基于细菌菌株和浆果提取物的组合物及其作为抗炎剂的用途的制作方法

基于细菌菌株和浆果提取物的组合物及其作为抗炎剂的用途
1.本发明涉及包含混合物的组合物a，所述混合物包含或由以下组成：至少两种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：属于副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种的种的细菌菌株。作为另一种选择，本发明涉及包含混合物的组合物b，所述混合物包含或由以下组成：至少一种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：属于副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种的种的细菌菌株，以及至少一种浆果的包含所述浆果的多酚成分的至少一种提取物。此外，本发明涉及用作免疫调节剂和抗炎剂的所述组合物a和组合物b。
2.在过去的几十年里，科学界对肠道微生物群的改变进行了研究，目的是获得对受试者健康的影响。众所周知，肠道微生物群是促进消化过程、维生素的产生、胆汁酸的转化、从食物成分中产生大量的生物活性化合物的关键因素。例如，短链脂肪酸是由亚油酸、肠二醇和木质素肠内酯结合的纤维-亚油酸发酵产生的，这些都与抗肿瘤、抗炎和其他促进健康的作用有关。肠道微生物群中的有益菌也通过调节局部和全身免疫反应在免疫中发挥重要作用，它们可以通过称为屏障效应的竞争机制阻止病原菌的生长。虽然肠道微生物种类的组成因人而异，但对于每个成年人来说是相对恒定的，并且主要由遗传因素和生命早期的肠道定植决定。然而，其组成可能受到多种因素的显著影响，如饮食和益生菌产品或益生元产品或活生物治疗产品(简称lbp，基于活细菌菌株的药物产品)的摄入量。
3.因此，科学界对能够通过与肠道微生物群相互作用提供积极作用的组合物，特别是能够通过调节免疫系统对炎症刺激的相应而发挥抗炎作用的组合物的仍保有浓厚兴趣。
4.经过深入的研究和开发阶段，如本说明书和所附权利要求中所详细描述的，本技术人发现包含至少两种细菌菌株的特定混合物的组合物和/或包含至少一种或多种细菌菌株和的至少一种浆果的包含所述浆果的多酚成分的提取物的组合物能够积极调节免疫系统的响应并发挥抗炎作用。
5.在本发明的上下文中，术语“浆果(berry)”用于表示所谓的“野生浆果(wild berry)”，作为一种小肉质、甜或酸的可食用水果，其植株生长在半阴影条件和寒冷气候中的特殊的潮湿气候和灌木丛的酸性土壤中。
6.在本发明的上下文中，术语“浆果”和“野生浆果”是同义词。
7.在本发明的上下文中，“浆果”或“野生浆果”的种类包括以下实例中的至少一种：蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)、红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vaccinium macrocarpon)、野生草莓或草莓(fragaria vesca或fragaria spp.或fragaria ananassa)、接骨木莓(sambucus nigra)、越橘(vaccinium vitis-idaea)、黑莓(rubus ulmifolius)、红树莓(rubus idaeus)、黑树莓(rubus leucodermis或rubus occidentalis)、黑醋栗(ribes nigrum)、红醋栗(ribes rubrum)、黑桑(morus nigra)、红桑(morus rubra)、白桑(morus alba)、欧亚山茱萸(cornus mas)、鹅莓(ribes uva-crispa)、欧洲小檗(berberis vulgaris)、卵圆唐棣(amelanchier ovalis)、桤叶唐棣(amelanchier canadensis)、马哈利樱桃(prunus mahaleb)、酸樱桃和黑樱桃(prunus cerasus)、草莓树(arbutus unedo)。
8.特别是，
[0009]-蓝莓(欧洲蓝莓或野生蓝莓)是分类为越橘属(vaccinium)多年生植物的果实(蓝色或紫色浆果)。美国蓝莓被归类为越橘属青果组(vaccinium cyanoccus(rydb.))种，而越橘则被归类为欧洲越橘(vaccinium myrtillus)(l.,1753)种；此外，还有狭叶越橘(vaccinium angustifolium)(aiton，1789)，俗称野生蓝莓，原产于加拿大东部和中部以及美国东北部；在本发明的上下文中，术语蓝莓优选用于指代欧洲越橘和狭叶越橘种；
[0010]-蔓越橘(红莓苔子或熊果或美国蔓越橘)是一组常绿矮灌木或最终藤本植物的果实，归类于越橘属的红莓苔子种。在英国，蔓越橘是指本土物种越橘属红莓苔子(l.,1753)或红莓苔子；而在北美，蔓越橘是指大果越橘(vaccinium macrocarpon)(aiton1789)或熊果或美洲蔓越橘；在本发明的上下文中，术语蔓越橘优选用于指代大果越橘种；
[0011]-草莓(野生草莓或草莓)是一种草本植物的果实，归类为蔷薇科(rosaceae)草莓属(fragaria)的野草莓(fragaria vesca)(l.,1753)种或草莓亚种(fragaria spp.)或草莓(fragaria anananassa(duchesne))种；
[0012]-接骨木莓(黑接骨木莓)是归类为五福花科(adoxaceae)接骨木属(sambucus)的西洋接骨木(sambucus nigra)(l.,1753)种植物的果实；
[0013]-黑树莓是属于悬钩子属(rubus)的三种植物的果实：原产于北美西部的黑悬钩子(rubus leucodermis)(dougal.ex torr.&a.gray 1840)、原产于北美东部的喜阴悬钩子(rubus occidentalis)(l.,1753)和原产于韩国、日本和中国的也称为黑色韩国树莓的高丽悬钩子(rubus coreanus)(miq.1867)；
[0014]-红树莓是归类为蔷薇科悬钩子属覆盆子(rubus idaeus)(l.,1753)种的植物的果实。
[0015]
在本发明的上下文中，提及上述浆果种类时将互换使用意大利或英文名称。
[0016]
自20世纪末以来，科学界一直对所述浆果的有益效果有着浓厚的兴趣。浆果通常被称为营养食品，因为它们含有大量的水溶性维生素、矿物质(钾、锰、锌)和纤维。然而，据假设，其中所含的多酚是导致其益处(例如抗氧化和抗炎特性)的主要成分。
[0017]
浆果富含多酚，诸如花色素苷、花色素和/或原花色素。
[0018]
原花色素(proanthocyanidin)是存在于多种植物物种中的一类多酚。它们是类黄酮的化学寡聚重复物，例如儿茶素和表儿茶素及其没食子酸酯的寡聚重复物。
[0019]
花色素苷(anthocyanin)(或花青素(anthocyan))属于类黄酮家族，它们衍生自各自的糖苷配基(aglycone)(花色素(anthocyanidin))，不同之处在于添加了一个或多个糖苷基团(糖)。
[0020]
在过去的二十年里，已经进行了大量的研究来确定所述浆果的潜在健康益处。浆果的高抗氧化能力可以部分解释它们对与氧化应激和活性氧类存在相关的退化过程的保护活性，这也是心血管水平的保护活性和抗癌活性的主要原因，通常归因于食物中多酚的存在。此外，除了显著的抗氧化作用外，浆果中所含的酚酸和白藜芦醇(多酚)还具有相当大的代谢作用。花色素(多酚)的大量存在也有助于在运动系统(肌肉和骨骼系统)、消化系统、泌尿生殖系统(泌尿系统和生殖系统)、呼吸系统、皮肤系统、免疫系统和循环系统水平的特定抗炎作用。最后，各种浆果在防止细菌粘附至尿路上皮表面、抑制生物膜、改变基因表达和膜结构、改变肠道微生物群方面显示出特定的抗菌和益生元活性。
1572。应当注意的是，无论名称是干酪乳杆菌cncm i-1572还是副干酪乳杆菌cncm i-1572，它仍然是相同的细菌菌株。
[0033]
被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01
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的细菌菌株由索法尔公司于2017年5月15日保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 26760(根据布达佩斯条约转换保藏的申请日；原始保藏日期：2013年1月11日)(简称，lpc-s01
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或副干酪乳杆菌lpc-s01
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dsm 26760)。应当注意的是，无论申请人使用名称副干酪乳杆菌s01dsm 26760或副干酪乳杆菌lpc-s01
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dsm 26760，它仍然是相同的细菌菌株。
[0034]
被鉴定为两歧双歧杆菌mimbb23sg(或者，mimbb23sg)，或者命名为两歧双歧杆菌bbfiblpc-s01
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或两歧双歧杆菌bbfibs01的细菌菌株由索法尔公司于2017年12月4日保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 32708(简称，23sg或两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708或两歧双歧杆菌bbfiblpc-s01
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dsm32708)。应当注意的是，无论申请人使用的内部名称mimbb23sg或bbfiblpc-s01
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或bbfibs01，它仍然是相同的细菌菌株。
[0035]
被鉴定为副干酪乳杆菌cf3的细菌菌株由索法尔公司于2016年8月4日保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 32353(简称，cf3或副干酪乳杆菌cf3dsm 32353)。
[0036]
被鉴定为鼠李糖乳杆菌gg的细菌菌株保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 53103(简称，gg或副干酪乳杆菌gg dsm 53103)。
[0037]
被鉴定为动物双歧杆菌乳亚种bb12的细菌菌株保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 15954(简称，bb12或动物双歧杆菌乳亚种bb12 dsm15954)。
[0038]
本发明中提及的所有菌株均根据布达佩斯条约保藏。
[0039]
在本发明的组合物(a)中，本发明的混合物(a)可以包含2、3、4、5或6种选自本发明定义的组(i.i)的细菌菌株。
[0040]
有利地，在包含选自组(i.i)的2、3、4、5或6种细菌菌株的所述混合物(b)中，所述细菌菌株相对于彼此的cfu比为约1:1或1:1:1或1:1:1:1或1:1:1:1:1或1:1:1:1:1:1。
[0041]
在本发明的组合物(a)的一个实施方式中，混合物(a)包含或由细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和至少一种选自组(i.ii)的细菌菌株组成，组(i.ii)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌(cncm i-1572)、副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm26760)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)、及其混合物。
[0042]
在本发明的组合物(a)的一个优选实施方式中，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)组成。
[0043]
在本发明的组合物(a)的一个优选实施方式中，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和副干酪乳杆菌(cncm i-1572)组成。
[0044]
在本发明的组合物(a)的一个优选实施方式中，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708、副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和至少一种选自组(i.iii)的细菌菌株组成，组(i.iii)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌(cncm i-1572)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)、及其混合物。
[0045]
在本发明的组合物(a)的一个优选实施方式中，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌
mimbb23sg dsm 32708、副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和至少一种选自组(i.iii)细菌菌株组成，组(i.iii)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)、及其混合物。
[0046]
在本发明的组合物(a)的一个优选实施方式中，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和副干酪乳杆菌(cncm i-1572)组成。
[0047]
例如，本发明的组合物(a)可以包含混合物(a)，混合物(a)包含或由两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708、副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)、副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和至少一种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)、及其混合物。
[0048]
形成本发明的一个目的是一种组合物(b)(简称，本发明的组合物(b))，其包含混合物(b)(简称，本发明的混合物(b))，其包含或由以下组成：
[0049]-至少一种选自组(i)的细菌菌株或细菌菌株的混合物，组(i)包含或由以下组成：属于副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、两歧双歧杆菌和动物双歧杆菌乳亚种的种的细菌菌株，和
[0050]-至少一种浆果的至少一种提取物，该提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成(简称，本发明的提取物)；并且其中，可选地，所述组合物(b)包含至少一种食品或药学级添加剂和/或赋形剂。
[0051]
所述浆果的所述多酚成分优选根据下文描述的本发明的提取方法获得，或者根据本领域技术人员已知的方法和设备获得。
[0052]
在本发明的上下文中，所述至少一种浆果的所述提取物的所述多酚成分包含至少一种或多种原花色素(a型和/或b型)和/或花色素苷或花色素(例如，锦葵色素或芍药色素)。术语“花色素苷”和“花青素”是同义词，在本发明的上下文中可互换使用。
[0053]
花青素(或花色素苷)是存在于本发明的浆果(例如，蔓越橘、蓝莓、草莓或接骨木莓)中的最重要的多酚化合物之一。浆果中的花青素含量可以高达5000mg/kg鲜重。自然界中最常见的糖苷配基(花色素)是：天竺葵素、矢车菊素、飞燕草素、芍药色素、矮牵牛素、锦葵色素。浆果含有约15种不同的花青素。花青素在越橘属植物的果实(浆果)中含量特别高，如蔓越橘和蓝莓。
[0054]
存在于越橘属植物(即蔓越橘和蓝莓)的浆果中的花青素(如矢车菊素、飞燕草素、锦葵色素、矮牵牛素和芍药色素)主要与糖苷残基结合并且它们存在于所述浆果中，例如，诸如矢车菊素-3-阿拉伯糖苷、矢车菊素-3-半乳糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-阿拉伯糖苷、飞燕草素-3-半乳糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵色素-3-阿拉伯糖苷、锦葵色素-3-半乳糖苷、锦葵色素-3-葡萄糖苷、矮牵牛素-3-阿拉伯糖苷、矮牵牛素-3-半乳糖苷、矮牵牛素-3-葡萄糖苷、芍药色素-3-阿拉伯糖苷、芍药色素-3-半乳糖苷、芍药色素-3-葡萄糖苷。
[0055]
可存在于本发明浆果提取物中的其他成分是糖类、有机酸和其他多酚诸如类黄酮
和单宁，以及维生素。
[0056]
关于本发明的浆果提取物的多酚含量，所选择的浆果之间存在差异。具体地，蔓越橘的特征以a型原矢车菊素的丰度来区分；主要的花色素是矢车菊素和芍药色素3-o-单糖苷；此外，蔓越橘还含有大量的酚酸和黄烷醇。相反，蓝莓普遍富含花色素，尤其是锦葵色素、b型原矢车菊素和绿原酸。其他浆果提取物(即草莓和接骨木莓)的特征在于具有不同的组成；即矢车菊素单糖苷(约占接骨木莓的10％)，以及草莓中普遍存在的鞣花单宁和天竺葵素糖苷。
[0057]
包含或由所述浆果的多酚成分组成的所述至少一种浆果的至少一种提取物(本发明的提取物)可以是单一浆果种类的单一提取物，或者是2或3或4种浆果的单一提取物；或者是2或3或4种提取物，其中每种提取物仅是一种浆果的提取物，或者每种提取物是2或3或4种浆果的提取物。优选地，本发明的提取物是仅一种浆果的仅一种提取物。可以在本发明的上下文中用于获得本发明的所述提取物的浆果的实例在下文实验部分和表1中报道。
[0058]
包含在本发明的混合物或组合物中的至少一种浆果(例如，蔓越橘、蓝莓、草莓或接骨木莓)的所述提取物包含或由多酚(例如，原花色素(a型和/或b型)和/或花色素苷和/或花色素)组成，其占提取物或干提取物总重量的50％至95％的重量百分比(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或98％)；优选70％至97％；更优选80％(或85％)至95％。
[0059]
本发明提取物中的花色素苷水平可以通过使用标准物质的外部校准来确定。
[0060]
本发明的所述提取物的所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)、红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vaccinium macrocarpon)、野生草莓或草莓(fragaria vesca或fragaria spp.或fragaria ananassa)、接骨木莓(sambucus nigra)、越橘(vaccinium vitis-idaea)、黑莓(rubus ulmifolius)、红树莓(rubus idaeus)、黑树莓(rubus leucodermis或rubus occidentalis)、黑醋栗(ribes nigrum)、红醋栗(ribes rubrum)、黑桑(morus nigra)、红桑(morus rubra)、白桑(morus alba)、欧亚山茱萸(cornus mas)、鹅莓(ribes uva-crispa)、欧洲小檗(berberis vulgaris)、卵圆唐棣(amelanchier ovalis)、桤叶唐棣(amelanchier canadensis)、马哈利樱桃(prunus mahaleb)、酸樱桃和黑樱桃(prunus cerasus)、草莓树(arbutus unedo)；
[0061]
优选蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)、红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vaccinium macrocarpon)、野生草莓或草莓(fragaria vesca或fragaria spp.或fragaria ananassa)、接骨木莓(sambucus nigra)及其混合物；
[0062]
更优选为蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)和红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vacciniummacrocarpon)。
[0063]
本发明组合物(b)的混合物(b)可以包含1、2、3、4、5或6种选自本发明定义的组(i)的细菌菌株。
[0064]
有利地，在包含选自组(i.i)的2、3、4、5或6种细菌菌株的所述混合物(b)中，所述细菌菌株相对于彼此的cfu比为约1:1或1:1:1或1:1:1:1或1:1:1:1:1或1:1:1:1:1:1。
[0065]
在本发明的一个实施方式中，本发明的组合物(b)包含混合物(b)，所述混合物(b)包含或由以下组成
[0066]-至少一种选自组(i.i)的细菌菌株或细菌菌株的混合物，组(i.i)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌(cncm i-1572)、副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)、两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)、及其混合物；和
[0067]-至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘、或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成；并且其中，可选地，所述组合物(b)包含至少一种食品级或药学上的添加剂和/或赋形剂。
[0068]
在本发明的组合物(b)的实施方式中，混合物(b)包含或由细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和所述的至少一种浆果的至少一种提取物组成，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘、蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0069]
在本发明的组合物(b)的一个实施方式中，混合物(b)包含或由细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和所述的至少一种浆果的至少一种提取物组成，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘、蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0070]
在本发明的组合物(b)的一个实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和至少一种选自组(i.ii)的细菌菌株，组(i.ii)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌(cncm i-1572)、副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)；和所述的至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0071]
在本发明的组合物(b)的一个优选实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0072]
在本发明的组合物(b)的一个实施方式中，所述混合物(b)包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和细菌菌株副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，和所述的至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0073]
在本发明的组合物(b)的一个优选实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708、细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和至少一种选自组(i.iii)的细菌菌株，组(i.iii)包含或由以下组成：副干酪乳杆菌
(cncm i-1572)、副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)、鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)、动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)；和所述的至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0074]
在本发明的组合物(b)的优选实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm26760)和细菌菌株副干酪乳杆菌(cncm i-1572)和所述的至少一种浆果的至少一种提取物，优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓及其混合物，更优选为蔓越橘或蓝莓及其混合物，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0075]
在本发明的组合物(b)中，与本发明中定义的至少一种细菌菌株或细菌菌株的混合物(优选两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和/或副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和/或副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，更优选为两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760))一起存在的是，所述的至少一种浆果的包含或由多酚成分组成的至少一种提取物(优选蔓越橘、蓝莓、草莓、接骨木莓和/或其混合物的提取物，更优选为蔓越橘或蓝莓和/或其混合物的提取物)，其以占组合物总重量的1％至95％的重量百分比存在(例如，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％)，更优选为5％至90％，甚至更优选为10％至80％。
[0076]
在本发明的组合物(b)的一个优选实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：至少一种选自组(i)或(i.i)的细菌菌株或细菌菌株的混合物，优选为两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和/或副干酪乳杆菌lpc-s01
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(dsm 26760)和/或副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，更优选为两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(dsm 26760)；和蔓越橘的提取物，其包含或由多酚(即原花色素和/或花色素苷和/或花色素和/或其他多酚)组成，所述多酚占提取物总重量的70％至99％的重量百分比(例如，75％、80％、85％、90％、95％、97％或98％)；优选80％至97％；更优选85％至95％。
[0077]
在本发明的组合物(b)的一个优选实施方式中，混合物(b)包含或由以下组成：至少一种选自组(i)或(i.i)的细菌菌株或细菌菌株的混合物，优选为两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和/或副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(dsm 26760)和/或副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，更优选为两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(dsm 26760)；和包含或由多酚组成的蓝莓的提取物，所述多酚占提取物总重量的70％至99％的重量百分比(例如，75％、80％、85％、90％、95％、97％或98％)；优选80％至97％；更优选85％至95％。
[0078]
包含在本发明的所述混合物(a)或(b)中的所述至少一种细菌菌株或细菌菌株的混合物的所述组合物(a)或(b)的每日剂量的量是足以实现暂时性的肠定殖的最小量，如相对于每日摄入量(cfu/g：本发明的组合物(a)或(b)的菌落形成单位或克)，细菌菌株的含量为105cfu/g至10
12
cfu/g，优选107cfu/g至10
11
cfu/g，更优选108cfu/g至10
10
cfu/g，例如1
×
109cfu或5
×
109cfu。所述细菌菌株的量可以指在所述每日摄入量中每种细菌菌株的量或指
在所述每日摄入量中包含的细菌菌株的总量。作为另一种选择，所述细菌菌株的量可以指剂量单位中每种细菌菌株的量或剂量单位中包含的细菌菌株的总量；一个剂量单位可以一天施用数次(例如一天2或3或4次)。
[0079]
在本发明的上下文中，细菌菌株可以是或衍生自：益生菌(活的和有活力的)、间歇灭活的细菌、灭活细菌(例如通过γ辐射或超声处理)、副益生菌、裂解物或提取物形式的细菌(例如细胞壁提取物)或细菌的任何衍生物和/或组分，优选由细菌产生的己多糖、侧壁成分、代谢物或代谢生物产物(后生元)和/或任何其他细菌衍生产物。
[0080]
优选地，本发明的细菌菌株是益生菌菌株，例如“当以足够量施用时，赋予宿主健康益处的活的和有活力的微生物”(fao和who定义)。
[0081]
除了本发明的细菌菌株，并且如果存在的话，除了所述的至少一种浆果的至少一种提取物之外，本发明的组合物(a)和组合物(b)可选地包含所述至少一种药物或食品级添加剂和/或赋形剂，即，一种适用于药物或食品用途的没有治疗活性的物质。在本发明的上下文中，“可用于药物或食品用途的添加剂和/或赋形剂”包括本领域技术人员已知的用于制备固体、半固体或液体形式的组合物的所有辅助物质，例如，稀释剂、溶剂(包括水、甘油、乙醇)、增溶剂、酸化剂、增稠剂、甜味剂、增味剂、着色剂、润滑剂、表面活性剂、防腐剂、ph稳定缓冲剂及其混合物。
[0082]
除了本发明的细菌菌株，并且如果存在的话，除了所述的至少一种浆果的至少一种提取物之外，有利地，本发明的组合物(a)和(b)可以进一步包含至少一种另外的组分(具有炎症或炎症相关靶活性的组分)，其选自包含或由以下组成的组：氨基酸、a、b、c、d、e、k族的维生素、镁、锌和硒有机和/或无机盐、免疫刺激物质、褪黑素、缬草、西番莲、蜜蜂花、山楂、甘菊、啤酒花、抗氧化剂、抗自由基剂、益生元物质(例如，低聚果糖(fos)、低聚半乳糖(gos)、菊粉、瓜尔豆胶、糖胺聚糖(例如，透明质酸、硫酸软骨素)、胶原蛋白、作用于血清素能途径的物质(例如大麻素)、植物提取物、酶及其组合。
[0083]
根据本说明书中描述的各种实施方式，本发明的组合物(a)和(b)可以是固体形式，如片剂、咀嚼片、溶解在口中的片剂或口溶片剂，胶囊、锭剂、颗粒、薄片或粉末(颗粒或粉末溶解在液体或口溶性颗粒中)；半固体形式，如软凝胶、乳膏；或液体形式，如溶液、悬浮液、分散体、乳液或糖浆。
[0084]
根据本说明书中描述的各种实施方式，本发明的组合物(a)和(b)可以配制用于口服(或胃肠)、舌下(或颊面)、经粘膜、经皮和/或局部使用或施用，如直肠、皮肤、阴道；它们优选配制成口服使用。
[0085]
根据本说明书中描述的各种实施方式，本发明的组合物(a)和(b)可以是药物组合物(live biotherapeutic products，lbp)、医疗器械组合物、膳食补充剂或食品或用于特殊医学用途的食品(fsmp)或新型食品或益生菌产品的组合物，和/或化妆品组合物。
[0086]
在本发明的上下文中，表述“医疗器械”的含义根据日期为1997年2月24日的意大利第46号法令或根据新的医疗器械法规(eu)2017/745(mdr)使用。
[0087]
根据本说明书中描述的各种实施方式，形成本发明的另一个目的是作为药物使用的本发明的组合物(a)和(b)。
[0088]
本发明的组合物(a)和(b)还可以用作药物，其作为其他治疗方法(优选药理学、食品或社会行为类型)的佐剂。
[0089]
在一个实施方式中，根据本说明书中描述的各种实施方式，本发明的组合物(a)和(b)作为有需要的受试者的免疫调节剂和/或免疫刺激剂使用。
[0090]
在本发明的上下文中，术语“免疫调节剂和/或免疫刺激剂”用于表示能够改变免疫系统活性，优选能够增加和增强免疫系统活性的试剂和/或物质(例如，通过调节和/或刺激合适的促炎和/或抗炎细胞因子)。
[0091]
有利地，本发明的组合物(a)和组合物(b)能够减少促炎细胞因子、优选il12和/或tnf-α的产生，和/或增加抗炎细胞因子、优选il10的产生。特别是，本发明的组合物(a)和组合物(b)能够在存在炎性刺激的情况下产生大于1的il12:il10比率。
[0092]
基于以上描述，本发明的组合物(a)和组合物(b)可以在预防性和/或治愈性治疗疾病或症状和/或病症的方法中使用，所述疾病或症状和/或病症由促炎细胞因子的增加和/或抗炎细胞因子的减少引起或与其相关/伴随，优选地是影响以下的疾病：运动系统(肌肉和骨骼系统)、消化系统、泌尿生殖系统(泌尿系统和生殖系统)、呼吸系统、外皮系统、免疫系统和/或循环系统。
[0093]
特别是，本发明的组合物(a)和组合物(b)在预防性和/或治愈性治疗与免疫系统改变相关的疾病，特别是自身免疫疾病和过敏、免疫缺陷疾病、影响皮肤的疾病如痤疮和/或特应性皮炎中具有有效应用。
[0094]
根据本说明书中描述的各种实施方式，在一个实施方式中，本发明的组合物(a)和组合物(b)用作有需要的受试者中的抗炎剂。
[0095]
根据本说明书中描述的各种实施方式，在一个实施方式中，本发明的组合物(a)和组合物(b)用于预防性和/或治愈性治疗有需要的受试者中的炎性胃肠道疾病、病症和/或症状的方法中，如幽门螺杆菌、消化性溃疡或胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性炎性肠病(ibd)如克罗恩病和溃疡性结肠炎、显微镜下结肠炎、憩室病和憩室炎。
[0096]
根据本说明书中描述的各种实施方式，在一个实施方式中，本发明的组合物(a)和组合物(b)用于预防性和/或治愈性治疗炎性肌肉骨骼炎性疾病、风湿病、炎性关节和/或手术后炎性疾病的方法中，优选用于治疗骨关节炎、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎、特别是一般的膝关节骨关节炎和关节骨关节炎的方法中。
[0097]
根据本说明书中描述的各种实施方式，在一个实施方式中，本发明的组合物(a)和组合物(b)用于预防性和/或治愈性治疗功能性胃肠疾病(fgid)的方法中，如肠易激综合征(ibs)(腹泻型ibs、便秘型ibs、便秘和腹泻交替型ibs、未分类的ibs)、消化不良、胃灼热、食道、胃和十二指肠病症、sibo(小肠细菌过度生长)、具有亚炎症状态的疾病(例如在老年人中、在憩室病中)。
[0098]
形成本发明的一个目的是通过向受试者施用治疗有效量的根据本说明书中描述的各种实施方式的本发明的组合物(a)或组合物(b)用于抗炎或免疫调节和/或免疫刺激治疗本发明中定义的疾病和/或病症的方法。
[0099]
在本发明的上下文中，表述“受试者”用于表示人类受试者或动物受试者(例如宠物，如狗或猫或其他哺乳动物)。优选地，本发明的组合物用于人类受试者的治疗方法。
[0100]
为了清楚起见，为了实现本发明的目的，本发明的混合物(a)或混合物(b)的组分(或活性组分)如本发明中的细菌菌株和浆果提取物也可以分开施用(优选在30分钟到60分钟的时间间隔内)并且以任何顺序施用，但是优选地，各种菌株或菌株和提取物同时施用于
受试者，甚至更优选以单一组合物施用，以获得更快速的效果并易于施用。当本发明的混合物(a)或(b)的组分(或活性组分)如本发明中的细菌菌株和浆果提取物以单一组合物施用时，所述单一组合物对应于本发明的组合物(a)或(b)。
[0101]
形成本发明的一个目的是一种制备所述的至少一种浆果的提取物的方法(简称本发明的提取方法)，所述提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成(如本发明的上下文中所定义)，其包括以下步骤：
[0102]-步骤1：用水提取至少一种浆果，优选粉末形式的浆果(或干浆果)，其包括以下步骤：
[0103]
步骤1.1：将至少一种浆果或多种浆果的混合物悬浮在水中以在水中分散，
[0104]
步骤1.2：混合步骤1.1的所述分散体以获得步骤1.2的混合物，
[0105]
可选步骤1.3：对步骤1.2的所述混合物进行超声处理以获得步骤1.3的超声处理混合物，
[0106]
步骤1.4：将步骤1.2的所述混合物或步骤1.3的所述超声处理的混合物离心以获得包含步骤1的水性上清液(称为水相)和步骤1的固体残余物的混合物；接下来
[0107]-步骤2(例如在分离步骤1的所述水相和所述固体残余物之后)：用醇溶剂，优选甲醇提取步骤1的固体残余物，其包括以下步骤：
[0108]
步骤2.1：将步骤1的固体残余物悬浮在醇溶剂、优选甲醇中，以获得醇溶剂中的分散体，
[0109]
步骤2.2：混合步骤2.1的所述分散体以获得步骤2.2的混合物，
[0110]
可选步骤2.3：对步骤2.2的所述混合物进行超声处理以获得步骤2.3的超声处理混合物，
[0111]
步骤2.4：将步骤2.2的所述混合物或步骤2.3的所述超声处理的混合物离心以获得包含步骤2的醇性上清液(称为醇相)和步骤2的固体残余物的混合物；接下来
[0112]-步骤3：将步骤1的水相装载到反相固相上并提取，通过用酸性水溶液(例如0.01m hcl)洗脱，以获得步骤3的含有糖和有机酸的洗脱液和步骤3的固相，如步骤3提取后残留的反相固相；弃去步骤3的洗脱液；接下来
[0113]-步骤4：用醇溶剂提取步骤3的固相，优选甲醇的酸性水溶液(例如含有0.1％hcl的甲醇)，以获得步骤4的含有多酚成分的洗脱液和步骤4的固相，如步骤4提取后残留的反相固相；接下来
[0114]-步骤5：用酮溶剂(酮)、优选丙酮提取步骤4的固相，以获得步骤5的含有多酚成分(优选浆果纤维中所含的原花色素和/或多酚)的洗脱液；接下来
[0115]-步骤6：将步骤4的洗脱液和步骤5的洗脱液合并并除去溶剂(例如通过真空蒸发)，以获得根据本发明的包含多酚成分的至少一种浆果的提取物(例如干提取物)(本发明的提取物)。
[0116]
在步骤6之后，根据本发明的提取方法可以进一步包括步骤7，通过定性/定量分析方法、优选通过folin-ciocalteu测定或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法测定本发明的提取物(例如干提取物)的多酚含量。
[0117]
有利地，步骤1和步骤2的提取在遮光的容器中进行，例如深色试管。
[0118]
使用本发明定义的浆果，优选蔓越橘和/或蓝莓，进行将至少一种浆果或多种浆果
的混合物悬浮在水中的步骤1.1。
[0119]
混合步骤(步骤1.1和2.1)优选在室温下用涡旋仪器进行1分钟至10或30分钟，优选1分钟至5分钟的时间。在本发明中，表述室温用于表示包括在10℃或15℃至25℃的范围内的温度，优选20℃。
[0120]
超声处理步骤(步骤1.2和2.2)优选在室温下进行5分钟至30或60分钟，优选10分钟至20分钟的时间。
[0121]
离心步骤(步骤1.3和2.3)优选在室温下以2000-4000转、优选3000转进行1分钟至30或60分钟，优选5分钟至15分钟的时间。对混合物进行超声处理的目的是增强浆果(或浆果粉)的更大分解并允许更大程度地提取其中存在的多酚组分。
[0122]
加载到反相固相上的步骤3优选使用反相spe柱(spe：固相提取)进行，例如spepolymeric reversed phase柱，它是反相功能化聚合物吸收剂，在具有激进性有机相的洗涤条件下，提供中性、酸性或碱性化合物的强保留。
[0123]
除去溶剂的步骤(步骤6)优选通过真空蒸发，例如通过旋转蒸发仪，在30℃至50℃或60℃的温度范围内、优选40℃进行。
[0124]
采用本发明的提取工艺提取浆果，除去水溶性部分(主要含糖类和有机酸)，并且提取和合并甲醇可溶部分(主要含多酚)和丙酮可溶部分(含有包含在浆果纤维中的例如原花色素和花色素苷和/或花色素等多酚)。
[0125]
形成本发明的一个目的是包含或由所述浆果的多酚成分组成的所述至少一种浆果的提取物(本发明的提取物)可通过如上定义的本发明的提取方法获得(步骤1至6或步骤1至7)。至少一种浆果(例如，蔓越橘、蓝莓、草莓或接骨木莓)的所述提取物包含或由多酚组成，所述多酚占提取物总重量的50％至95％的重量百分比(例如，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或98％)；优选70％至97％；更优选80％或85％至95％。
[0126]
形成本发明的一个目的是一种组合物(b)(本发明的组合物(b))，其包含混合物(b)(本发明的混合物(b))，所述混合物(b)包含或由以下组成：
[0127]-至少一种选自本发明所定义的组(i)或(i.i)的细菌菌株或细菌菌株的混合物，和
[0128]-包含或由所述浆果的多酚成分组成的所述至少一种浆果的至少一种提取物(本发明的提取物)，其可通过如上定义的本发明的提取方法获得(步骤1至6或步骤1至7)；并且其中，可选地，所述组合物(b)包含至少一种食品或药学级添加剂和/或赋形剂。
[0129]
除非另有说明，否则表述包含其量“占x至y”的组分的组合物或混合物或提取物层用于指所述组分可以以所述范围内存在的所有量存在于该组合物或混合物或提取物等中存在(即使未指定)，该范围的极端值也包括在内。
[0130]
表述“治疗有效量”是指在组织、系统、哺乳动物或人类中引起生物或药物响应的组合物、混合物和/或细菌菌株的量，其由个人、研究人员、兽医、医师或其他临床医生或卫生工作者寻求和定义。
[0131]
在本发明的上下文中，术语“新型食品”的含义根据日期为2015年11月25日的欧盟法规2015/2283使用。
[0132]
本发明的第一组实施方式(fra n
°
)报告如下。
[0133]
fra1.一种包含混合物b的组合物b，混合物b包含或由以下组成：
occidentalis)、黑醋栗(ribes nigrum)、红醋栗(ribes rubrum)、黑桑(morus nigra)、红桑(morus rubra)、白桑(morus alba)、欧亚山茱萸(cornus mas)、鹅莓(ribes uva-crispa)、欧洲小檗(berberis vulgaris)、卵圆唐棣(amelanchier ovalis)、桤叶唐棣(amelanchier canadensis)、马哈利樱桃(prunus mahaleb)、酸樱桃或黑樱桃(prunus cerasus)、草莓树(arbutus unedo)；蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)、红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vaccinium macrocarpon)、野生草莓或草莓(fragaria vesca或fragaria spp.或fragaria ananassa)、接骨木莓(sambucus nigra)以及它们的混合物。
[0152]
fra5.如前述fra中任一项所述的组合物b，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蓝莓或欧洲蓝莓(vaccinium cyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)、红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vacciniummacrocarpon)、野生草莓或草莓(fragaria vesca或fragaria spp.或fragaria ananassa)、接骨木莓(sambucus nigra)以及它们的混合物；优选地，其中，所述至少一种浆果选自包含或由以下组成的组：蓝莓、蔓越橘以及它们的混合物。
[0153]
fra6.如前述fra中任一项所述的组合物b，其中至少一种浆果的所述提取物的所述多酚成分包含原花色素和/或花色素苷和/或花色素。
[0154]
fra7.如前述fra中任一项所述的组合物b，其中，所述至少一种细菌菌株包含两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
dsm 26760或由它们组成。
[0155]
fra8.如前述fra中任一项所述的组合物b，其中，所述至少一种细菌菌株包含两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和副干酪乳杆菌cncm i-1572或由它们组成。
[0156]
fra9.如前述fra中任一项所述的组合物b，其中，所述至少一种细菌菌株包含两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708以及副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
dsm 26760或副干酪乳杆菌cncm i-1572或由它们组成，并且其中，包含或由所述浆果的多酚成分组成的所述至少一种浆果的至少一种提取物是蓝莓或欧洲蓝莓(vacciniumcyanococcus或vaccinium myrtillus或vaccinium angustifolium)或者红莓苔子或蔓越橘(vaccinium oxycoccos或vaccinium macrocarpon)的提取物，该提取物包含或由所述浆果的多酚成分组成。
[0157]
fra10.作为药物使用的前述fra1至9中任一项所述的组合物b。
[0158]
fra11.作为免疫调节剂和/或免疫刺激剂使用的fra1至9中任一项所述的组合物b，所述免疫调节剂和/或免疫刺激剂能够减少促炎细胞因子产生和/或增加抗炎细胞因子产生；
[0159]
优选地，其中，所述组合物作为能够减少il12和/或tnf-α细胞因子产生和/或增加il10细胞因子产生的免疫调节剂和/或免疫刺激剂使用。
[0160]
fra12.如fra10或fra11所述使用的组合物b，其中，所述组合物用作抗炎剂。
[0161]
fra13.如fra12所述使用的组合物b，其中，所述组合物用于预防性和/或治愈性治疗选自包含或由以下组成的组的炎症性胃肠道疾病、病症和/或症状的方法中：幽门螺杆菌、消化性溃疡或胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、显微镜下结肠炎、憩室病和憩室炎。
[0162]
fra14.在预防性和/或治愈性治疗肌肉骨骼炎性疾病、风湿病、炎性关节疾病和/或手术后炎性疾病的方法中使用的fra1至9中任一项所述的组合物。
[0163]
fra15.如fra14所述使用的组合物b，其中，所述组合物在预防性和/或治愈性治疗骨关节炎、类风湿性关节炎和/或强直性脊柱炎、优选关节的骨关节炎和/或膝关节的骨关节炎的方法中使用。
[0164]
本发明的第二组实施方式(frb n
°
)报告如下。
[0165]
frb1.一种包含混合物a的组合物a，混合物a包含或由以下组成：
[0166]-被鉴定为两歧双歧杆菌mimbb23sg的细菌菌株，其保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 32708，和
[0167]
至少一种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：
[0168]-被鉴定为副干酪乳杆菌的细菌菌株，由索法尔公司保藏在巴黎巴斯德研究所的国家微生物保藏中心，登录号为cncm i-1572，
[0169]-被鉴定为副干酪乳杆菌lpc-s01的细菌菌株，保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 26760，
[0170]-被鉴定为副干酪乳杆菌cf3的细菌菌株，保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 32353，
[0171]-被鉴定为鼠李糖乳杆菌gg的细菌菌株，保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，登录号为dsm 53103，
[0172]-被鉴定为动物双歧杆菌乳亚种bb12的细菌菌株，保藏在德国微生物保藏中心(dsmz)，保藏号为dsm 15954，以及它们的混合物；
[0173]
并且其中，任选地，所述组合物包含至少一种食品级或药学上的添加剂和/或赋形剂。
[0174]
frb2.如frb1所述的组合物a，其中，混合物a包含或由以下组成：两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm 26760。
[0175]
frb3.如frb1或frb2所述的组合物a，其中，混合物a包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708、细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01dsm 26760和至少一种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：副干酪乳杆菌cncm i-1572、副干酪乳杆菌cf3 dsm 32353、鼠李糖乳杆菌gg dsm 53103、动物双歧杆菌乳亚种bb12 dsm 15954以及它们的混合物。
[0176]
frb4.如frb1所述的组合物a，其中，所述混合物包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和细菌菌株副干酪乳杆菌cncm i-1572。
[0177]
frb5.如frb4所述的组合物，其中，所述混合物包含或由以下组成：细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708、细菌菌株副干酪乳杆菌cncm i-1572和至少一种选自包含或由以下组成的组的细菌菌株：副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm26760、副干酪乳杆菌cf3 dsm 32353、鼠李糖乳杆菌gg dsm 53103、动物双歧杆菌乳亚种bb12 dsm 15954以及它们的混合物。
[0178]
frb6.如前述frb中任一项所述的组合物a，其中，所述混合物包含或由细菌菌株两歧双歧杆菌mimbb23sg dsm 32708和细菌菌株副干酪乳杆菌lpc-s01 dsm26760和细菌菌株副干酪乳杆菌cncm i-1572组成。
[0179]
frb7.作为药物使用的frb1至6中任一项所述的组合物a。
[0180]
frb8.作为免疫调节剂和/或免疫刺激剂使用的fra1至6中任一项所述的组合物a，所述免疫调节剂和/或免疫刺激剂能够减少促炎细胞因子产生和/或增加抗炎细胞因子产生；
[0181]
优选地，其中，所述组合物作为能够减少il12和/或tnf-α细胞因子产生和/或增加il10细胞因子产生的免疫调节剂和/或免疫刺激剂使用。
[0182]
frb9.如fra7或fra8所述使用的组合物a，其中，所述组合物用作抗炎剂。
[0183]
fra10.如fra9所述使用的组合物a，其中，所述组合物用于预防性和/或治愈性治疗选自包含或由以下组成的组的炎症性胃肠道疾病、病症和/或症状的方法中：幽门螺杆菌、消化性溃疡或胃溃疡、十二指肠溃疡、慢性炎性肠病(ibd)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、显微镜下结肠炎、憩室病和憩室炎。
[0184]
frb11.在预防性和/或治愈性治疗肌肉骨骼炎性疾病、风湿病、炎性关节疾病和/或手术后炎性疾病的方法中使用的fra1至6中任一项所述的组合物a。
[0185]
fra12.如fra11所述使用的组合物a，其中，所述组合物在预防性和/或治愈性治疗骨关节炎、类风湿性关节炎和/或强直性脊柱炎、优选关节的骨关节炎和/或膝关节的骨关节炎的方法中使用。
[0186]
表1举例显示了干蓝莓(粉末)提取物和新鲜蓝莓提取物的花色素苷/花色素含量。缩写：dp-飞燕草素，cyclidine，pt-矮牵牛素，pn-芍药色素，mv-锦葵色素，pg-天竺葵素，gal-半乳糖苷，glc-葡萄糖苷，ara
–
阿拉伯糖苷。
[0187]
表1
[0188]
峰号花青素干蓝莓(粉末)[g/kg
±
s]新鲜蓝莓[g/kg
±
s]1dp-3-gal0.09
±
0.0112.95
±
0.862dp-戊糖-己糖n.q.-3dp-3-glc0.45
±
0.059.11
±
0.434cy-3-gal0.04
±
0.018.69
±
0.315dp-3-ara0.18
±
0.026.73
±
0.396cy-3-glc0.34
±
0.0312.92
±
0.277pt-3-gal0.07
±
0.015.44
±
0.398cy-3-ara0.11
±
0.016.00
±
0.279pt-3-glc0.45
±
0.057.50
±
0.8710pn-3-galn.q.n.q.11pt-3-ara0.21
±
0.025.32
±
0.4212pn-3-glc0.08
±
0.017.75
±
0.2913mv-3-gal0.11
±
0.016.75
±
1.2214mv-3-glc0.84
±
0.106.35
±
0.3615mv-3-ara0.64
±
0.135.80
±
0.5916pn-pentn.q.-17mv-pentn.q.-[0189]
n.q.＝未量化
[0190]
实验部分
[0191]
本发明的组合物(a)和(b)的免疫调节能力使用从小鼠骨髓分离的树突细胞模型，即骨髓衍生的树突细胞(简称bmdc)进行测试。
[0192]
材料
[0193]
(i)细菌菌株：
[0194]-副干酪乳杆菌(cncm i-1572)，简称dg；
[0195]-副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(dsm 26760)，简称lpc-s01
tm
；
[0196]-副干酪乳杆菌cf3(dsm 32353)，简称cf3；
[0197]-鼠李糖乳杆菌gg(dsm 53103)，简称gg；
[0198]-两歧双歧杆菌mimbb23sg(dsm 32708)，简称23sg；
[0199]-动物双歧杆菌乳亚种bb12(dsm 15954)，简称bb12；
[0200]
如在本发明中所定义；
[0201]
(ii)作为本发明提取方法的起始原料的浆果：
[0202]
‑“
野生蓝莓粉，3％多酚”(简称，3％pp)：由naturex生产，产品代码ok705055，植物物种欧洲越橘或狭叶越橘。定性分析(通过hplc)：多酚含量》3％(3％至5％或10％或20％或30％或40％或50％)(面积/曲线下hplc面积％或重量/重量％)，干燥损失《5.00％，粒径：》95％通过30目筛(600μm)且》95％通过100目筛(150μm)，堆积密度0.30-0.60g/ml；
[0203]
‑“
野生蓝莓粉，50％纤维”(简称，50％fb)：由naturex生产，产品代码ok705001，植物物种欧洲越橘或狭叶越橘。定性分析(通过hplc)：多酚含量》3％(3％至4％或5％或6％或8％或10％，重量/重量％，纤维含量》50％，干燥损失《5.00％，粒径：》60％通过60目筛(250μm)，堆积密度0.30-0.60g/ml；
[0204]
‑“
草莓粉100％果实”：由naturex生产，产品代码on200003，植物物种fragaria spp.。定性分析(by means of tlc)：干燥损失《3.00％，粒径：100％通过1.4mm；
[0205]
‑“
蔓越橘1％原花色素”(简称，1％pa)：由naturex生产，产品代码蔓越橘pe 1％原花色素(ref.eh711552)，粉末，植物物种大果越橘(ainton)。定性分析：通过hplc方法(cq-mo-467)评估的原花色素含量(以氯化矢车菊素计，ph eur方法1200)》1％(值1.92％)，粒径：》90％通过300目筛(筛(cq-mo-018)，干燥损失《6.00％(ir平衡(cq-mo-018)(值1.06％)，(振实密度)0.4-0.8g/ml(密度计，cq-mo-257)，ph(溶液1％)3-6(ph计cq-mo-123)；
[0206]
‑‑“
蔓越橘1％原花色素”(简称，1％pa)：由naturex生产，产品代码90s-06155(ref.ek036155)，粉末，植物物种蔓越橘红(ainton)。定性分析：原花色素含量(pac)》1.0％(由cq-mo-203减去的方法cq-mo-232)(值1.95％重量/重量)，粒径：100％通过30目筛和》95％通过100目筛(筛分分析(la-03-002-00)，水分《5.00％(ir平衡(cq-mo-018)，堆积密度0.5-0.6g/ml且振实密度0.6-0.8g/ml(密度计，cq-mo-257)，ph(溶液1％)3-6(ph计(cq-mo-123)；
[0207]
‑“
蔓越橘1.5％原花色素”：由naturex生产，产品代码eu-sp_06104(ref.gk006104)，粉末，植物物种大果越橘(ainton)，通过hplc方法(由cq-mo-582减去的cq-mo-583)评估的原花色素含量》1.5％(值2.97％)(面积/曲线下hplc面积％或重量/重量％)，干燥损失《6.00％(ir平衡(cq-mo-018)，振实密度0.5-0.7g/ml(密度计，cq-mo-257)，粒径：100％通过80目筛，ph(1％溶液)2.6-3.9(ph计)；
[0208]
‑“
蔓越橘15％原花色素”(简称，15％pa)：由nutra生产，产品代码uro-std-pur，粉末，植物物种大果越橘(ainton)，原花色素含量15.9％(bl-dmac)(重量/重量％)，干燥损失3.3％，粒径：100％通过80目筛；
[0209]
‑“
接骨木莓干果喷雾”：由iprona生产，产品代码70120053，粉末，植物物种西洋接骨木，花青素苷含量以cya-3-glu表示(在ph 1.0的缓冲液中的光谱)88.5g/kg，多酚含量表示为儿茶素(folin ciocalteu)109.0g/kg。
[0210]
1g粉末中的多酚含量(mg)：
[0211]-蓝莓3％pp：74mg/g；
[0212]-蓝莓50％纤维：51mg/g；
[0213]-草莓：115.5mg/g；
[0214]-蔓越橘1％pa：31.7mg/g；
[0215]-蔓越橘15％pa：158mg/g；
[0216]-接骨木莓：122mg/g。
[0217]
方法
[0218]
(iii)细菌菌种、制备和生长条件：
[0219]
用于该试验的所有乳酸杆菌菌株均在de man-rogosa-sharpe(mrs)培养基(difco laboratories inc.，detroit，mi，美国)中培养。双歧杆菌菌株在补充有0.05％l-半胱氨酸盐酸盐(sigma-aldrich)的mrs(cmrs)中培养。由冷冻的甘油菌株接种细菌，并使用1:100的接种物在mrs或cmrs中传代培养两次；乳酸杆菌菌株在37℃温育，而双歧杆菌在37℃在厌氧条件下温育(naerocult a system；merck，darmstadt，germany)。收获过夜培养物中的细菌细胞，并使用无菌pbs洗涤两次(对于双歧杆菌菌株，使用预还原的cpbs)。此后，将使用neubauer改进的计数室的总计数与使用accuri c6流式细胞仪(bd biosciences，milan，意大利)对碘化丙啶细胞染色进行的细菌悬浮液的活细胞数进行比较。根据活体计数，将每种细菌菌株以已知浓度重悬浮在添加有无菌甘油(1:6v/v)的预还原cpbs中，并以等分试样的在-80℃储存。在-80℃储存一周后，通过在mrs或cmrs琼脂上稀释和铺板来控制细菌细胞的活力-每个菌株的等分试样。
[0220]
(iv)从浆果中提取多酚成分
[0221]
如本发明的提取方法中所述，浆果提取方法根据进行部分修改的wrolstad所述方法进行(wrolstad等，handbook of analytical chemistry:pigments,colorants,flavour,texture and bioactive food components，第2卷.wiley，new jersey，第473
–
475页，2005)。
[0222]
特别是，将500毫克(mg)粉状浆果，诸如蓝莓、蔓越橘、草莓或接骨木莓，分散在40ml去离子水中(步骤1)(深色试管避光)，在20℃通过涡旋混合3分钟。然后，将浆果的水分散体在20℃超声处理15分钟，随后，将超声处理的混合物在20℃以3000rpm的转速离心10分钟，从而提供包含水性上清液(步骤1的水相)和固体残余物(步骤1的固体残余物)的混合物。回收水性上清液(步骤1的水相)并使用10ml甲醇对固体残留物(步骤1的固体残留物)进行第二次提取(步骤2；提取方法类似于步骤1所述的提取方法)并提供醇性上清液(步骤2的醇相)和固体残留物(步骤1的固体残留物)。
[0223]
步骤1的水性上清液和步骤2的醇性上清液中所含组分的分离通过使用固相提取
(spe)柱的提取来进行。具体而言，将步骤1的6ml体积的水性上清液装入spe柱(聚合反相，200mg/6ml)，并使用0.01n hcl(5ml)作为流动相洗脱含有糖和有机酸的水溶性相(步骤3)；弃去步骤3中含有糖和有机酸的洗脱液。然后，将步骤2的醇性上清液(10ml)加载到所述spe柱上，并使用含有0.1％hcl(5ml)的甲醇作为流动相洗脱多酚成分(步骤4)。最后，使用丙酮洗脱spe柱(步骤5)以提取和回收洗脱级分中浆果纤维中存在的原花色素和多酚。
[0224]
将根据步骤4洗脱的级分和根据步骤5使用丙酮洗脱的级分合并并通过旋转蒸发仪在40℃蒸发以获得包含根据本发明的多酚成分的浆果提取物(简称本发明的提取物)。
[0225]
将所得本发明的提取物溶解在用hcl酸化的甲醇(0.05mm)中，并通过folin-ciocalteu测定法分析所得溶液的总多酚含量。
[0226]
通过本发明的提取方法从上述浆果中提取的总多酚的重量百分比(相对于提取物的总重量)高于90％(90％至91％或92％或93％或94％或95％或96％或97％或98％或99％；分析通过folin ciocalteu方法进行。
[0227]
1ml提取物中以mg计的多酚含量(使用没食子酸标准品获得的校准曲线将结果表示为没食子酸当量(gae))：
[0228]-蓝莓3％pp：36.93mg/ml；
[0229]-蓝莓50％纤维：25.54mg/ml；
[0230]-草莓：57.80mg/ml；
[0231]-蔓越橘1％pa：15.85mg/ml；
[0232]-蔓越橘15％pa：78.99mg/ml；
[0233]-接骨木莓：60.59mg/ml。
[0234]
使用不同种类的浆果(诸如蓝莓、蔓越橘、草莓和接骨木莓)获得的提取物在-20℃储存，直至用于树突状细胞的免疫调节实验。
[0235]
在用骨髓源性树突状细胞(bmdc)进行体外实验当天，基于使用上述报道的folin-ciocalteu测定法进行的总多酚含量的定量，将提取物以50μg/ml的最终使用浓度溶解在rpmi培养基(树突状细胞生长培养基)中。
[0236]
(v)folin-ciocalteu测定——本发明提取物的多酚成分的分析。
[0237]
使用液相色谱系统进行分析，该系统由配备有2998型(waters)光电二极管阵列检测器的alliance 2695型(water，milford，ma，美国)组成。通过c18kinetex柱(150
×
4.6mm，2.6μm，fenomenex)在45℃以1.7ml/min的最小流速进行分离。洗脱液是(a)1％h3po4和(b)乙腈/水(35:65,v/v)。洗脱梯度是线性的，如下所示：0-15min，14％b；15-25分钟，14％至20％b；25-35分钟，20％至32％b；35-45分钟，32％至50％b；45-48min，50％至90％b；90％持续3分钟。从200至700nm采集色谱数据，并在520nm(acn)和320nm(phe)处积分。对于cy-、dp-、pt-、pe-和mv-3-o-glc、cy-和pt-3-o-gal和pt-3-o-ara和绿原酸，获得2至50μg/ml的校准曲线。使用用0.1％tfa酸化的甲醇从储备溶液中稀释工作溶液。每个测试重复两次进行。如del bo'等(del bo’c等，j agric food chem.2010年2月24日；58(4):2491-7)先前所述，通过lc联合的电喷雾质谱(esi-ms)证实了各个acn的鉴定。简而言之，质谱仪在200da-800da范围内以正全扫描模式运行。毛细管电压设置为3.5kv，锥电压设置为20v，初始温度设置为130℃，去溶剂化温度设置为350℃。数据从masslinx 4.0软件(micromass,beverly,ma,美
国)获得。
[0238]
(vi)骨髓源性树突状细胞(bmdc)的生成
[0239]
通过分离从6-12周龄的c57bl/6小鼠的胫骨和股骨骨髓中收集的单核细胞获得bmdc(骨髓源性树突状细胞)。移除胫骨和股骨后，用etoh处理2分钟，随后用无菌pbs处理2分钟。通过用含有无菌pbs的注射器洗涤胫骨和股骨获得单核细胞。
[0240]
将回收的细胞在4℃以1200rpm离心10分钟。去除上清液并再次用pbs洗涤细胞沉淀物并在相同条件下离心。随后将细胞沉淀重悬于10ml rpmi 1640培养基(rpmi 1640：rosewell park memorial institute 1640培养基)中，该培养基含有l-谷氨酰胺(4mm)、10％v/v热灭活fbs(胎牛血清)、青霉素(100u/ml)、链霉素(100mg/ml)、50mm 2-巯基乙醇，并添加终浓度为15ng/ml gmcsf(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)。
[0241]
使用计数室(fuchs-rosenthal)对细胞进行计数使浓度达到3.5
×
105个细胞/ml，分装在培养皿中(每个含有10ml细胞悬液)并在15ng/ml粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gmcsf)的存在下进行分化，持续87天。在分化的第三天和第五天，用新鲜培养基替换具有gmcsf的培养基。在第8天，从每个培养皿中回收细胞，离心并以2
×
106个细胞/ml的浓度重悬于不含gmcsf的完全rpmi培养基中。
[0242]
(vii)用本发明的组合物(a)或(b)刺激树突细胞
[0243]
树突状细胞(1
×
106个bmdc)被放置来与以下接触：
[0244]
(a)第(i)段所列的各个细菌菌株(图1a、1b、1c)；
[0245]
(b)第(i)段所列的至少2种细菌菌株的混合物(根据本发明的组合物(a)：dg lpc-s01
tm
，dg mimbb23sg，lpc-s01
tm
mimbb23sg，moi，总最终moi为5)(图2a、2b、2c)；
[0246]
(c)选自第(i)段所列菌株的细菌菌株和选自第(ii)段所列浆果种类的浆果种类的提取物的混合物，其中，提取是根据本发明的提取方法以获得包含多酚成分的提取物(根据本发明的组合物(b))(图3)；
[0247]
(d)至少2种选自第(i)段所列菌株的细菌菌株和选自第(ii)段所列浆果种类的浆果种类的提取物的混合物，其中，提取是根据本发明的提取方法以获得包含多酚成分的提取物(根据本发明的组合物(b))(图4)。
[0248]
使用来自大肠杆菌的脂多糖(lps)以1μg/ml的用量在不存在和存在促炎刺激物的情况下刺激细胞。
[0249]
通过在37℃和5％co2下温育20小时来进行用如上定义的(a)、(b)、(c)、(d)和lps对bmdc的刺激。随后，在不去除孔底部存在的细胞的情况下收集上清液，并使用elisa免疫酶测定法评估il12、tnf-α和il10促炎和抗炎细胞因子的产生。
[0250]
特别是，评估了以下细胞因子：
[0251]-tnf-α(肿瘤坏死因子-α)促炎细胞因子；
[0252]-il-10(白介素-10)抗炎细胞因子；和
[0253]-il-12(白介素-12)，负责激活适应性免疫的刺激性细胞因子。
[0254]
每个实验包括一个对照条件(即仅用rpmi培养基刺激的bmdc)、一个存在metoh-hcl的对照(对应于每个测试提取物中存在的相同量，并且相对于每个孔中细胞悬浮液的体积总是低于0.1％v/v)和lps metoh-hcl。
[0255]
所有菌株均在不存在和存在metoh-hcl、不存在和存在lps的情况下进行测试。
[0256]
所述测定在96孔多孔板中进行，其底部经过预处理并涂有50μl重新悬浮在pbs中对每种目标细胞因子特异的捕获抗体(处理在4℃持续过夜)。然后用含有8g/l nacl、1.44g/l na2hpo4、0.24g/l kh2po4、0.05％tween20、ph 7.4的缓冲液洗涤板，并用250μl pbs 1％牛血清白蛋白(bsa)溶液在室温下封闭1小时。然后，洗涤板并添加对应于测试的各种样品的上清液。将上清液稀释在由pbs 1％bsa组成的溶液中，对于il12以1:2的比例、对于il10以1:10的比例、对于tnf-α以1:100的比例进行稀释，孔中的最终体积为50μl。每种细胞因子标准溶液的8个1:2稀释液以技术性二等分样形式添加到每个板中，用于构建上清液中蛋白质定量所需的校准线。在室温下温育2小时后，洗涤板并用50μl与生物素缀合的二抗在室温下再悬浮2小时。洗涤板后，每孔50μl的最终体积中加入在检测溶液中稀释的缀合的曲霉亲和素-辣根过氧化物酶。将板温育20分钟。洗涤后，将板用蒸馏水进一步洗涤，并与重悬于特定溶液中的四甲基联苯胺(过氧化物酶活性检测器，tmb)一起温育，并在室温下再温育20分钟，以根据酶活性进行比色反应。其后，向每个孔中加入100μl h3po
4 2m溶液以阻断反应，并使用分光光度计在450/630nm处读取吸光度。将每个样品的颜色强度与标准曲线进行比较，根据使用的稀释度给出光密度(od)和浓度方面的定量结果。
[0257]
在初步步骤中，进行了实验以评估用于与bmdc接触的提取物的适当量，目的是排除用于获得包含多酚成分的浆果提取物的溶剂(metoh-0.05mm hcl)对树突状细胞的潜在影响。在这些初步测试之后，决定使用50μg/ml的含有多酚成分的浆果提取物含量，对应于与树突细胞接触的metoh-hcl的量低于0.1％(v/v)。
[0258]
对于细菌菌株，进行了初步评估以确定与bmdc接触时使用的量。
[0259]
基于这些测试，决定在相对于的bmdc数量的moi(感染复数)等于5下测试细菌菌株，对应于5
×
106个细菌细胞总量。
[0260]
当在没有提取物的情况下使用时，细菌菌株中加入的metoh-hcl的量对应于50μg/ml每种测试提取物中存在的量，以便能够将潜在的更大/协同作用归因于浆果中生物活性组分的存在，而不是metoh-hcl的存在。
[0261]
同样在与lps的共温育实验中，在metoh-hcl的存在下总是包含对照。
[0262]
所有实验均以技术二等分样和生物学二等分样进行。
[0263]
(viii)统计分析
[0264]
使用graphpad prism 5软件程序进行统计计算。通过具有双尾分布的非配对异方差学生t检验分析结果的含义。p《0.05的差异被认为是显著的。
[0265]
结果
[0266]
(ix)本发明的组合物(a)的评价
[0267]-两歧双歧杆菌mimbb23sg(23sg)与副干酪乳杆菌(23sg dg)或副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(23sg lpc-s01
tm
)组合时，可降低其刺激反应，对于il12和tnf-α均是如此。
[0268]-此外，两歧双歧杆菌mimbb23sg和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(23sg lpc-s01
tm
)的组合相对于单独的细菌菌株诱导了更高的il10产生(协同作用)。
[0269]
因此，两歧双歧杆菌mimbb23sg和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(23sg lpc-s01
tm
)的组合(根据本发明的组合物(a))具有远高于1的il10:il12比率和潜在的抗炎症作用(抗炎免疫刺激作用)。
[0270]
(x)本发明的组合物(b)的评价
[0271]-根据本发明的所有浆果提取物都显示出调节由单独测试的不同细菌菌株诱导的免疫反应的能力(图3)。
[0272]
单独而言，浆果提取物既不能诱导il12也不能诱导il10。
[0273]
特别是，蓝莓提取物(3％pp和50％fb)和蔓越橘提取物(1％pa和15％pa)在基线和存在lps的情况下均有效降低il12的产生(图3)。
[0274]
此外，50％fb蓝莓提取物在降低所有测试细菌菌株的il12和tnf-α(促炎细胞因子)方面最有效(图3)。
[0275]-包含根据本发明的多酚成分的浆果提取物(3％pp和50％fb蓝莓，1％pa和15％pa蔓越橘)与最佳细菌菌株组合(诸如两歧双歧杆菌mimbb23sg和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(23sg lpc-s01
tm
))的组合有助于进一步抑制il-12(促炎细胞因子)的产生，即使存在lps的促炎刺激的情况下也是如此(图4和4a)。
[0276]
此外，根据本发明的50％fb蓝莓提取物或1％pa蔓越橘提取物与细菌菌株组合(两歧双歧杆菌mimbb23sg和副干酪乳杆菌lpc-s01
tm
(23sg lpc-s01
tm
))的组合有助于进一步抑制tnf-α(促炎细胞因子)的产生，即使存在lps的促炎刺激的情况下也是如此(图4和4a)。
[0277]
结论
[0278]
根据本发明的包含一种或多种细菌菌株(即23sg lpc-s01
tm
)和包含多酚成分的蓝莓或蔓越橘提取物的组合物具有潜在的抗炎作用(抗炎免疫刺激作用)。