2014, 281, 2266-2283中所述确定。对于nr4a1/bisans，确定结合亲和力(kd)为0.84 μmol/l，并且确定结合化学计量(bmax)为0.80 mol bisans/mol nr4a1。基本上如在febs journal, 2014, 281, 2266-2283中所述分析配体置换bisans的能力。简言之，在5.0
ꢀµ
mol bisans/l存在下，将带组氨酸标签的nr4a1 lbd (最终浓度=0.05 μmol/l pbs，ph 7.4)在25℃下孵育3分钟。利用varian cary eclipse荧光分光光度计，用365 nm的激发波长(激发狭缝宽度=5 nm)和400-600 nm范围的发射波长(发射狭缝宽度=5 nm)获得bisans 荧光光谱。如上所述使用10 mmol配体/l乙醇的储备配体浓度，完成配体滴定用于
直接配体结合。仅加入乙醇对nr4a1/bisans荧光没有作用(数据未显示)。根据上述参考文献，通过在500 nm发射波长下测量nr4a1/bisans荧光强度，确定nr4a1的配体结合亲和力(ki)。如以上参考文献中所述，使用各配体浓度下的配体/bisans荧光强度来校正nr4a1/bisans/配体荧光强度。
[0036]
通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析确定成胶质细胞瘤细胞系(a172、u87-mg、u98g和ccf-sttg1)和患者衍生的细胞(1708、15037、14004s、14015s和15049)中nr4a受体的表达。nr4a2在所有细胞系中表达，而nr4a3在大多数细胞系中表达，而在已建立的细胞系中检测到nr4a1，但仅在两种患者衍生的细胞系中检测到nr4a1。因此，在缺乏nr4a1时患者衍生的细胞系的nr4a2表达有些独特。在本公开中，研究了nr4a2在u87-mg、15037和14015s细胞中的作用，以确定使用反义寡核苷酸(#3和#4)的nr4a2敲低对细胞增殖、存活和侵袭的作用。nr4a2敲低如下进行：用靶向nr4a2的寡核苷酸(sinr4a2
‑ꢀ
#3和#4)或非特异性对照(nc)转染成胶质细胞瘤细胞，并通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物，并如本文所述确定对细胞增殖(图2a)、细胞侵袭(图2b)和膜联蛋白v染色(图2c)的作用。用非特异性对照(nc)或靶向nr4a2的寡核苷酸(#3和#4)转染细胞，并通过全细胞裂解物的蛋白质印迹确定凋亡标记物。结果(图2a-2c)是每个处理组至少三次测定的平均值
±
sd，并且显著(p《0.05)作用[与对照(nc)相比]被指示(*)。在15037细胞中未观察到胱天蛋白酶8裂解。反义寡核苷酸有效降低nr4a2在15037、14015s和u87-mg细胞中的表达，并且这伴随着细胞增殖降低(图2a)和使用boyden室测定的细胞侵袭降低(图2b)。此外，nr4a2表达降低诱导凋亡标记物，包括诱导膜联蛋白v染色(图2c)和胱天蛋白酶8、7和parp在15037、14015s和u87-mg细胞中的裂解(注意：在15037细胞中未检测到裂解的胱天蛋白酶8)。
[0037]
由于15037、14015s和u87-mg细胞表达nr4a3，还研究了通过rna干扰(rnai)的nr4a3敲低对细胞系表型特征的作用。用nc或靶向nr4a3的寡核苷酸转染细胞，并且如本文所述确定对nr4a3表达(通过全细胞裂解物的蛋白质印迹确定)、细胞增殖(图3a)、细胞侵袭(图3b)和膜联蛋白v染色(图3c)的作用。用sinr4a2或sinr4a3转染细胞，并如本文所述确定ki67染色。结果(图3a-3c)表示为平均值
±
sd，每个处理组至少三次测定，并且与对照/未处理组的显著(p《0.05)差异被指示(*)。nr4a3的缺失对细胞增殖(图3a)、侵袭(图3b)或凋亡(图3c)具有最小的作用，并且ki67增殖标记物的染色证明nr4a3的缺失对ki67染色具有最小的作用。这些结果首次清楚地证明nr4a2是成胶质细胞瘤细胞中的原致癌因子，而nr4a3对其生长、存活和侵袭的作用最小。
[0038]
先前的研究已经鉴定了一系列诱导nr4a2依赖性反式激活的双吲哚衍生的化合物(c-dim)，并且1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl，4-cl)已经用作原型nr4a2配体(化合物1)。以下说明和在图10中描述的化合物1显示原型nr4a2配体。用nr4a2配体处理细胞。用uas-luc/gal4-nr4a2 (图4a)、nbre-luc/nr4a2表达质粒(40 ng) (图4b)和nurre-luc/nr4a2表达质粒(40 ng) (图4c)转染细胞，用双吲哚衍生的配体处理，并如本文所述确定萤光素酶活性。结果是每个处理组三次重复测定的平均值
±
sd，并且显著(p《0.05)作用(与dmso对照相比)被指示(*)。
[0039]
化合物1
在胰腺癌细胞中正在进行的筛选鉴定了3个另外的nr4a2配体，包括1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)。这些化合物在panc1细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活；然而，在用gal4-nr4a2嵌合体和含有gal4应答元件的报告质粒(uas
5-luc)转染的14015s和15037成胶质细胞瘤细胞中，所有这些化合物都降低反式激活(萤光素酶活性) (图4a)。还使用报道的基因构建体研究了nr4a2调节的基因表达的配体依赖性调节，所述基因构建体含有ngf1-b应答元件-萤光素酶构建体(nbre
3-luc) (图4b)和nur应答元件(nure
3-luc) (图4c)，它们分别作为单体和二聚体结合nr4a2。在这些测定中，所述三种配体还降低nr4a2依赖性反式激活，表明它们在成胶质细胞瘤细胞中充当nr4a2反向激动剂/拮抗剂。
[0040]
用dim-c-pphcl (图5a)、3-cf
3-4-cl (图5b)和2-oh-4-br (图5c)处理15037、14015s和u87-mg细胞抑制细胞增殖。用不同浓度的dim-c-pphcl (4-cl) (图5a)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl) (图5b)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基苯基)甲烷(2-oh-4-br) (图5c)处理细胞，并如本文所述确定对成胶质细胞瘤细胞增殖的作用。用4-cl (30 mg/kg/天)处理携带u87-mg细胞作为异种移植物的无胸腺裸小鼠，并通过肿瘤裂解物的蛋白质印迹分析确定对照(玉米油)和4-cl处理的小鼠对肿瘤重量和肿瘤中凋亡标记物表达的作用。确定对照相对4-cl-处理的小鼠中各种蛋白质的表达水平(相对于β-肌动蛋白归一化)。用不同的nr4a2拮抗剂处理成胶质细胞瘤细胞，并如本文所述确定ki-67染色。结果(图5a-5c)表示为每个处理组至少三次重复的平均值
±
sd，并且与未处理的对照的显著(p《0.05)差异被指示(*)。
[0041]
观察到在携带u87-mg肿瘤细胞作为异种移植物的无胸腺裸小鼠中4-cl (30 mg/kg/天)显著降低肿瘤重量(图5d)，并且与媒介物对照相比，在来自4-cl处理的小鼠的肿瘤中，这伴随裂解的胱天蛋白酶8而不是裂解的胱天蛋白酶7以及cparp的显著上调。用4-cl处理24小时降低15037、14015s和u87-mg细胞中的ki67 (增殖标记物)。因此，nr4a2配体和nr4a2敲低(图2a-2c)是生长抑制性的，指示c-dim是nr4a2拮抗剂，并且这与它们在反式激活测定中的拮抗剂活性一致(图4a-4c)。用4-cl (图6a)、3-cf
3-4-cl (图6b)和2-oh-4-br (图6c)处理成胶质细胞瘤细胞诱导膜联蛋白v染色和裂解的胱天蛋白酶7、8和parp裂解。用不同浓度的4-cl (图6a)、3-cf
3-4-cl (图6b)和2-oh-4-br (图6c)处理成胶质细胞瘤细胞，并如本文所述确定对诱导膜联蛋白v的作用。用不同浓度的nr4a2拮抗剂处理成胶质细胞瘤细胞，并通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物的凋亡标记物。结果(图6a-6c)表示为每个处理组至少三次测定的平均值
±
sd，并且与未处理的对照相比显著的(p《0.05)应答被指示(*)。这些结果与敲低nr4a2后观察到的结果(图2c)相当。
[0042]
各种配体在生长抑制和凋亡诱导方面的效力是配体、细胞类型和应答依赖性的，其中在15037 (高)细胞中膜联蛋白v诱导倍数相对14015s (低)细胞中膜联蛋白v诱导倍数
最明显不同，并且这部分是由于未处理的14015s细胞中膜联蛋白v的相对较高的表达。
[0043]
用12.5 μm (3-cf
3-4-cl和2-oh-4-br)或20 μm (c-dim 12) 处理细胞，并且如本文所述，分别在boyden室和划痕测定中确定成胶质细胞瘤细胞侵袭或迁移的作用。也如本文所述在15037细胞中在肿瘤球体侵袭测定中确定nr4a2配体对细胞迁移的抑制(注意：14015s和u87-mg细胞在该测定中未表现出侵袭)。在boyden室测定中nr4a1拮抗剂也抑制15037和14015s细胞的侵袭，其中后一种细胞系似乎更灵敏，并且与3-cf
3-4-cl或2-oh-4-br (图7a)相比，4-cl介导的细胞侵袭抑制需要更高的浓度。在15037和14015s细胞的划痕测定中观察到类似的结果，其中20 μm dim-c-pphcl表现出最小的迁移抑制，并且较低浓度(12.5 μm)的2-oh-4-br和3-cf
3-4-cl抑制迁移，其中后一种化合物是最有效的抑制剂。还观察到，与dmso (溶剂对照)或用对照寡核苷酸(sict)转染的细胞相比，使用15037细胞，敲低nr4a2或用10 μm 4-cl处理抑制肿瘤球体侵袭(图7b)。这些结果证明nr4a2在成胶质细胞瘤中是生长促进、存活和促侵袭基因，并且c-dim/nr4a2配体充当nr4a2拮抗剂，并代表治疗该疾病的新的化学治疗方法。
[0044]
估计23,880例脑和神经系统癌症的新病例将被诊断，并且16,380例死亡将因这些疾病而发生。gbm是最频繁被诊断的恶性脑肿瘤，并且该疾病的全球发病率在0.59-3.69/100,000变化。在成人中诊断gbm是致命性的，因为患者存活时间在12-15个月的范围内，并且患者在诊断后的3年存活在3-5%范围内。原发性新生gbm占所有病例的约90%，并且发生于老年患者，而继发性gbm主要在年轻患者中诊断。gbm是复杂的疾病，其涉及包括若干基因突变的多种遗传改变，导致难以治疗的高度侵袭性疾病。目前对新诊断的成胶质细胞瘤患者的护理标准包括手术、辅助放射疗法和药物替莫唑胺(tmz；烷基化剂)，并且这些治疗方案的成功有限。高级神经胶质瘤细胞最麻烦的生物学特征是它们侵袭正常周围脑组织的倾向和能力，从而避开外科医生的刀以及递送到手术切除边缘的辐射。这种浸润肿瘤细胞的库形成神经胶质瘤干细胞亚群，其成为肿瘤复发/进展的主要来源，并且它们通常对化学辐射有抗性，并且经常是最终患者死亡的原因。孤儿核受体nr4a2在神经元功能中起重要作用，并且以前的研究显示在小鼠帕金森病模型中4-cl和一些相关的c-dim化合物穿过血脑屏障，并抑制nr4a2依赖性炎症应答。在已建立的和患者衍生的成胶质细胞瘤细胞系中的初步研究结果证明nr4a1、nr4a2和nr4a3在这些细胞中的表达以及患者衍生的细胞主要表达nr4a2/nr4a3，具有相对低水平的nr4a1。这些孤儿受体在患者衍生的细胞中的差异表达为研究nr4a2的功能和靶向该受体作为治疗gbm患者的新方法的潜力提供机会。
[0045]
基因敲低方法最初用于确定nr4a2在患者衍生的14015s、15037和u87-mg成胶质细胞瘤细胞中的功能。结果指示nr4a2的缺失导致抑制生长、诱导凋亡和抑制侵袭。nr4a2敲低的作用与nr4a3敲低后获得的结果相反，nr4a3对细胞生长、存活和迁移的作用最小。因此，nr4a2在gbm中明显表现出原致癌活性，并且这些结果与以前关于nr4a2在其它癌细胞系中的功能和nr4a2的原致癌活性的报道一致。
[0046]
以前的研究已经表征了4-cl作为nr4a2配体，其在帕金森病模型中作为治疗一些nr4a2-调节的途径的抗炎药物是有效的。在胰腺癌细胞的反式激活研究中，4-cl激活nr4a2依赖性反式激活，而4-cl和两种另外的c-dim类似物抑制gbm细胞中nr4a2依赖性反式激活(图4a-4c)。因此，就nr4a2依赖性反式激活而言，4-cl和相关的化合物是表现出细胞类型特异性激动剂和拮抗剂活性的选择性受体调节剂，并且这在以前已经在结合nr4a1的c-dim中
观察到。
[0047]
4-cl和相关的化合物不仅抑制nr4a2依赖性反式激活，而且抑制nr4a2依赖性细胞生长、存活和迁移。此外，在异种移植模型中使用u87-mg细胞在无胸腺裸小鼠中观察到类似的应答，其中4-cl抑制肿瘤生长并诱导肿瘤凋亡。
[0048]
这些结果证实nr4a2的原致癌活性，并显示用作拮抗剂的nr4a2配体(例如c-dim)代表治疗gbm的新方法。容易设想集中于研究和鉴定gbm中nr4a2调节的基因/途径的研究，以及开发更有效的nr4a2拮抗剂用于未来临床应用。另外，并且如前详述的，c-dim12 (4-氯类似物)通过与共激活剂结合位点而不是nr4a2的配体结合结构域相互作用来靶向nr4a2。因此，开发了nr4a1和nr4a2的配体结合测定，其测量配体色氨酸荧光的配体诱导的猝灭，以进一步表征关于nr4a1和nr4a2的活性。色氨酸残基位于两种受体的配体结合结构域(lbd)中，并且受体的lbd用于结合测定。下表1总结了c-dim12和其它nr4a2-活性化合物的结合kd值，并且它们不淬灭lbd-trp，并且这证实以前的模型化研究，其显示c-dim12在nr4a2的lbd之外结合nr4a2。c-dim12的3-cl和2-cl-苯基异构体得到类似的结果(表1)。然而，将第二个氯取代基引入苯环导致若干二氯取代的类似物结合(色氨酸猝灭)到nr4a2和nr4a1两者(图8)。这些出乎意料的结果表明，在苯环上含有两个或更多个取代基的cdim结合nr4a2和nr4a1两者的可能性。使用两个系列的化合物测试该假设；原型nr4a1配体的3,5-二取代的类似物c-dim8 [1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷] (表2，如下所示)；和一组新的3,5-二取代的苯基cdim类似物(表3，如下所示) (图9)。结果显示所有这些具有两个或更多个苯基取代基的化合物均结合nr4a2和nr4a1。
[0049]
表1：4-取代的(苯环)和二氯取代的cdim与nr4a1和nr4a2的结合表2：cdim8的3,5-二取代的类似物(1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷)与nr4a1和nr4a2的结合
表3：cdim的3,5-二取代的类似物与nr4a1和nr4a2的结合这些数据强调了在苯环上具有两个或更多个取代基的cdim作为nr4a2和nr4a1配体的有希望结果。因此，由于双吲哚衍生的化合物能够结合到nr4a1和nr4a2，双吲哚衍生的化合物(例如在苯环上具有两个或更多个取代基的双吲哚衍生的化合物)可以用于在细胞中诱导抗癌或抗炎活性，以及治疗其它疾病，例如但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
[0050]
尽管已经在附图中说明并在前述具体实施方式中描述了本公开的各种实施方案，将理解，本公开不限于本文公开的实施方案，而是能够在不背离本文阐述的本公开的精神的情况下进行许多重排、修改和替换。
[0051]
术语“基本上”定义为大部分但不必全部是指定内容，如本领域普通技术人员所理解的。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”、“大约”、“通常”和“约”可以用“在所规定的[百分比]内”来代替，其中百分比包括0.1%、1%、5%和10%。
[0052]
以上概述了若干实施方案的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开的各方面。本领域技术人员应当理解，他们可以容易地使用本公开作为基础来设计或修改用于进行本文介绍的实施方案的相同目的和/或实现本文介绍的实施方案的相同优点的其它过程和结构。本领域技术人员还应当认识到，这样的等同构建并不脱离本公开的精神和范
围，并且他们可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行各种改变、替换和变更。本发明的范围应当仅由所附权利要求的语言来确定。权利要求中的术语“包含”旨在是指“至少包括”，使得权利要求中引用的要素列举是开放的组。术语“一”、“一个”和其它单数术语旨在包括其复数形式，除非明确排除。
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
8.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述细胞发挥功能，包括但不限于在所述细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述细胞的生长、在所述细胞中诱导凋亡、抑制所述细胞的存活、抑制所述细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述癌细胞中拮抗nr4a1、在所述癌细胞中靶向nr4a1、在所述癌细胞中拮抗nr4a2、在所述癌细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述细胞在癌细胞中包括nr4a1和nr4a2中的至少一种。在一些实施方案中，所述癌细胞对应于癌症，包括但不限于脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌及其组合。在一些实施方案中，所述疾病包括但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
9.在另外的实施方案中，本公开涉及在肿瘤中诱导抗癌活性的方法。通常，所述方法包括给予对其有需要的受试者双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
10.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述肿瘤细胞发挥功能，包括但不限于在所述细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述肿瘤细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述肿瘤细胞的生长、在所述肿瘤细胞中诱导凋亡、抑制所述肿瘤细胞的存活、抑制所述肿瘤细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述肿瘤包括细胞，包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1
配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述肿瘤细胞中拮抗nr4a1、在所述肿瘤细胞中靶向nr4a1、在所述肿瘤细胞中拮抗nr4a2、在所述肿瘤细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述肿瘤的细胞是癌性的。在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于脑肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤及其组合。
11.在进一步的实施方案中，本公开涉及在多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞中诱导抗癌活性的方法。通常，所述方法包括给予对其有需要的受试者双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括通过所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
12.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物对所述gbm细胞发挥功能，包括但不限于在所述gbm细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在所述gbm细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制所述gbm细胞的生长、在所述gbm细胞中诱导凋亡、抑制所述gbm细胞的存活、抑制所述gbm细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述gbm细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于在所述gbm细胞中拮抗nr4a1、在所述gbm细胞中靶向nr4a1、在所述gbm细胞中拮抗nr4a2、在所述gbm细胞中靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述gbm细胞是癌性细胞。在一些实施方案中，所述癌性细胞包括但不限于脑癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞及其组合。
13.在另一个实施方案中，本公开涉及用于通过诱导细胞中的活性来治疗疾病的化合物。通常，所述化合物包括双吲哚衍生的化合物。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物结合到核受体4a1 (nr4a1)和核受体4a2 (nr4a2)中的至少一种。在一些实施方案中，诱导所述细胞中的活性是抗癌活性和抗炎活性中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物(cdim)在其苯环上包含两个或更多个取代基。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物包括但不限于1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl；4-cl)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟
基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)、1-双(3'-吲哚基)-1-(对溴苯基)甲烷(dim-c-pphbr)、1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(cdim8)、cdim8的3,5-二取代的类似物cdim8-3,5-(ch3)2、cdim8-3,5-br2、cdim8-3,5-cl2、cdim8-3-br-5-och3、cdim8-3-cl-5-och3、cdim8-3-cl-5-br、cdim8-3-cl-5-f、cdim、cdim的3,5-二取代的类似物cdim-3,5-br2、cdim-2,5-br2、cdim-3,5-cl2、cdim-3,5-(ch3)2、cdim-3-br-5-ocf3、cdim-3-br-5-och3、cdim-3-cl-5-och3、cdim-3-cl-5-ocf3、cdim-3-cl-5-cf3及其组合。
14.在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物发挥功能，包括但不限于在细胞中诱导nr4a1依赖性反式激活、在细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活、抑制细胞的生长、在细胞中诱导凋亡、抑制细胞的存活、抑制细胞的迁移及其组合。在一些实施方案中，所述细胞包括但不限于a172、u87-mg、u98g、ccf-sttg1、1708、15037、14004s、14015s、15049、多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞及其组合。在一些实施方案中，所述细胞在细胞中包括nra1和nr4a2中的至少一种。在一些实施方案中，所述细胞是癌细胞。在一些实施方案中，所述癌细胞包括但不限于脑癌细胞、乳腺癌细胞、肾癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞及其组合。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的化合物是双吲哚衍生的nr4a1配体和双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种。在一些实施方案中，所述双吲哚衍生的nr4a1配体和所述双吲哚衍生的nr4a2配体中的至少一种发挥功能，包括但不限于拮抗nr4a1、靶向nr4a1、拮抗nr4a2、靶向nr4a2及其组合。在一些实施方案中，所述疾病包括但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
附图说明
15.当结合附图时，通过参考以下具体实施方式，可以获得对本公开的主题的更完整的理解，其中：图1a-1d说明双吲哚类似物和喹啉衍生物对血管活性肠肽(vip)基因表达的作用；图2a-2c说明在成胶质细胞瘤细胞中核受体4a (nr4a) 2的表达和功能；图3a-3c说明nr4a3的表达和功能；图4a-4c说明对反式激活的nr4a2配体依赖性作用；图5a-5d说明nr4a2拮抗剂诱导的应答；图6a-6c说明在成胶质细胞瘤细胞中nr4a2拮抗剂诱导凋亡；图7a-7b说明nr4a2拮抗剂抑制迁移/侵袭和成胶质细胞瘤肿瘤生长；图8说明2,4-二氯苯基类似物与nr4a1和nr4a2的结合；图9说明3-氯-5-甲氧基苯基类似物与nr4a1和nr4a2的结合；图10说明原型nr4a2配体。
具体实施方式
16.应当理解，以下公开提供了用于实施各种实施方案的不同特征的许多不同实施方案或实例。下面描述部件和布置的具体实例以简化本公开。当然，这些仅仅是实例而不旨在限制。本文所用的章节标题是出于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
17.孤儿核受体4a (nr4a1)家族含有三种受体nr4a1 (nur77)、nr4a2 (nurr1)和
nr4a3 (nor1)，它们在配体结合结构域(lbd)和dna bd中表现出显著的结构相似性，而它们的含有激活功能1 (af1)的n-末端(a/b)结构域是高度趋异的。nr4a受体的最初发现与其在各种组织/细胞和器官中由多重刺激导致的快速诱导有关。这些应答在应对外源和内源应激物以及组织特异性表达和诱导nr4a受体(这有助于受体的特异性)中起到重要作用。正在进行的研究已经鉴定了nr4a受体在维持细胞稳态和病理生理学中的多种作用，所述病理生理学包括但不限于癌症。敲除小鼠模型的初步研究显示nr4a1和nr4a3的组合缺失导致小鼠中急性髓样白血病的发生，提示这些受体对白血病的肿瘤抑制物样活性。相反，有大量证据显示nr4a1在大多数实体瘤中高度表达，并且在来自肺癌、结肠癌和乳腺癌患者的肿瘤中nr4a1的过表达是不利预后因素，而对nr4a2和nr4a3在实体瘤中的功能知之甚少。正在进行的对乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌和肺癌以及横纹肌肉瘤(rms)细胞的研究显示nr4a1通过调节驱动癌细胞生长、存活和迁移/侵袭的基因在这些应答中起重要作用。此外，最近的研究显示转化生长因子β (tgfβ)诱导的乳腺癌和肺癌细胞的侵袭也是nr4a1依赖性的，并且是由于促进smad7的蛋白酶体依赖性降解的受体的核输出。
18.nr4a2在癌症中的作用和合成nr4a2配体的作用没有明确，尽管大多数现有数据表明与nr4a1类似，nr4a2在大多数癌细胞系中也是原致癌的。此外，在许多这些肿瘤中，nr4a2是患者存活的不利预后因素，并且在各种类型的癌症中nr4a2和nr4a1的总体特征是相似的。两种孤儿受体也结合并灭活p53。
19.nr4a2已经在脑的亚细胞区域得到广泛表征，并且nr4a2-/-小鼠不产生中脑多巴胺能神经元，并且在出生后不久死亡。若干实验室已经研究了nr4a2在帕金森病中的作用，并且研究已经证明nr4a2激动剂1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷[dim-c-pphcl (c-dim12)]穿过血脑屏障并在脑中积累，并且体内研究显示dim-c-pphcl抑制1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(mptp)诱导的多巴胺能神经元和其它神经变性标记物的损失。
[0020]
在成胶质细胞瘤和其它神经元肿瘤中nr4a受体的表达和这些受体的配体的潜在作用尚未研究，尽管一项研究显示在多形性成胶质细胞瘤(gbm)细胞系中的药物诱导的nr4a1表达。因此，nr4a表达最初在若干已建立的gbm细胞系和五种患者衍生的gbm细胞系中筛选。细胞裂解物的蛋白质印迹分析显示四种已建立的细胞系表达nr4a1、nr4a2和nr4a3；在患者衍生的细胞中，nr4a1和nr4a3的表达是可变的，而nr4a2在所有五种细胞系中高度表达。因此，成胶质细胞瘤细胞用作用于研究nr4a2在该肿瘤中的作用和nr4a2配体(例如dim-c-pphcl)的作用的理想模型。结果证明，nr4a2在成胶质细胞瘤中是原致癌的，并且nr4a2配体用作拮抗剂，并因此代表一类新的用于治疗这种致命疾病的化疗剂。
[0021]
工作实施例现在将参考本公开的更具体的实施方案和对这样的实施方案提供支持的数据。然而，应当注意，以下公开内容仅用于说明性目的，并且不旨在以任何方式限制所要求保护的主题的范围。
[0022]
细胞系、抗体和试剂。在实验室中合成1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷[dim-c-pphcl (c-dim12)]、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf3-4-cl)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基苯基)甲烷(2-oh-4-br)。由从新诊断的未预先进行化疗或放疗治疗的患者收集的新鲜肿瘤标本产生来自人神经胶质瘤细胞系17008、15037、14104s、14015s和15049的患者衍生的异种移植物(pdx)。已建立的人恶性神经胶质
瘤细胞系u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1购自美国典型培养物保藏中心(manassas, va)。将pdx细胞维持在补充l-谷氨酰胺、10%胎牛血清(fbs)、1
×
mem非必需氨基酸和10 μg/ml庆大霉素(gibco, dublin, ireland)的dulbecco's modified eagle's 培养基 (dmem)/hams f-12 50/50混合物中。将u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1维持在补充10% fbs的dmem1x中。在5% co2存在下，所有细胞维持在37℃下，并且在实验中使用的溶剂(二甲基亚砜；dmso)≤0.2%。dmem、dmem f-12 50/50混合物、fbs、甲醛和胰蛋白酶购自sigma-aldrich (st. louis, mo)。裂解的聚(adp-核糖)聚合酶(cparp，cat# 9541t)、裂解的胱天蛋白酶-8 (cat# 9496t)、裂解的胱天蛋白酶-7 (cat# 9491t)、抗兔alexa fluor 488缀合物(cat# 4412s)和抗小鼠alexa fluor 488缀合物(cat# 4408s)抗体从cell signaling (boston, ma)获得；nr4a1 (cat# ab109180)抗体购自abcam (cambridge, ma)；nr4a2 (cat# sc-991)、ki67 (sc-23900)和nr4a3 (cat# sc-133840)抗体从santa cruz biotechnology (santa cruz, ca)获得，并且β-肌动蛋白(cat# a5316)抗体从sigma-aldrich (st. louis, mo)获得。用于蛋白质印迹成像的化学发光试剂(immobilon western)购自millipore (billerica, ma)。凋亡、坏死和健康细胞定量试剂盒购自biotium (hayward, ca)，侵袭室(cat # 354480)购自corning inc. (corning, ny)，并且xtt细胞活力试剂盒从cell signaling (boston, ma)获得。lipofectamine 2000购自invitrogen (carlsbad, ca)。萤光素酶试剂(cat# e1483)购自promega (madison, wi)。nr4a2特异性的反义寡核苷酸3和4购自aum biotech (philadelphia, pa)。购自sigma-aldrich的在研究中使用的sirna复合物如下：sigl2-5'：cgu acg cgg aau acu ucg a (seq id no:1)、sinr4a1 (sasi_hs02_00333289)、sinr4a2 (sasi_hs02_00341055)和sinr4a3 (sasi_hs01_00091655)。
[0023]
反式激活测定。在补充2.5%活性炭处理的fbs和0.22%碳酸氢钠的dmem/f-12中，将细胞(8
×
104)/孔铺板在12孔板上。生长24小时后，根据制造商的方案，通过lipofectamine 2000试剂(invitrogen, carlsbad, ca)将不同量的dna [即，uas
x5-luc (400 ng)、gal4-nurr1 (40 ng)和β-gal (40 ng)]共转染到每个孔中。转染5-6小时后，用含有溶剂(dmso)或指定浓度的化合物的铺板培养基(如上所述)处理细胞24小时。随后使用冻融方案裂解细胞，并将30 μl细胞提取物用于萤光素酶和β-gal测定。lumicount (packard, meriden, ct)用于定量萤光素酶和β-gal活性。萤光素酶活性值针对相应的β-gal活性值以及通过lowry方法确定的蛋白质浓度来标准化。
[0024]
细胞活力测定。将细胞以10,000/孔的密度用含有2.5%活性炭处理的fbs的dmem和dmem f-12 50/50铺板于96孔板中。用dmso (溶剂对照)和不同浓度的c-dim 12、3-cf
3-4-cl和2-oh-4-br与含有2.5%活性炭处理的fbs的dmem处理细胞0-48小时。处理后，向每个孔中加入25 μl (xtt，具有1%电子偶合溶液)，并如制造商的说明书(cell signaling, boston, ma)中所述孵育4小时。在37℃下在5% co2中孵育4小时后，在96孔板读数器中在450 nm波长下测量吸光度。
[0025]
凋亡的测量(膜联蛋白v染色)。将癌细胞以1.5
×
105/ml的密度接种在6孔板中，并用媒介物(dmso)或化合物处理24小时。随后将细胞染色，并根据制造商的方案(invitrogen, carlsbad ca)使用死亡细胞凋亡试剂盒和alexa fluor 488测定试剂盒通过流式细胞术来分析。
[0026]
划痕和侵袭测定。在6孔板中保持80%汇合，使用无菌移液管尖端产生划痕，并且24小时后确定细胞向划痕处的迁移。bd-matrigel侵袭室(24-transwell，具有8 μm孔径的聚碳酸酯膜)用于改进的boyden室测定。下室中的培养基含有gbm的完全培养基，其用作化学引诱物。将无血清培养基中的pdx细胞(5
×
104个细胞/插入物)铺板于含有或不含各种浓度的化合物的上室中，并在37℃、5% co2下孵育24小时；用湿棉签从膜的上表面去除非侵袭细胞。用10%福尔马林将侵袭细胞固定在下表面10分钟，在苏木精和曙红y溶液(h&e)中染色。洗涤和干燥后，计数五个相邻视野中的细胞数。
[0027]
小干扰rna干扰测定。将细胞(2
×
105个细胞/孔)在完全培养基中铺板于6孔板中。24小时后，按照生产商的方案，使用lipofectamine rnaimax试剂(invitrogen, carlsbad, ca)，用100 nm每种sirna双链体转染细胞6小时。靶向nr4a2的反义寡核苷酸直接用于6孔板中，并使最终浓度为10 μm。对于sirna介导的转染，将培养基更换为含有10% fbs的新鲜培养基，而对于反义寡核苷酸不更换培养基。两种转染条件都孵育42小时。孵育后，用媒介物(dmso)或不同浓度的化合物处理细胞，并收集细胞用于进一步实验。
[0028]
免疫荧光。将15037、14015s和u87-mg细胞(1.0
×
105/ml)铺板于完全培养基中，并用dmso或c-dim 12处理24小时或用sict或sinr4a2处理48小时。随后用37%福尔马林固定细胞，封闭，用荧光ki67第一抗体处理24小时。随后用pbs洗涤细胞，并用抗小鼠igg fab2 alexa fluor 488第二抗体在室温下处理2小时。最后，用zeiss共焦荧光显微镜观察细胞。
[0029]
蛋白质印迹分析。将17008、15037、14104s、14015s、15049、u87-mg、a172、t98g和ccf-sttg1细胞以1.5
×
105/ml的密度接种在6孔板中，并用各种浓度的化合物处理，并用ripa裂解缓冲液提取全细胞蛋白质，所述ripa裂解缓冲液含有10 mm tris-hcl (ph 7.4)、150 mm nacl、1 mm乙二胺四乙酸(edta)、1% triton x-100 (w/v)、0.5%脱氧胆酸钠和0.1%十二烷基硫酸钠(sds)，具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。使用lowry方法测量蛋白质浓度，并在10%和15% sds-page中分离等量的蛋白质，并转移到聚偏二氟乙烯(pvdf)膜。将pvdf膜在4℃下用第一抗体在5%脱脂乳中孵育过夜，并用缀合有辣根过氧化物酶(hrp)的第二抗体孵育2-3小时。随后将膜暴露于hrp-底物，并用化学发光试剂检测免疫反应的蛋白质。
[0030]
三维(3d)肿瘤球体侵袭测定。将细胞悬浮在完全培养基中(2
×
104个细胞/ml)。通过将200 μl细胞悬浮液接种到96孔圆底超低附着培养板(costa，#7007)的孔中来产生球体。在37℃下在5% co2培养箱中孵育24小时后，从球体板中去除100 μl/孔的生长培养基，并在每个孔的底部加入100 μl/孔的matrigel (corning，#356234)。将板转移到培养箱中1小时，并补充100 μl含有3倍于期望的最终浓度的化合物的完全培养基，并随后孵育3-5天，随后在4%甲醛中固定。通过用imagej测量被侵袭细胞的球体中心和边缘的横截面积来确定球体侵袭。
[0031]
异种移植物研究。雌性无胸腺nu/nu小鼠(4-6周龄)购自harlan laboratories (houston, tx)。在100 μl的dmem中收获u87-mg细胞(1
×
106)，并悬浮在冰冷的matrigel (1:1比率)中，并皮下注射至小鼠的胁腹区域的任一侧。在肿瘤细胞接种一周后，将小鼠分成两组，每组5只动物。第一组接受100 μl媒介物(玉米油)，而第二组动物接受30 mg/kg/天在100 μl体积玉米油中的c-dim 12的腹膜内注射三周。在治疗过程中每周对所有小鼠称重一次以监测体重的变化。在治疗期间不能确定肿瘤体积，因为异种移植的肿瘤相对深。治疗
三周后，处死小鼠并确定肿瘤重量。
[0032]
统计分析。使用单向anova和dunnett检验来确定两组之间的统计学显著性。为了证实数据的再现性，实验至少独立地进行三次，并且结果表示为平均值
±
标准偏差(sd)。p值小于0.05被认为是统计学上显著的。
[0033]
结构活性研究。在结构活性研究中，两种喹啉衍生物(氯喹(cq)和阿莫地喹(aq))用作“对照
”ꢀ
nr4a2配体，其以前已经在帕金森病模型中进行研究。研究了双吲哚和喹啉衍生物对nr4a2调节的基因血管活性肠肽(vip)的激活的作用。用双吲哚类似物(5 μm、10 μm和15 μm)、cq (100 μm、150 μm和200 μm)或aq (50 μm、75 μm和100 μm)处理panc1 (图1a和图1b)和panc28 (图1c和图1d)细胞。通过定量pcr分析确定vip的相对表达水平。对于每种处理，结果表示为至少六个单独测定的平均值
±
sd。星号(*)指示最高浓度处理相对溶剂对照(dmso)的显著基因诱导(p《0.01)。图1a显示双吲哚化合物显著诱导panc1细胞中的vip，使用2-oh-4-br观察到高达330倍的诱导(图1a)。尽管cq和aq在panc1细胞中诱导vip (2.3-4.1倍)，但应答的幅度显著低于nr4a2活性双吲哚化合物(图1b)。双吲哚和喹啉之间在panc28细胞中诱导vip的差异(分别为图1c和图1d)与在panc1细胞中观察到的相似。活性最低的双吲哚化合物n-me-4-oh在panc1和panc28细胞中是比cq或aq更有效的vip的诱导剂。因此，已经鉴定了比dim-c-pphcl (4-cl)和dim-c-pphbr (4-br)更有效的新nr4a2配体。
[0034]
通过直接配体结合淬灭nr4a1色氨酸荧光。如本文所述获得色氨酸荧光光谱。简言之，将nr4a1的带组氨酸标签的配体结合结构域(lbd)以0.5 μmol/l的最终浓度在1.0 ml磷酸盐缓冲的盐水(pbs，ph 7.4)中用于荧光测量。在温度受控的(quantum northwest tc125)荧光分光光度计(varian cary eclipse)中，在25℃下将蛋白质孵育3分钟。使用285 nm的激发波长(激发狭缝宽度=5 nm)和300-420 nm范围的发射波长(发射狭缝宽度=5 nm)获得荧光光谱。随后将配体的等分试样(0.1 μl/等分试样) (10 mmol配体/l乙醇)加入到含有nr4a1的比色皿中，使配体的最终浓度为30 μmol配体/l。在各等分试样的配体后，将nr4a1/配体溶液在25℃下孵育3分钟，并如上所述测量nr4a1色氨酸荧光。仅加入乙醇(直至最终体积为3.0 μl)对nr4a1色氨酸荧光没有作用(数据未显示)。根据上面列出的参考文献，通过测量nr4a1色氨酸在330 nm发射波长下的荧光强度，确定与nr4a1的配体结合亲和力(kd)。如以上参考文献所述，在各配体浓度下仅配体的荧光强度用于校正nr4a1色氨酸荧光强度。
[0035]
与nr4a1 lbd的配体结合：bisans置换测定。bisans (molecular probes, inc/thermofisher)在水性溶液中基本上是无荧光的；然而，当结合到蛋白质(例如nr4a1)时，bisans荧光显著增加。nr4a1/bisans的结合亲和力(kd)和结合化学计量(bmax)基本上如在febs journal, 2014, 281, 2266-2283中所述确定。对于nr4a1/bisans，确定结合亲和力(kd)为0.84 μmol/l，并且确定结合化学计量(bmax)为0.80 mol bisans/mol nr4a1。基本上如在febs journal, 2014, 281, 2266-2283中所述分析配体置换bisans的能力。简言之，在5.0
ꢀµ
mol bisans/l存在下，将带组氨酸标签的nr4a1 lbd (最终浓度=0.05 μmol/l pbs，ph 7.4)在25℃下孵育3分钟。利用varian cary eclipse荧光分光光度计，用365 nm的激发波长(激发狭缝宽度=5 nm)和400-600 nm范围的发射波长(发射狭缝宽度=5 nm)获得bisans 荧光光谱。如上所述使用10 mmol配体/l乙醇的储备配体浓度，完成配体滴定用于
直接配体结合。仅加入乙醇对nr4a1/bisans荧光没有作用(数据未显示)。根据上述参考文献，通过在500 nm发射波长下测量nr4a1/bisans荧光强度，确定nr4a1的配体结合亲和力(ki)。如以上参考文献中所述，使用各配体浓度下的配体/bisans荧光强度来校正nr4a1/bisans/配体荧光强度。
[0036]
通过全细胞裂解物的蛋白质印迹分析确定成胶质细胞瘤细胞系(a172、u87-mg、u98g和ccf-sttg1)和患者衍生的细胞(1708、15037、14004s、14015s和15049)中nr4a受体的表达。nr4a2在所有细胞系中表达，而nr4a3在大多数细胞系中表达，而在已建立的细胞系中检测到nr4a1，但仅在两种患者衍生的细胞系中检测到nr4a1。因此，在缺乏nr4a1时患者衍生的细胞系的nr4a2表达有些独特。在本公开中，研究了nr4a2在u87-mg、15037和14015s细胞中的作用，以确定使用反义寡核苷酸(#3和#4)的nr4a2敲低对细胞增殖、存活和侵袭的作用。nr4a2敲低如下进行：用靶向nr4a2的寡核苷酸(sinr4a2
‑ꢀ
#3和#4)或非特异性对照(nc)转染成胶质细胞瘤细胞，并通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物，并如本文所述确定对细胞增殖(图2a)、细胞侵袭(图2b)和膜联蛋白v染色(图2c)的作用。用非特异性对照(nc)或靶向nr4a2的寡核苷酸(#3和#4)转染细胞，并通过全细胞裂解物的蛋白质印迹确定凋亡标记物。结果(图2a-2c)是每个处理组至少三次测定的平均值
±
sd，并且显著(p《0.05)作用[与对照(nc)相比]被指示(*)。在15037细胞中未观察到胱天蛋白酶8裂解。反义寡核苷酸有效降低nr4a2在15037、14015s和u87-mg细胞中的表达，并且这伴随着细胞增殖降低(图2a)和使用boyden室测定的细胞侵袭降低(图2b)。此外，nr4a2表达降低诱导凋亡标记物，包括诱导膜联蛋白v染色(图2c)和胱天蛋白酶8、7和parp在15037、14015s和u87-mg细胞中的裂解(注意：在15037细胞中未检测到裂解的胱天蛋白酶8)。
[0037]
由于15037、14015s和u87-mg细胞表达nr4a3，还研究了通过rna干扰(rnai)的nr4a3敲低对细胞系表型特征的作用。用nc或靶向nr4a3的寡核苷酸转染细胞，并且如本文所述确定对nr4a3表达(通过全细胞裂解物的蛋白质印迹确定)、细胞增殖(图3a)、细胞侵袭(图3b)和膜联蛋白v染色(图3c)的作用。用sinr4a2或sinr4a3转染细胞，并如本文所述确定ki67染色。结果(图3a-3c)表示为平均值
±
sd，每个处理组至少三次测定，并且与对照/未处理组的显著(p《0.05)差异被指示(*)。nr4a3的缺失对细胞增殖(图3a)、侵袭(图3b)或凋亡(图3c)具有最小的作用，并且ki67增殖标记物的染色证明nr4a3的缺失对ki67染色具有最小的作用。这些结果首次清楚地证明nr4a2是成胶质细胞瘤细胞中的原致癌因子，而nr4a3对其生长、存活和侵袭的作用最小。
[0038]
先前的研究已经鉴定了一系列诱导nr4a2依赖性反式激活的双吲哚衍生的化合物(c-dim)，并且1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对氯苯基)甲烷(dim-c-pphcl，4-cl)已经用作原型nr4a2配体(化合物1)。以下说明和在图10中描述的化合物1显示原型nr4a2配体。用nr4a2配体处理细胞。用uas-luc/gal4-nr4a2 (图4a)、nbre-luc/nr4a2表达质粒(40 ng) (图4b)和nurre-luc/nr4a2表达质粒(40 ng) (图4c)转染细胞，用双吲哚衍生的配体处理，并如本文所述确定萤光素酶活性。结果是每个处理组三次重复测定的平均值
±
sd，并且显著(p《0.05)作用(与dmso对照相比)被指示(*)。
[0039]
化合物1
在胰腺癌细胞中正在进行的筛选鉴定了3个另外的nr4a2配体，包括1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl)、1,1-二甲基-1,1-双(3'-吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷(n-me-4-oh)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基-苯基)甲烷(2-oh-4-br)。这些化合物在panc1细胞中诱导nr4a2依赖性反式激活；然而，在用gal4-nr4a2嵌合体和含有gal4应答元件的报告质粒(uas
5-luc)转染的14015s和15037成胶质细胞瘤细胞中，所有这些化合物都降低反式激活(萤光素酶活性) (图4a)。还使用报道的基因构建体研究了nr4a2调节的基因表达的配体依赖性调节，所述基因构建体含有ngf1-b应答元件-萤光素酶构建体(nbre
3-luc) (图4b)和nur应答元件(nure
3-luc) (图4c)，它们分别作为单体和二聚体结合nr4a2。在这些测定中，所述三种配体还降低nr4a2依赖性反式激活，表明它们在成胶质细胞瘤细胞中充当nr4a2反向激动剂/拮抗剂。
[0040]
用dim-c-pphcl (图5a)、3-cf
3-4-cl (图5b)和2-oh-4-br (图5c)处理15037、14015s和u87-mg细胞抑制细胞增殖。用不同浓度的dim-c-pphcl (4-cl) (图5a)、1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-氯-3-三氟甲基苯基)甲烷(3-cf
3-4-cl) (图5b)和1,1-双(3'-吲哚基)-1-(4-溴-2-羟基苯基)甲烷(2-oh-4-br) (图5c)处理细胞，并如本文所述确定对成胶质细胞瘤细胞增殖的作用。用4-cl (30 mg/kg/天)处理携带u87-mg细胞作为异种移植物的无胸腺裸小鼠，并通过肿瘤裂解物的蛋白质印迹分析确定对照(玉米油)和4-cl处理的小鼠对肿瘤重量和肿瘤中凋亡标记物表达的作用。确定对照相对4-cl-处理的小鼠中各种蛋白质的表达水平(相对于β-肌动蛋白归一化)。用不同的nr4a2拮抗剂处理成胶质细胞瘤细胞，并如本文所述确定ki-67染色。结果(图5a-5c)表示为每个处理组至少三次重复的平均值
±
sd，并且与未处理的对照的显著(p《0.05)差异被指示(*)。
[0041]
观察到在携带u87-mg肿瘤细胞作为异种移植物的无胸腺裸小鼠中4-cl (30 mg/kg/天)显著降低肿瘤重量(图5d)，并且与媒介物对照相比，在来自4-cl处理的小鼠的肿瘤中，这伴随裂解的胱天蛋白酶8而不是裂解的胱天蛋白酶7以及cparp的显著上调。用4-cl处理24小时降低15037、14015s和u87-mg细胞中的ki67 (增殖标记物)。因此，nr4a2配体和nr4a2敲低(图2a-2c)是生长抑制性的，指示c-dim是nr4a2拮抗剂，并且这与它们在反式激活测定中的拮抗剂活性一致(图4a-4c)。用4-cl (图6a)、3-cf
3-4-cl (图6b)和2-oh-4-br (图6c)处理成胶质细胞瘤细胞诱导膜联蛋白v染色和裂解的胱天蛋白酶7、8和parp裂解。用不同浓度的4-cl (图6a)、3-cf
3-4-cl (图6b)和2-oh-4-br (图6c)处理成胶质细胞瘤细胞，并如本文所述确定对诱导膜联蛋白v的作用。用不同浓度的nr4a2拮抗剂处理成胶质细胞瘤细胞，并通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物的凋亡标记物。结果(图6a-6c)表示为每个处理组至少三次测定的平均值
±
sd，并且与未处理的对照相比显著的(p《0.05)应答被指示(*)。这些结果与敲低nr4a2后观察到的结果(图2c)相当。
[0042]
各种配体在生长抑制和凋亡诱导方面的效力是配体、细胞类型和应答依赖性的，其中在15037 (高)细胞中膜联蛋白v诱导倍数相对14015s (低)细胞中膜联蛋白v诱导倍数
最明显不同，并且这部分是由于未处理的14015s细胞中膜联蛋白v的相对较高的表达。
[0043]
用12.5 μm (3-cf
3-4-cl和2-oh-4-br)或20 μm (c-dim 12) 处理细胞，并且如本文所述，分别在boyden室和划痕测定中确定成胶质细胞瘤细胞侵袭或迁移的作用。也如本文所述在15037细胞中在肿瘤球体侵袭测定中确定nr4a2配体对细胞迁移的抑制(注意：14015s和u87-mg细胞在该测定中未表现出侵袭)。在boyden室测定中nr4a1拮抗剂也抑制15037和14015s细胞的侵袭，其中后一种细胞系似乎更灵敏，并且与3-cf
3-4-cl或2-oh-4-br (图7a)相比，4-cl介导的细胞侵袭抑制需要更高的浓度。在15037和14015s细胞的划痕测定中观察到类似的结果，其中20 μm dim-c-pphcl表现出最小的迁移抑制，并且较低浓度(12.5 μm)的2-oh-4-br和3-cf
3-4-cl抑制迁移，其中后一种化合物是最有效的抑制剂。还观察到，与dmso (溶剂对照)或用对照寡核苷酸(sict)转染的细胞相比，使用15037细胞，敲低nr4a2或用10 μm 4-cl处理抑制肿瘤球体侵袭(图7b)。这些结果证明nr4a2在成胶质细胞瘤中是生长促进、存活和促侵袭基因，并且c-dim/nr4a2配体充当nr4a2拮抗剂，并代表治疗该疾病的新的化学治疗方法。
[0044]
估计23,880例脑和神经系统癌症的新病例将被诊断，并且16,380例死亡将因这些疾病而发生。gbm是最频繁被诊断的恶性脑肿瘤，并且该疾病的全球发病率在0.59-3.69/100,000变化。在成人中诊断gbm是致命性的，因为患者存活时间在12-15个月的范围内，并且患者在诊断后的3年存活在3-5%范围内。原发性新生gbm占所有病例的约90%，并且发生于老年患者，而继发性gbm主要在年轻患者中诊断。gbm是复杂的疾病，其涉及包括若干基因突变的多种遗传改变，导致难以治疗的高度侵袭性疾病。目前对新诊断的成胶质细胞瘤患者的护理标准包括手术、辅助放射疗法和药物替莫唑胺(tmz；烷基化剂)，并且这些治疗方案的成功有限。高级神经胶质瘤细胞最麻烦的生物学特征是它们侵袭正常周围脑组织的倾向和能力，从而避开外科医生的刀以及递送到手术切除边缘的辐射。这种浸润肿瘤细胞的库形成神经胶质瘤干细胞亚群，其成为肿瘤复发/进展的主要来源，并且它们通常对化学辐射有抗性，并且经常是最终患者死亡的原因。孤儿核受体nr4a2在神经元功能中起重要作用，并且以前的研究显示在小鼠帕金森病模型中4-cl和一些相关的c-dim化合物穿过血脑屏障，并抑制nr4a2依赖性炎症应答。在已建立的和患者衍生的成胶质细胞瘤细胞系中的初步研究结果证明nr4a1、nr4a2和nr4a3在这些细胞中的表达以及患者衍生的细胞主要表达nr4a2/nr4a3，具有相对低水平的nr4a1。这些孤儿受体在患者衍生的细胞中的差异表达为研究nr4a2的功能和靶向该受体作为治疗gbm患者的新方法的潜力提供机会。
[0045]
基因敲低方法最初用于确定nr4a2在患者衍生的14015s、15037和u87-mg成胶质细胞瘤细胞中的功能。结果指示nr4a2的缺失导致抑制生长、诱导凋亡和抑制侵袭。nr4a2敲低的作用与nr4a3敲低后获得的结果相反，nr4a3对细胞生长、存活和迁移的作用最小。因此，nr4a2在gbm中明显表现出原致癌活性，并且这些结果与以前关于nr4a2在其它癌细胞系中的功能和nr4a2的原致癌活性的报道一致。
[0046]
以前的研究已经表征了4-cl作为nr4a2配体，其在帕金森病模型中作为治疗一些nr4a2-调节的途径的抗炎药物是有效的。在胰腺癌细胞的反式激活研究中，4-cl激活nr4a2依赖性反式激活，而4-cl和两种另外的c-dim类似物抑制gbm细胞中nr4a2依赖性反式激活(图4a-4c)。因此，就nr4a2依赖性反式激活而言，4-cl和相关的化合物是表现出细胞类型特异性激动剂和拮抗剂活性的选择性受体调节剂，并且这在以前已经在结合nr4a1的c-dim中
观察到。
[0047]
4-cl和相关的化合物不仅抑制nr4a2依赖性反式激活，而且抑制nr4a2依赖性细胞生长、存活和迁移。此外，在异种移植模型中使用u87-mg细胞在无胸腺裸小鼠中观察到类似的应答，其中4-cl抑制肿瘤生长并诱导肿瘤凋亡。
[0048]
这些结果证实nr4a2的原致癌活性，并显示用作拮抗剂的nr4a2配体(例如c-dim)代表治疗gbm的新方法。容易设想集中于研究和鉴定gbm中nr4a2调节的基因/途径的研究，以及开发更有效的nr4a2拮抗剂用于未来临床应用。另外，并且如前详述的，c-dim12 (4-氯类似物)通过与共激活剂结合位点而不是nr4a2的配体结合结构域相互作用来靶向nr4a2。因此，开发了nr4a1和nr4a2的配体结合测定，其测量配体色氨酸荧光的配体诱导的猝灭，以进一步表征关于nr4a1和nr4a2的活性。色氨酸残基位于两种受体的配体结合结构域(lbd)中，并且受体的lbd用于结合测定。下表1总结了c-dim12和其它nr4a2-活性化合物的结合kd值，并且它们不淬灭lbd-trp，并且这证实以前的模型化研究，其显示c-dim12在nr4a2的lbd之外结合nr4a2。c-dim12的3-cl和2-cl-苯基异构体得到类似的结果(表1)。然而，将第二个氯取代基引入苯环导致若干二氯取代的类似物结合(色氨酸猝灭)到nr4a2和nr4a1两者(图8)。这些出乎意料的结果表明，在苯环上含有两个或更多个取代基的cdim结合nr4a2和nr4a1两者的可能性。使用两个系列的化合物测试该假设；原型nr4a1配体的3,5-二取代的类似物c-dim8 [1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷] (表2，如下所示)；和一组新的3,5-二取代的苯基cdim类似物(表3，如下所示) (图9)。结果显示所有这些具有两个或更多个苯基取代基的化合物均结合nr4a2和nr4a1。
[0049]
表1：4-取代的(苯环)和二氯取代的cdim与nr4a1和nr4a2的结合表2：cdim8的3,5-二取代的类似物(1,1-双(3
’‑
吲哚基)-1-(对羟基苯基)甲烷)与nr4a1和nr4a2的结合
表3：cdim的3,5-二取代的类似物与nr4a1和nr4a2的结合这些数据强调了在苯环上具有两个或更多个取代基的cdim作为nr4a2和nr4a1配体的有希望结果。因此，由于双吲哚衍生的化合物能够结合到nr4a1和nr4a2，双吲哚衍生的化合物(例如在苯环上具有两个或更多个取代基的双吲哚衍生的化合物)可以用于在细胞中诱导抗癌或抗炎活性，以及治疗其它疾病，例如但不限于癌症、脑癌、乳腺癌、肾癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、炎性疾病、哮喘、慢性消化性溃疡、结核病、类风湿性关节炎、牙周炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、鼻窦炎、活动性肝炎及其组合。
[0050]
尽管已经在附图中说明并在前述具体实施方式中描述了本公开的各种实施方案，将理解，本公开不限于本文公开的实施方案，而是能够在不背离本文阐述的本公开的精神的情况下进行许多重排、修改和替换。
[0051]
术语“基本上”定义为大部分但不必全部是指定内容，如本领域普通技术人员所理解的。在任何公开的实施方案中，术语“基本上”、“大约”、“通常”和“约”可以用“在所规定的[百分比]内”来代替，其中百分比包括0.1%、1%、5%和10%。
[0052]
以上概述了若干实施方案的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开的各方面。本领域技术人员应当理解，他们可以容易地使用本公开作为基础来设计或修改用于进行本文介绍的实施方案的相同目的和/或实现本文介绍的实施方案的相同优点的其它过程和结构。本领域技术人员还应当认识到，这样的等同构建并不脱离本公开的精神和范
围，并且他们可以在不脱离本公开的精神和范围的情况下进行各种改变、替换和变更。本发明的范围应当仅由所附权利要求的语言来确定。权利要求中的术语“包含”旨在是指“至少包括”，使得权利要求中引用的要素列举是开放的组。术语“一”、“一个”和其它单数术语旨在包括其复数形式，除非明确排除。
再多了解一些
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