一种仿生纳米纤维杂化水凝胶膜及其制备方法与应用

1.本发明属于生物材料技术领域，特别是涉及一种仿生纳米纤维杂化水凝胶膜及其制备方法与应用。


背景技术：

2.随着生活节奏的加快，伴随着颅面骨缺损和畸形的创伤性损伤的发生率显著增加。自体骨移植作为骨缺损修复的金标准，尽管存在一些明显的缺点，如手术时带来的疼痛、二次手术的风险、缺乏足够的供体组织和术后感染等，仍广泛应用于临床。引导性骨再生已成为一种可替代的治疗方法，以代替自体骨移植修复颅面骨缺损。
3.目前应用的引导性骨再生膜根据其性能可分为可吸收膜和不可吸收膜。钛网是应用最广泛的不可吸收膜。尽管其具有优异的力学性能，但需要进行二次手术的高风险限制了其在引导性骨再生中的进一步应用。在可吸收膜中，与合成膜相比天然衍生的生物膜由于具有良好的生物相容性和物理化学性质被认为是一种更值得考虑的选择。


技术实现要素：

4.本发明针对现有技术中的问题，提供了一种仿生纳米纤维杂化水凝胶膜及其制备方法与应用。
5.为实现上述目的及其他相关目的，本发明一方面提供一种仿生纳米纤维杂化水凝胶膜，所述仿生纳米纤维杂化水凝胶膜包括细菌纤维素载体，所述细菌纤维素载体上负载有水凝胶，所述水凝胶的原料包括海藻酸盐、钙盐和抗菌肽。
6.在本发明的一些实施方式中，所述海藻酸盐选自海藻酸钠、海藻酸钾中的一种。
7.在本发明的一些实施方式中，所述钙盐选自氯化钙、硫酸钙中的一种。
8.在本发明的一些实施方式中，所述抗菌肽选自β-防御素2(bd2)。
9.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体来源于醋酸杆菌。
10.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的孔隙率为60％～70％。
11.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的弹性模量为2.695
±
0.654mpa。
12.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的拉伸强度为0.567
±
0.118gpa。
13.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的极限压缩应变为58.460％
±
13.860％。
14.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的极限压应力为0.183
±
0.032mpa。
15.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体的结晶度为84％-89％。
16.在本发明的一些实施方式中，所述细菌纤维素载体是在含蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、酵母提取物和柠檬酸的培养基中培养而成。
blot法检测骨髓间充质干细胞种植在材料上14天后bsp2、ost和runx2成骨特异性蛋白的表达情况。
29.图5a为bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2覆盖大鼠颅骨5mm缺损处12周后的微型计算机断层扫描图像。图5b(a)每种膜的bv/tv(骨容量/总体积)和(b)bmd(骨密度)变化。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。bv/tv和bmd的数值表明，bc-alg-bd2比其他膜具有更好的促进骨再生和修复的效果。
30.图6a为具有持续抗菌肽释放的bc/alg杂化水凝胶膜形成的示意图。图6b为bc-alg-bd2膜覆盖大鼠颅骨缺损的手术示意图。
31.图7为在12(a)、36(b)、72(c)小时时，不同水凝胶膜对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径。
32.图8为sd大鼠颅骨缺损模型在植入水凝胶膜12周后心、肝、肾、脾的h&e染色图像。
33.图9a为种植在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2水凝胶膜上的huvecs的血管样结构形成的评价。bar值：(a)：200μm；(b)50μm。图9b(a)huvecs形成的血管样结构的数目。图9b(b～d)为水凝胶膜上huvecs血管生成相关基因vegf、vwf和cd31表达水平的改变。
34.图10为水凝胶膜覆盖大鼠颅骨缺损12周后bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的组织学评价表明，不同水凝胶膜覆盖的缺损部位的新生骨组织有统计学差异。图10a，h&e染色。标尺：(b)200μm。(c)50μm。图10b，masson染色。标尺：(b)200μm。(c)50μm。图10c为免疫染色cd31(a)和vegf(b)检测水凝胶膜诱导新形成骨中的大血管形成的能力。cd31，vegf(红色)和dapi(蓝色)。标尺：50μm。
具体实施方式
35.引导性骨再生在骨组织工程中得到了广泛的应用，引导性骨再生的基本原理是保护颅骨缺损区不受周围软组织的侵袭，为缺损部位成骨细胞的生长提供空间，以实现新的骨形成。在颅面骨再生修复领域。具有多种功能的抗菌肽因其在缺损部位成骨细胞增殖、募集和分化中的重要作用受到越来越多的关注。与单纯的膜相比，包裹并可以长期缓释抗菌肽的膜显示了更显著的促进颅骨缺损部位新骨再生的能力。仿生纳米纤维杂化水凝胶膜作为物理屏障防止周围纤维组织入侵入缺损部位为成骨细胞形成新生骨保留空间。
36.本发明的发明人经过大量实验研究了一种可以持续释放抗菌肽的仿生纳米纤维杂化水凝胶用于引导性骨再生。抗菌肽(β-防御素2)通过与海藻酸盐(例如海藻酸钠)的离子相互作用并在ca
2
的存在下形成凝胶，不仅保护抗菌肽免受快速酶解，而且达到了缓释作用并实现了长期成骨和抗菌。本发明的可缓释抗菌肽的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜已被观察到具有颅面骨缺损的修复的巨大应用潜力。在此基础上，完成了本发明。
37.本发明一方面提供一种仿生纳米纤维杂化水凝胶膜，所述仿生纳米纤维杂化水凝胶膜包括细菌纤维素载体，所述细菌纤维素载体上负载有可缓释抗菌肽的水凝胶，所述水凝胶的原料包括海藻酸盐、钙盐和抗菌肽。其中细菌纤维素载体上负载有水凝胶，此处负载可以理解为：细菌纤维素载体为多孔载体材料，其表面浸润有水凝胶，且水凝胶可以延伸到细菌纤维素载体的孔道中，即所述水凝胶包覆细菌纤维素膜并扩散于所述细菌纤维素膜中。
38.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述细菌纤维素载体例如细菌纤
维素(bc)是一种天然可吸收的生物膜，可由多种微生物合成，无需额外的机械和化学处理，能耗极低。bc具有仿细胞外基质的纳米纤维网络结构，对干细胞的分化和增殖有显著影响，有利于bc在组织工程领域的应用。其高的结晶度(84％-89％)，好的柔韧性，较强的抗拉强度以及优异的力学性能，使得其是一种很有前途的引导骨再生材料。
39.所述细菌纤维素载体来源于醋酸杆菌(acetobacter aceti)。
40.细菌纤维素载体的形状没有具体限定。
41.细菌纤维素载体的透明度为半透明。
42.细菌纤维素载体的弹性模量为2.695
±
0.654mpa；拉伸强度0.567
±
0.118gpa。
43.所述细菌纤维素载体的极限压缩应变为58.460％
±
13.860％。
44.所述细菌纤维素载体的极限压应力为0.183
±
0.032mpa。
45.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述细菌纤维素载体是在含蛋白胨、葡萄糖、磷酸氢二钠、酵母提取物和柠檬酸的培养基中培养而成。
46.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述水凝胶的负载率为100％-120％。在一些实施例中，所述水凝胶的负载率为100％-110％；110％-120％；100％-105％；105％-110％；110％-115％；或115％-120％等。其中，负载率为负载的水凝胶的质量/细菌纤维素载体的质量*100％。
47.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，引导性骨再生的膜通过结合和释放大量具有多种功能的抗菌肽为骨缺损部位提供诱导骨再生的微环境，是具有发展前景的骨再生策略之一。海藻酸盐(alg)是从海藻中提取的富有阴离子的天然聚合物，可以提供三维培养环境以改善细胞增殖，扩散培养基中的营养物质，以及接收其他细胞的信号，非常适合用于抗菌肽的包裹和缓释。所述海藻酸盐选自海藻酸钠、海藻酸钾中的一种。
48.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述钙盐选自氯化钙、硫酸钙中的一种。海藻酸盐和钙盐形成的海藻酸钙水凝胶。
49.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，抗菌肽bd2通过调控干细胞的增殖和诱导新骨组织的形成，在骨组织工程中发挥关键作用。抗菌肽选自β-防御素2、ll37中的一种或多种的组合。β-防御素2是一种抗菌肽(abps)，在人体天然防御素系统的细胞表面为宿主提供保护，其由上皮和间充质组织分泌。具有稳定和广谱的抗菌活性，可减少多重耐药细菌的存在以及具有一定的骨诱导能力。
50.本发明另一方面提供本发明所述的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜的制备方法，包括：通过原位成胶法，将水凝胶负载于细菌纤维素载体。
51.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜的制备方法中，将细菌纤维素载体分散于反应体系中，然后在反应体系中引入水凝胶的各原料(海藻酸盐、钙盐和抗菌肽bd2)，从而使得水凝胶的各原料可以充分进入细菌纤维素载体的空隙中，从而通过原位成胶法，在细菌纤维素载体的空隙和/或表面，形成上述水凝胶，以使得水凝胶能够充分地负载于细菌纤维素载体中。其中，此部分海藻酸盐、钙盐和bd2的具体选择及比例限定同本发明第一方面提到的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中的选择及比例限定。
52.反应体系中的溶剂选自水。
53.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述细菌纤维素载体的形状没有限定，例如所述细菌纤维素膜的形状为圆形，所述细菌纤维素膜的直径为5mm～13mm，5mm～
8mm；8mm～10mm；或10mm～13mm等。
54.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述海藻酸盐与钙盐的体积比可以为1：1～2；1：1～1.5；1：1.5～2；1：1～1.2；1：1.2～1.5；1：1.5～1.8；或1：1.8～2等。
55.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述海藻酸盐与β-防御素2的浓度比为小于等于250:1。优选为200～250:1。所述海藻酸盐与bd2的浓度比也可以为1：200～230；1：230～250；1：200～210；1：210～220；1：220～230；1：230～240；或1：240～250等。
56.本发明所提供的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜中，所述反应的温度可以为25～37℃；25～30℃；30～37℃；25～28℃；28～30℃；30～34℃；或34～37℃。反应的时间可以为1～4h；1～2h；2～3h；或3～4h等。
57.本发明另一方面提供本发明所述的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜在制备用于引导骨再生的成骨材料中的用途。
58.以下结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
59.为了使本发明的发明目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例进一步详细描述本发明。但是，应当理解的是，本发明的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限制本发明，且本发明的实施例并不局限于说明书中给出的实施例。实施例中未注明具体实验条件或操作条件的按常规条件制作，或按材料供应商推荐的条件制作。
60.此外应理解，本发明中提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还可以存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤，除非另有说明；还应理解，本发明中提到的一个或多个设备/装置之间的组合连接关系并不排斥在所述组合设备/装置前后还可以存在其他设备/装置或在这些明确提到的两个设备/装置之间还可以插入其他设备/装置，除非另有说明。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
61.在下述实施例中，所使用到的试剂、材料以及仪器如没有特殊的说明，均可商购获得。
62.实施例1
63.细菌纤维素膜(bc膜)的制备
64.在含有0.5wt％蛋白胨、2wt％葡萄糖、0.27wt％磷酸氢二钠、0.5wt％酵母提取物(酵母膏)中培养木糖葡聚糖。和0.115wt％柠檬酸在28℃下反应120h。在培养基表面收获薄膜状bc膜，用2wt％naoh溶液和1wt％naclo溶液分别在80℃时纯化上述bc颗粒为1h和30min。然后，用蒸馏水清洗这些bc膜，并通过高压灭菌消毒。
65.实施例2
66.不同组膜的制备
67.通过离子相互作用制备了上述灭菌bc膜(0.2cm厚)结合海藻酸钠水凝胶和β-防御素2(bd2)，并将其称为“bc-alg-bd2杂化水凝胶”。通过将bd2与水溶液和0.5％海藻酸钠溶液混合，进行原位成胶体系，然后用1.8mm cacl2补充上述形成的悬浮液获得具有适当性能的bc-alg-bd2复合材料的解决方案。详细地，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥。将75μl，20μg/mlbd2(qs in npitcltkgvc，wgpct ggfrqigtc，
glprvrc，ckkkk)；75μl，5mg/mlalg(sigma)；150μl，2mg/mlcacl2(sigma)混合然后加入冷冻干燥的13mm的bc制成bc-alg-bd2膜。所得膜保存在室温下进行表征以及后续实验。
68.实施例3
69.不同组膜的制备
70.通过离子相互作用制备了上述灭菌bc膜(0.2cm厚)结合海藻酸钠水凝胶和β-防御素2(bd2)，并将其称为“bc-alg-bd2杂化水凝胶”。通过将bd2与水溶液和0.5％海藻酸钠溶液混合，进行原位成胶体系，然后用1.8mm cacl2补充上述形成的悬浮液获得具有适当性能的bc-alg-bd2复合材料的解决方案。详细地，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥。将75μl，30μg/mlbd2(qs in npitcltkgvc，wgpct ggfrqigtc，glprvrc，ckkkk)；75μl，5mg/mlalg(sigma)；150μl，2mg/mlcacl2(sigma)混合然后加入冷冻干燥的13mm的bc制成bc-alg-bd2膜。所得膜保存在室温下进行表征以及后续实验。
71.实施例4
72.不同组膜的制备
73.通过离子相互作用制备了上述灭菌bc膜(0.2cm厚)结合海藻酸钠水凝胶和β-防御素2(bd2)，并将其称为“bc-alg-bd2杂化水凝胶”。通过将bd2与水溶液和0.5％海藻酸钠溶液混合，进行原位成胶体系，然后用1.8mm cacl2补充上述形成的悬浮液获得具有适当性能的bc-alg-bd2复合材料的解决方案。详细地，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥。将75μl，40μg/mlbd2(qs in npitcltkgvc，wgpct ggfrqigtc，glprvrc，ckkkk)；75μl，5mg/mlalg(sigma)；150μl，2mg/mlcacl2(sigma)混合然后加入冷冻干燥的13mm的bc制成bc-alg-bd2膜。所得膜保存在室温下进行表征以及后续实验。
74.实施例5
75.不同组膜的制备
76.通过离子相互作用制备了上述灭菌bc膜(0.2cm厚)结合海藻酸钠水凝胶和β-防御素2(bd2)，并将其称为“bc-alg-bd2杂化水凝胶”。通过将bd2与水溶液和0.5％海藻酸钠溶液混合，进行原位成胶体系，然后用1.8mm cacl2补充上述形成的悬浮液获得具有适当性能的bc-alg-bd2复合材料的解决方案。详细地，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥。将75μl，50μg/mlbd2(qs in npitcltkgvc，wgpct ggfrqigtc，glprvrc，ckkkk)；75μl，5mg/mlalg(sigma)；150μl，2mg/mlcacl2(sigma)混合然后加入冷冻干燥的13mm的bc制成bc-alg-bd2膜。所得膜保存在室温下进行表征以及后续的实验。
77.对比例1
78.采用实施例1的bc膜(0.2cm厚)，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥得到冻干bc膜，采用13mm的冻干bc膜与0.5％海藻酸钠和1.8mmcacl2结合以形成bc/alg。所得膜保存在室温下进行表征以及后续的实验。
79.对比例2
80.采用实施例1的bc膜(0.2cm厚)，水合和灭菌的bc颗粒被切割成5毫米和13毫米的圆盘，然后冷冻干燥得到冻干bc膜，采用13mm的冻干bc膜与75μl，20μg/mlbd2，形成bc/bd2。所得膜保存在室温下进行表征以及后续的实验。
81.实施例6
82.物理化学和机械特性
83.1结构和表面表征
84.在日立su8010扫描电子显微镜(sem)下观察bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2膜的表面形貌。用2.5％戊二醛溶液在4℃处固定过夜，用pbs洗涤三次后，用分级乙醇系列分别30％、50％、70％、80％和90％脱水15min。然后，用100％乙醇进行三个脱水步骤。在各组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜表面被喷了金后，在加速电压为2kv的条件下观察上述样品，并拍摄记录。
85.光学图像(图1a)表明，bc组和bc/bd2组膜是白色的，透明度低，而bc/alg膜和bc-alg-bd2膜更透明。冻干bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的sem图像如图1b所示。bc和bc/bd2的表面形貌是具有随机连通孔隙的三维纳米纤维网络结构，孔隙直径小于1微米。与alg组合后，得到的的bc/alg和bc-alg-bd2显示更平滑的表面结构，几乎看不到与bc的bc/bd2的孔隙结构，这表明alg覆盖了bc和bc/bd2的表面。
86.2机械性能
87.用材料试验系统cmt4202/zwick/z020对bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的拉伸强度和弹性模量进行了分析。在测试前对前述bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的矩形(30毫米和50毫米)样品进行消毒和冷冻干燥(每组三次重复)。
88.力学性能，如图1c所示为抗拉强度、弹性模量、极限压缩应变和极限压应力。图1c(a)中bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的弹性模量分别为2.695
±
0.654mpa、19.473
±
5.663mpa、20.998
±
4.191mpa和50.068
±
4.542mpa。bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的拉伸强度分别为0.567
±
0.118gpa、1.942
±
0.1067gpa、5.051
±
1.175gpa和6.627
±
2.558gpa。图1c(b)中，bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的极限压缩应变分别为58.460
±
13.860％、60.333
±
6.462％、65.433
±
6.527％、65.830
±
6.913％。bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的极限压应力分别为0.183
±
0.032mpa、0.157
±
0.051mpa、0.103
±
0.022mpa、0.162
±
0.038mpa。力学性能满足用于引导性骨再生膜的基本性能。
89.3可降解性试验
90.为进行体外降解评价，将冻干bc膜切成大小为10
×
10mm的立方体。将样品放置在含有10ml pbs的离心管中，在37℃的培养箱中放置0天、15天、30天。试验中pbs的体积用eq(1)测定。
91.vs＝sa/10
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
(1)
92.其中vs表示磷酸盐缓冲盐水溶液(ml)的体积，sa是bc膜的表面积(mm2)。在一定时间去除pbs中的降解产物，并采用hplc(triplequad5500)进行分析。
93.由于葡萄糖是bc的最终产物，在本研究中，用hplc对bc膜的降解进行了定量验证。在图1d(a)中，bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2中的葡萄糖浓度随浸泡时间的增加而增加，表明bc膜的生物降解性。
94.4膨胀率
95.(1)将bc组、bc/alg组、bc/bd2组和bc-alg-bd2组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜每组3个样品制成10mm
×
10mm
×
10mm的大小；(2)在将各组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜放置入pbs中之前，用电子分析天平称量各组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜的重量，并计为w0；(3)于常温下将各组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜的样品浸入pbs中，在放置入pbs中后，1分钟时，2分钟时，7分钟时，12分钟时，30分钟时，60分钟时，120分钟时测试各组仿生纳米纤维杂化水
凝胶膜样品的重量并计为w1；(4)采用公式溶胀率(％)＝(w1－w0)/w0
×
100％计算bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜的溶胀率，并绘制溶胀率曲线。
96.为了研究bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的溶胀性能，进行了溶胀实验，结果如图1d(b)所示。bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2在pbs中浸泡30分钟后，溶胀率即可达到平衡。在30分钟时bc的溶胀率超过22，而在alg和bd2的加入降低了bc的吸水能力，其中bc-alg-bd2的溶胀率最小。由图3我们得出结论，在制备bc-alg-bd2水凝胶的过程中的冻干的细菌纤维素完全吸收了alg和bd2。
97.实施例7
98.bd2的释放动力学
99.将直径为5mm和13mm的bc-alg-bd2膜放入插有孔径为8.0μm的tramswell小室的上室的24孔板中，放置在37℃条件下。然后，将1ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)加入到室内，每四天更换相同体积的pbs。包裹有不同浓度bd2(5μg/ml、10μg/ml和15μg/ml)的bc-alg-bd2膜(每种浓度三个重复)用酶联免疫吸附试验(elisa)试剂盒检测释放的bd2浓度。其中，图1e(a)对应的是5μg/ml；图1e(b)对应的是10μg/ml；图1e(c)对应的是15μg/ml。
100.图1e显示了bc-alg-bd2膜对bd2的累积释放曲线。从bd2可以从bc-alg-bd2杂化水凝胶膜中释放达到28天，说明其可以长期发挥促成骨和抗菌作用。当不同浓度的bd2与alg结合时，不同直径的bc-alg-bd2杂化水凝胶膜表现出相似的bd2缓释状态。bd2释放曲线描述了bd2从第0天到测试日期的总浓度。在bc-alg-bd2在第0天被放入pbs时，elisa试剂盒检测的bd2浓度显示未被包封在bc-alg-bd2膜中的游离bd2的浓度，其值接近于零，说明绝大多数的bd2被包裹。在放入pbs后的第一天，包裹在直径为5毫米的bc-alg-bd2杂化水凝胶膜中释放出的bd2浓度为770.722
±
2.481pg/ml，在直径为13毫米的bc-alg-bd2杂化水凝胶膜中释放出的bd2浓度为740.070
±
75.451pg/ml。第五天，从直径为5毫米的bc-alg-bd2杂化水凝胶膜中释放的bd2的浓度为786.777
±
33.588pg/ml，从直径为13毫米的bc-alg-bd2中释放出的bd2的浓度为725.474
±
32.775pg/ml。此外，当bc-alg-bd2杂化水凝胶膜包裹的bd2浓度为10μg/ml和15μg/ml时，释放到pbs中的bd2与包裹bd2浓度为5μg/ml时几乎相同，表明包裹bd2浓度为5μg/ml是合适的缓释bd2的浓度。
101.实施例8
102.细胞培养
103.从4周大的spraguedawley大鼠获得rbmscs。取大鼠股骨和胫骨，用pbs洗涤三次。然后用消毒剪刀切除股骨和胫骨的末端，用20g的针头分离骨髓。骨髓在mem-alpha(gibco，grand island，ny)中孵育，加入10％胎牛血清(gibco，carlsbad，ca)和100单位/ml青霉素/链霉素，37℃、5％co2条件下培育。培养基每三天更换一次。人脐静脉内皮细胞(huvecs)是从中国科学院(上海，中国)购买在培养基中孵育。
104.实施例9
105.细胞种植
106.将bc组、bc/alg组、bc/bd2组和bc-alg-bd2组仿生纳米纤维杂化水凝胶膜使用酒精熏蒸法在37℃条件下熏蒸48小时，而后再将bc组、bc/alg组、bc/bd2组和bc-alg-bd2组的仿生纳米纤维杂化水凝胶膜置于细胞超净工作台中照射4小时。第三代rbmscs/huvecs从细胞培养箱取出，光学显微镜下观察rbmscs的细胞密度达到80％，决定rbmscs/huvecs需要传
代，用吸管沿皿壁吸出培养基，并采用pbs轻柔洗去rbmscs/huvecs表面附着的死rbmscs/huvecs细胞。
107.实施例10
108.体外细胞毒性试验
109.1细胞形态
110.为了研究rbmscs在膜上的细胞形态，细胞被种植和孵育7天，用pbs洗涤三次，然后用2.5％戊二醛固定在4℃，2h后再用pbs洗涤一次。该膜由一系列分级醇脱水，在超临界二氧化碳干燥仪(leicaemcpd300)中干燥，并涂上金(jeoljee-420)。用扫描电镜观察了膜上rbmscs的形貌。
111.2细胞增殖
112.使用细胞计数试剂盒-8(cck-8)按照制造商的协议(dujindo分子技术公司，东京，日本)测量膜上的细胞增殖)。将rbmscs播种，密度为5
×
104。培养0，1，2，3，4d后，将100μlcck-8溶液加入膜中，在37℃下孵育5％co2在96孔板中加入4h和100ul的可混溶液体，观察吸光度(在450nm处测量)。测定膜上r bmscs的od值与平板上r bmscs的od值之比，以评价膜的细胞毒性。
113.3细胞活力
114.在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上种植rbmscs，7天后，用live/dead assay试剂盒(keygenbiotech，中国)对rbmscs进行细胞毒性评估。共聚焦显微镜下观察存活细胞和死细胞。将前述bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2放入transwell小室中，并将小室放置在24孔板中。rbmscs的密度为5
×
104铺在transwell下室，3天后使用live/dead测定试剂盒(keygenbiotech，中国)研究膜的细胞毒性(用荧光显微镜观察)。
115.生物活性测定是验证底物能为干细胞增殖提供稳定环境的假设的关键步骤。用扫描电镜(sem)、cck-8(cck-8)和活死染色(活死染色)测定了与bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上的rbmscs活性。对膜上的rbmscs粘附和形态进行sem分析，以进一步评价膜的生物相容性(图3a)。培养3天后，rbmscs附着在水凝胶膜表面，在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2之间，附着的rbmscs的数量或形态没有显着性差异。扫描电镜图像显示随机的rbmsc附着在膜表面，形状多样，细胞外基质像蜘蛛网一样延伸。图像显示细胞在膜上具有良好的粘附能力。
116.用cck-8分析的rbmscs在膜上的粘附率表明，bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2组在第0、1、2或3天的粘附能力无显着性差异(图3b)。这表明该膜为rbmscs的增殖提供了合适的环境。
117.用活/死染色法研究了rbmscs在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上的生物相容性(图3c)。在与这些膜共培养3天后，rbmscs在所有类型的膜上表现出良好的活力，因为在荧光显微镜下观察到的死细胞很少(图3c(a))。在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上播种3天后，用激光共聚焦显微镜(图3c(b))捕获的活的和死的rbmscs的三维图像也得到了类似的结果，表明这些膜具有良好的生物相容性。然而，7天后，在bc-alg-bd2上播种的活rbmscs的密度高于bc、bc/alg和bc/bd2(图3c(c))，死rbmscs比在另一膜上更少，表明bc-alg-bd2比bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2更适合于rbmscs的增殖。对于huvecs，在与bc膜共培养3天后，huvecs在所有组中都表现出相当的细胞活力(图3c(d))。
118.实施例11
119.bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的抗菌特性
120.抑制圈研究
121.用革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(atcc6538)和革兰氏阴性大肠杆菌(atcc29522)评价膜的bd2缓释能力。1ml(107cfu m l-1
金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混悬液分别在50ml离心管中孵育，分别含有10ml新鲜无菌胰酪大豆蛋白酶(tsb)和luria-bertain(lb)培养基。然后，将含有金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养基分别在37℃摇床中180rpm转速，摇12h，旋转180rpm。
122.采用膜周围抑制区直径(izd)反映bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的抗菌性能。采用bc-alg-bd2膜与bc、bc/alg和bc/bd2膜进行抗菌能力比较。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液(100μl10
5 cfu m l-1
在琼脂平板上传播：bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2膜在37℃的琼脂平板上与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共孵育。在12、24和72h后，对抑制区进行评价和记录。
123.长期抗菌活性测定
124.用于生长曲线测定，100μl10
5 cfu m l-1
将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液加入12孔板中，每孔含有bc膜和2ml培养基，37℃培养以含有相同量金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的培养基为对照。在每个时间点，在96孔板中加入200μl悬浮液，测量600nm处的吸光度，以进行生长曲线的测定。采用培养168h的光密度作为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌活性的损失量。计算是在下列方程的基础上进行的：
125.抑制率(％)＝(1-od
bc
/od
空白
)
×
100％(3)
126.采用水凝胶膜抑菌圈(diz)的直径来反映bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的抗菌性能。采用bc-alg-bd2膜与bc、bc/alg和bc/bd2膜进行抗菌能力比较。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液(100μl10
5 cfu m l-1
在琼脂平板上传播：bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2膜在37℃的琼脂平板上与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共孵育。在12h、24h和72h后，对抑制区进行评价和记录。
127.图2b显示了bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2对金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性)和大肠杆菌(革兰氏阴性)的抗菌能力。没有检测到bc和bc/alg的抑制区，表明没有抗生素特性，而在12h、36h、72h用金黄色葡萄球菌和大肠杆菌培养的bc/bd2抑制区的宽度分别为5.1mm和1.2mm、2.3mm和0.8mm、0mm和0.2mm(如图7a、7b、7c所示)，揭示了bc/bd2的抗生素性质。随着孵育时间的增加，抑制区的直径减小。另一方面，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在12h、36h、72h培养的bc-alg-bd2抑制区的宽度分别为11.8mm和7.6mm、10.6mm和7.4mm、6.4mm和4.3mm(如图7a、7b、7c所示)。最有趣的是，直径的变化比bc/bd2的直径慢得多，bc-alg-bd2的抑制区直径明显高于bc/bd2的抑制区直径(如图2b，2c所示)，表明bc-alg-bd2的抗生素能力比bc/bd2延长。结果表明，bc/bd2和bc-alg-bd2对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有抑制作用，其抗菌能力明显优于bc/bd2。相反，bc和bc/alg缺乏抗菌性能。bc-alg-bd2的优异抗菌性能可归因于bd2的持续存在。通过对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长抑制检测评估bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的长期抗菌活性。如图2c所示，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的曲线在正常情况下和暴露于bd2时表现出明显的差异。与空白组、bc组和bc/alg组相比，在第一次6h培养中，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生物量略有变化。结果表明，bc/
bd2和bc-alg-bd2在金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的早期具有相似的抗菌活性，而随着生长时间的延长，bc-alg-bd2在这些组中表现出最显著的抗菌能力。如图2d所示，在168h测量的活力损失是令人信服的证据，表明bc-alg-bd2与bc、bc/alg和bc/bd2相比具有长期抗菌活性(p《0.0001，t检验)。
128.实施例12
129.体外成骨特性
130.骨髓间充质干细胞在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上的成骨分化
131.为了评价不同膜对rbmscs的成骨分化作用，分别在空白板、bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2培养基中进行7天和14天的rbmscs培养。为探讨骨髓间充质干细胞的成骨作用，分析了典型成骨生物标志物在蛋白质和基因层面的功能水平。
132.碱性磷酸酶活性与茜素红s染色
133.大鼠骨髓间充质干细胞，1
×
105个细胞在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2成骨诱导培养基中培养7天。使用碱性磷酸酶染色试剂盒(beyotime institute of biotechnology，上海，中国)根据先前报道的说明，分析膜上rbmscs的alp活性。
134.对rbmscs的alp活性进行了半定量分析。放射免疫沉淀法(ripa)裂解缓冲液(beyotime生物技术研究所)裂解rbmscs。双辛酸(bca)蛋白检测试剂盒检测rbmscs的蛋白含量。以对硝基苯基磷酸盐(sigma)为底物，以405nm的吸光度测定alp活性。从405nm处的吸光度测量alp活性。将alp活性水平以rbmscs的总蛋白含量校准。14天后，使用茜素红s溶液(solarbio，中国)对rbmscs细胞外基质中的钙进行染色，表明成骨细胞ecm的矿化程度。10％氯化十六烷基吡啶(sigma)溶解细胞外基质中钙结节，用于ars的定量。将上述溶液收集并分布在96孔板上。用分光度计(thermospectronic，carlsbad，ca，usa)从590nm吸光度测量ars)。将各组ars水平以rbmscs总蛋白含量为校准。
135.碱性磷酸酶(alp)是干细胞成骨分化早期的重要成骨酶。alp染色可显示骨髓基质细胞在膜上的分化程度。图4a(a)显示alp染色光学图像，与对照组相比，用膜培养的rbmscs具有更高的alp表达水平。在膜中，bc-alg-bd2在14天时具有最高的alp活性，这与显微镜观察到的图像有关(图4a(b))。
136.钙矿物结节显示细胞基质矿化(另一个重要的功能指标，以评估干细胞成骨分化能力)。茜素红s在成骨孵育21天后与空白板和膜上的rbmscs分泌的钙矿物结节结合，并可可视化(肉眼)评估成骨水平。如图4b(a，b)所示，bc-alg-bd2上的矿化钙质结核多于其他组的标本。对空白、bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2进行alp和ars染色，表明bc-alg-bd2提供了最有效的成骨分化。
137.qpcr法
138.在成骨诱导培养基中，bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上种7天，提取总rna，用ez-pressrna纯化试剂盒(ezbioscience，上海，中国)进一步进行qpcr检测。用primescriptrt试剂盒(takara，大连，中国)完成cdna的逆转录。本研究中的引物序列，包括bsp2、ost、runx2和gapdh，较早报道用gapdh对相对表达进行归一化处理。
139.为了分析bc膜加速rbmscs成骨分化的能力，在共培养7d后，用qpcr测定了bsp2、ost和runx2等相对成骨基因的表达水平。与对照组相比，上述基因均上调(图4e)，其中在bc-alg-bd2上播种的rbmscs的bsp2、ost和runx2的实时定量值高于其他bc组。
140.蛋白质印迹法
141.在成骨诱导培养基中与bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2共培养7天。采用蛋白质裂解缓冲液(thermo fisher scienceinc.，waltham，ma，usa)提取rbmscs的蛋白质。用bca蛋白测定试剂盒(thermo fisher science)对总蛋白进行分析，以确定其浓度。然后将相同量的蛋白质加入十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)中，转移到pvdf膜(0.22μm；emd微孔，billerica，ma，美国)。用抗bsp、抗ost、抗runx2和抗β-肌动蛋白(均来自美国马萨诸塞州剑桥的abcam)与pvdf膜在4℃下孵育8h，用二次抗体(invitrogen)孵育1h。用奥德赛v3.0图像扫描(li-cor生物科学，林肯，ne，美国)对蛋白质表达进行可视化。
142.为了进一步研究水凝胶膜的成骨能力，采用western blot法测定了在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上培养的rbmscs中bsp2、ost和runx2等成骨蛋白的表达水平。如图4f所示，bc-alg-bd2上的rbmscs与其他组相比，bsp2、ost和runx2的表达水平上调最高。上述结果表明，bc-alg-bd2能促进rbmscs最大的成骨分化，而bc、bc/alg和bc/bd2在alp、ars染色和wb的基础上也能在一定程度上加速rbmscs的成骨分化。
143.血管生成检测
144.血管形成评估
145.为了检测bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的促血管生成效应，按以下步骤进行血管形成实验。在bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2上种植7天后，将huvec细胞从膜中消化，加入96孔板(1.5
×
104每口井含有解冻的matrigel(b&d)50μl。在37℃孵育2h后采用live/dead检测试剂盒(keygenbiotech，中国)对血管状结构的形成进行了研究。获得了huvec的图像，并利用image j对网格数进行了统计。
146.qpcr分析
147.与bc膜共培养7天后，通过ez-pressrna纯化试剂盒(ezbioscience，上海，中国)提取huvecs的总rna)。并将rna转录成cdna，用prime脚本rt试剂盒(takara，大连，中国)进行进一步的qpcr分析。相对血管生成基因表达水平的参考值为对照组(无bc膜)。较早地描述了vegf、vwf和cd31的引物。
148.bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2对huvecs的血管生成影响
149.毛细血管样结构的形成是血管生成的重要过程。为了研究bc膜的促血管生成能力，进行了毛细管形成分析。对照组huvecs与bc膜共培养7天，在matrigel上没有明显的血管样结构形成。如图9a、b(a)所示，bc-alg-bd2增加了huvecs内皮细胞管样结构的形成，与无bd2组的bc相比增加了3倍以上，与bc/bd2组相比增加了1.5倍，根据每个膜的网格数，表明bc-alg-bd2在诱导毛细管样结构形成方面具有最佳的血管生成能力。
150.为了证实bc膜的血管生成能力，采用qpcr评价vegf和cd31的定量表达水平。如图9b(b-d)所示，vegf、vwf和cd31在bc-alg-bd2中的表达水平最高，分别为bc膜表达水平的1.7、2.1和1.7倍，高于bc/alg和bc/bd2组，表明bc膜对血管生成均有积极影响，bc-alg-bd2最能诱导huvecs血管生成分化。
151.实施例13
152.动物实验
153.所有程序均经上海交通大学医学院第九人民医院动物研究委员会批准。用20只sprague dawley大鼠(雌，8周大)进行手术，分为五组。(a)bc；(b)bc/alg；(c)bc/bd2；(d)
bc-alg-bd2；(e)空白。sd大鼠通常被麻醉(每100克3.5毫克)。用直径为5mm的trephine切割两片膜(测量6mm)植入大鼠直径5mm的两个颅骨缺损，将不同组膜植入缺损部位，用4-0针闭合切口。
154.实施例14
155.微型计算机断层扫描测量
156.在膜植入颅骨缺损12周后，标本被采集并扫描一个微型计算机断层成像系统(μct，ge探索locussp微ct，美国)。分析三维图像和骨体积分数(bv/tv)和骨密度(bmd)评价膜的体内成骨作用。
157.bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2对骨再生的micro ct分析
158.为了研究bc膜骨传导能力在体内的有效性，在大鼠颅骨形成全厚度骨缺损，并被膜覆盖12周(图6b)。利用micro ct对膜植入术后12周内的新骨形成进行量化和可视化。
159.每组新骨微结构的代表性图像如图5a所示，来自冠状和矢状面。在植入后12周，对照组在颅骨缺损部位几乎没有观察到新的骨形成，而植入bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的缺损部位表现出不同程度的新骨形成，从缺损部位的边缘到中心都可以新骨的形成，其中bc-alg-bd2具有最高的成骨能力，在原始骨缺损中几乎完全覆盖薄骨化组织。
160.骨体积与组织体积(bv/tv)和骨密度(bmd)的百分比是从micro ct图像中得出的定量指标(图5b(a)，5b(b))。在bc-alg-bd2膜中，bv/tv的值(31.74％
±
1.29％)显著高于bc(19.06％
±
3.26％)、bc/alg(23.59％
±
2.89％)、bc/bd2(20.65％
±
2.89％)和对照(6.11％
±
0.89％)膜(p《0.05；图5b(a))；对bmd的值进行了分析，结果与bv/tv的结果一致。bc-alg-bd2组(0.18
±
0.01g/cc)的新骨密度明显高于bc组(0.07
±
0.03g/cc)、bc/alg组(0.08
±
0.02g/cc)、bc/bd2组(0.10
±
0.03g/cc)和对照组(0.015
±
0.01g/cc)(p《0.05；图5b(b))。这些结果表明，bc-alg-bd2膜组表现出的最佳骨再生能力主要归因于bd2的持续存在，增强成骨细胞的成骨分化，促进骨再生。
161.实施例15
162.bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2的组织学评价(he和masson染色)
163.(1)将在4％多聚甲醛中浸泡的标本在洗去固定液
‑‑‑
4％多聚甲醛后，用不同浓度的乙醇分级脱水后置与二甲苯中(2)将二甲苯处理过的颅骨置于溶化的石蜡中包埋后切片；(3)随后进行苏木精伊红染色(hematoxylin-eosin，he)和马松三色染色(masson’s trichrome staining，mts)；(4)苏木精染色5分钟后，用蒸馏水冲洗切片，然后用0.3％酸醇脱色3s，自来水冲洗后，伊红染色1分钟；(5)masson染色：分别用酸性乙醇分化液，蓝液，丽春红洋红染色液对这些固定样品进行染色，然后用磷钼酸溶液冲洗，经过几个脱水步骤(使用无水乙醇)后，用中性树胶密封样品，并在装有k-viewer软件的奥林巴斯bx53光学显微镜下进行检查。2.5.2免疫荧光染色通过免疫组织化学的方式特异性地观察不同组的水凝胶对大鼠颅骨缺损区域血管生成的影响。实验步骤如下：(1)大鼠颅骨切片依次放入二甲苯和乙醇中脱水后用蒸馏水洗；(2)将脱了水的大鼠颅骨切片放置在抗原修复缓冲液中进行抗原修复，继而将其用pbs洗3次，每次5分钟；(3)将大鼠颅骨切片放置于3％过氧化氢溶液中阻断内源性过氧化物酶；(4)bsa封闭后，加入一抗：cd31(1:100,ab182981)和vegf(1:200,ab1316)，4℃孵育过夜；(5)孵育二抗后用dab显色液显色；(6)复染细胞核之后进行脱水封片处理，继而放置于显微镜下观察。
164.根据micro ct、h&e染色和masson三色染色的结果，bc-alg-bd2膜植入后12周内引导形成最多的新骨(图10a、b)。相比之下，12周后，对照组缺损部位没有新形成的骨。在所有实验组中都可以观察到新形成的成熟块状骨，而在bc-alg-bd2膜植入后的缺陷部位发现更多的纤维组织和骨组织。
165.新形成的i型胶原(染色蓝色)的形成可以通过masson的三色染色来评估。在植入后12周，bc膜周围可观察到胶原纤维，而对照组仅见纤维组织。在植入后12周，bc-alg-bd2膜中检测到的i型胶原密度高于其他膜(图10b)。
166.与其他bc膜和对照组相比，bc-alg-bd2膜在植入后12周表现出明显的促进骨再生的能力，诱导形成最多的骨组织和胶原纤维组织。
167.如图10c所示，各组物种的vegf和cd31免疫染色表明，在bc-alg-bd2组新形成的骨中观察到大血管形成，而bc、bc/alg和bc/bd2组仅有有限的血管形成。这一结论与体外血管生成检测结果一致。
168.不同膜组的大鼠器官h&e染色图像(图8)表明，bc膜对实验动物的代谢没有不良影响，因为没有降解产物的积累，并且与对照组相比，每个膜组的组织病理学变化表明bc、bc/alg、bc/bd2和bc-alg-bd2具有良好的体内生物相容性。
169.在本发明中，发明人提供了一种用于引导骨再生的bc-alg-bd2杂化水凝胶膜，它具有良好的力学特性，为新骨形成预留足够的空间。这种膜表现出长期抗菌和促成骨性能，有利于骨缺损部位成骨微环境的形成。这种仿生纳米纤维膜可以应用于缓释各种类型的抗菌肽或制剂，以获得组织工程和相关生物医学领域的缓释和长期效应。
170.上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。