神经酰胺结合破骨细胞表面CD300lf受体在制备治疗牙周炎的药物中的应用

神经酰胺结合破骨细胞表面cd300lf受体在制备治疗牙周炎的药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及牙周炎骨稳态领域，尤其涉及一种神经酰胺结合破骨细胞表面cd300lf受体在制备治疗牙周炎的药物中的应用。


背景技术：

2.骨组织稳态的维持依赖于成骨细胞和破骨细胞的平衡活动。牙周微环境中致病菌和宿主免疫反应等因素导致的破骨细胞过度活化、骨稳态失衡和牙槽骨吸收是牙周炎的进展的标志之一。目前，临床上主要采用菌斑、牙石的机械去除方法以减缓牙槽骨的吸收。然而，部分患者仍不能获得稳定疗效，表现为骨丧失的持续进行。预防和阻断牙槽骨丧失是牙周病治疗的关键，因此，充分探究牙周炎微环境中促进破骨细胞分化和活动的机制有利于发展针对牙周骨稳态的治疗新策略。
3.cd300lf是单链的ig结构域跨膜蛋白，属于cd300受体家族成员。cd300家族共有7个成员，广泛地参与多种免疫细胞激活和抑制功能。其中，cd300lf和cd300a是抑制性受体，而其余受体的功能并未完全阐明。cd300lf主要表达于髓系细胞表面，如单核-巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞(dc)和中性粒细胞等。破骨细胞来源于单核-巨噬细胞，是一种多核的终末分化型的髓系细胞。作为抑制性受体，cd300lf可抑制髓系细胞介导的多种生物学过程。表达于抗原提呈dc细胞表面的cd300lf具有抑制抗肿瘤t细胞功能。在炎症性肠炎中，dc表面的cd300lf抑制了其对凋亡细胞的吞噬作用，从而抑制了肠道炎症，而cd300lf敲除的小鼠炎性肠炎模型表现为过度凋亡细胞堆积和炎症反应。此外，肥大细胞表面的cd300lf作为抑制分子，在生理状态下防止肥大细胞过度活化而形成过敏反应。近期研究表明，cd300lf是食物过敏的可能治疗靶点。在实验性自身免疫性脑脊髓炎中，cd300lf在脱髓鞘区的炎性髓系细胞上表达，而cd300lf的缺失促进了炎性介质的产生，加重了炎症反应。cd300lf抑制髓系细胞的机制主要为通过阻断myd88和/或trif介导的ikk复合体活化，继而磷酸化或降解下游iκb和下游的nf-κb信号。研究表明，使用cd300lf的合成抑制性蛋白可模拟cd300lf的抑制功能，有可能应用于关节炎、动脉粥样硬化等疾病中。以上结果表明，cd300lf可抑制多种疾病状态中髓系细胞的功能，并有潜在的应用前景。
4.细胞外的神经酰胺(ceramide)是cd300lf的配体。ceramide属于脂质，是细胞膜的主要组成成分。ceramide广泛存在于上皮细胞中，具有上皮屏障作用。细胞膜上的ceramide是鞘磷脂跨膜信号通路的第二信使，可由鞘磷脂酶的水解作用或细胞内合成所产生。ceramide参与细胞凋亡、抑制肿瘤生长和炎症反应等，已在临床上应用于肿瘤治疗和皮肤保湿等。ceramide配体与cd300lf受体的结合在多种炎症疾病中发挥免疫抑制作用：小鼠肥大细胞表面cd300lf可识别组织周围的细胞外ceramide，通过抑制ige介导的过敏反应和肠道炎症。在小鼠皮肤感染和腹膜炎模型中，ceramide与cd300lf的结合可抑制下游通路的激活，减少中性粒细胞的聚集。在牙周组织中，外源性的ceramide可削弱人牙龈成纤维细胞与炎症相关的pge(2)受体功能并抑制胞内camp的堆积。然而，在牙周炎微环境中，外源性
ceramide是否可通过与破骨细胞表面cd300lf受体结合从而影响牙周炎的发生发展仍有待进一步阐明。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种神经酰胺结合破骨细胞表面cd300lf受体在制备治疗牙周炎的药物中的应用。
6.本发明发现在小鼠牙周炎微环境中，破骨细胞前体表面cd300lf的表达较对照组明显减少；破骨细胞前体在体外诱导破骨细胞分化，表面cd300lf表达下降；在rankl刺激下，cd300lf敲除的破骨细胞前体的破骨分化能力明显增强；ceramide配体可抑制破骨细胞前体的分化，而对cd300lf敲除的破骨细胞前体的分化能力无影响；ceramide配体可促进小鼠牙周炎中cd300lf表达，抑制骨吸收和破骨细胞的分化。进一步体内实验显示cd300lf敲除促进牙周炎的发生，而体内应用ceramide可减缓牙周炎的发展，具有一定治疗潜力。本发明阐明牙周微环境下调cd300lf抑制破骨细胞分化的新机制，研究有望为牙周治疗提供新靶点和新思路。
7.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：提供一种促进破骨细胞表面cd300lf受体表达的分子在制备治疗牙周炎的药物中的应用。
8.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述促进破骨细胞表面cd300lf受体表达的分子包括神经酰胺。
9.破骨细胞的异常激活是牙周炎骨稳态失衡的重要病理基础。破骨细胞表面的免疫抑制型受体是抑制其异常激活的关键蛋白，然而牙周微环境塑造破骨细胞免疫抑制型受体的途径和机制尚未明确。本发明拟明确破骨细胞抑制分子cd300lf在牙周炎微环境中的表达特点、功能和作用机制，并探索体内调控cd300lf-ceramide轴对牙周炎骨稳态的影响和抑制牙槽骨吸收的作用。
10.本发明通过体外模型和动物样本确立牙周微环境对破骨细胞cd300lf的表达、功能和分化的影响。动物实验探讨cd300lf敲除对牙周炎骨稳态的影响。体内和体外研究cd300lf-ceramide轴对牙周炎的治疗潜能。采用spss和graphpad软件进行统计分析，p《0.05代表统计学意义。结果表明ceramide-cd300lf轴在牙周炎发展中发挥重要作用。ceramide-cd300lf可能是牙周炎的潜在治疗靶点。
11.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述治疗牙周炎包括抑制牙周炎的牙槽骨吸收。
12.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物剂型为胶囊剂、片剂、口服制剂、微囊制剂，注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
13.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述药物用于皮下注射、静脉注射、肌肉注射或经鼻给药。
14.本发明同时提供一种治疗牙周炎的药物组合物，所述药物组合物包括促进破骨细胞表面cd300lf受体表达的分子。
15.作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述促进破骨细胞表面cd300lf受体表达的分子包括神经酰胺。
16.作为本发明所述药物组合物的优选实施方式，所述药物组合物还包括药学上可接
受的载体。
17.本发明的有益效果：
18.(1)本发明的体外实验证实破骨细胞分化过程中cd300lf表达下降，动物实验性牙周炎模型显示破骨细胞前体cd300lf表达下降。
19.(2)本发明获得cd300lf敲除鼠并验证敲除成功。
20.(3)本发明cd300lf信号缺失促进破骨向分化和牙周炎进展。
21.(4)本发明cd300lf配体ceramide在体外可促进cd300lf的表达并抑制破骨向分化。ceramide在体内可促进cd300lf的表达并减少牙周炎骨缺损，减缓牙周炎的进展。
附图说明
22.图1为获得小鼠骨髓来源破骨细胞m-csf诱导骨髓单核细胞bmms向破骨细胞前体分化；rankl诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化，获得破骨细胞(scale bar，100μm)。
23.图2为破骨细胞前体与破骨细胞表达cd300lf免疫荧光图；3个核以内的破骨细胞前体膜高表达cd300lf，多个核的破骨细胞无cd300lf表达(红色：cd300lf；蓝色：细胞核；scale bar 100μm)。
24.图3为rankl诱导破骨细胞前体向破骨细胞分化的第0、2、4、6天后，破骨前体细胞(a)cd300lf和(b)nfatc1的表达(*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)。
25.图4a为成功构建小鼠体内牙周炎模型，μct显示牙槽骨吸收，牙周炎组骨吸收较对照组加重(**p《0.01)；b为小鼠牙龈行流式细胞术分析，牙周炎小鼠牙龈cd45

cd11b

破骨细胞前体数量较对照组多，且牙周炎小鼠破骨前体细胞cd300lf表达较对照组低。
26.图5为敲除策略示意图；外显子2～6将被选为靶位点；cas9和grna将共同注射到受精卵中，用于ko小鼠的生产。
27.图6a为小鼠胫骨μct代表性图像；b为ko与wt小鼠胫骨的形态学参数如骨小梁骨体积(bv/tv)，骨小梁数目(tb.no)和骨小梁间距(tb.sp)骨小梁厚度(tb.th)的对比(ns，not significant，**p《0.01)。
28.图7为ko来源的破骨细胞分化较wt来源增强；trap染色和actin环染色显示，ko来源的破骨细胞数目较wt来源的增多(*p《0.05)。
29.图8为ko小鼠牙周炎模型骨吸收较wt鼠增加；a为μct结果代表图；b为μct牙槽骨吸收和形态学参数统计显示ko小鼠骨吸收较wt吸收严重，骨密度较wt小鼠低；c为he染色代表图和统计显示ko小鼠骨吸收较wt吸收严重(10
×
放大和40
×
放大)；d为trap染色结果代表图以及trap

细胞统计显示ko鼠trap

破骨细胞较wt多(40
×
放大和100
×
放大)(ns，not significant，*p《0.05，**p《0.01)。
30.图9为流式圈门策略与结果图；a为wt鼠cd45 cd11b-cd3-cd115 cd117 破骨细胞前体比例为14.6％；b为wt鼠cd45 cd11b-cd3-cd115 cd117 破骨细胞前体比例为33.3％。
31.图10为ko和wt鼠构建牙周炎小鼠后的炎症牙龈qpcr结果图；cd300lf在ko鼠无表达；ko鼠nfatc1、trap、ctsk、atp6v0d2表达较wt高，dcstamp表达无统计学差异(***p《0.001，****p《0.0001，ns，not significant)。
32.图11为cd300lf和nfatc-1在ceramide、pc阴性对照、甲醇和空白对照组的表达(***p《0.001，ns，not significant)。
33.图12为ceramide扣板后诱导破骨细胞分化，trap染色和actin环染色显示ceramide组破骨细胞数量较对照组低(**p《0.01)。
34.图13为ceramide扣板后诱导破骨细胞分化，于0分钟、15分钟、30分钟和60分钟提取蛋白行western blot检测。
35.图14为ceramide在体内可促进cd300lf的表达；a为流式细胞术显示cd45 cd11b 破骨细胞前体数量牙周炎最多，其次为牙周炎 ceramide，对照组最少；而cd300lf表达对照组最高，其次为牙周炎 ceramide，牙周炎组表达最少；b为qpcr结果表明牙周炎 ceramide处理组牙龈cd300lf表达量大于单纯牙周炎组(***p《0.001)。
36.图15为ceramide在体内可抑制牙周炎骨吸收。a为μct示意图；b为he染色示意图；c为μct结果显示ceramide组牙槽嵴顶至釉牙骨质界距离较对照组低，he结果显示ceramide组骨吸收较对照组小；d为trap染色结果显示ceramide组破骨细胞数量较对照组少，但无统计学意义(ns，not significant，*p《0.05)。
具体实施方式
37.本发明采用缩略词的含义为：
38.cd300lfcd300分子样家族成员fceramide神经酰胺bmms骨髓单核细胞m-csf巨噬细胞集落刺激因子rankl核kappa b配体受体激活因子trap抗酒石酸酸性磷酸酶itims免疫受体酪氨酸基抑制基序nfatc1破骨细胞活化t细胞核因子μct微型电子计算机断层扫描pc二棕榈酰磷脂酰胆碱
39.为更清楚地表述本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步说明，但不能用于限制本发明，此仅是本发明的部分实施例。
40.1.材料
41.1.1主要实验仪器
[0042][0043][0044]
1.2主要试剂和耗材
[0045][0046]
1.3抗体目录
[0047][0048]
1.4实验动物
[0049]
spf级c57bl/6小鼠购买自中山大学(大学城)实验动物中心；spf级ko基因敲除鼠制作于赛业生物科技有限公司，其对照鼠来源于同窝出生的cd300lf
/
小鼠(littermates)。
[0050]
1.5主要溶液及配置
[0051]
(1)10％fbs骨髓单核细胞培养液：dmem培养基中加入10％fbs和1％p/s，4℃保存。
[0052]
(2)20％fbs破骨细胞前体诱导液：dmem培养基中加入20％fbs、1％p/s、20ng/ml m-csf。
[0053]
(3)20％fbs破骨细胞诱导液：dmem培养基中加入20％fbs、1％p/s、30ng/ml m-csf、10/30/60ng/ml rankl。
[0054]
2实验方法
[0055]
2.1骨髓单核细胞bmms的纯化培养
[0056]
(1)颈椎脱臼法处死c57鼠，酒精消毒后，用剪刀和镊子分离股骨和胫骨，然后用无菌纱布擦除表面附着的肌肉等组织，置于pbs中清洗；
[0057]
(2)用剪刀剪开股骨和胫骨骨骺部分，使用10ml注射器，吸取骨髓单核细胞培养液反复冲洗骨髓腔直至发白；
[0058]
(3)将冲洗液用75um细胞过滤网过滤后，转移至离心管内，1000转离心5min，弃掉上清，加入红细胞裂解液冰上裂解15min后离心，弃上清；
[0059]
(4)用骨髓单核细胞培养液重悬(重悬细胞即为bmms)，将所得悬液移入t75mm培养瓶中，培养箱中静止培养1d。
[0060]
2.2骨髓单核细胞bmms向破骨细胞诱导
[0061]
(1)取出上述t75mm培养瓶，然后将培养瓶中的上清吸出，离心后弃上清，获得细胞沉淀；
[0062]
(2)破骨细胞前体诱导液重悬细胞沉淀后，将重悬液细胞计数后以200万/cm2的密度接种至24孔板或者osteo assay surface 24孔板中；
[0063]
(3)将孔板重新放入培养箱内，每隔1d观察一次细胞形态变化，每隔2d更换破骨细胞前体诱导液一次。
[0064]
2.3破骨细胞前体向破骨细胞诱导
[0065]
待上述破骨细胞前体长满孔板后，将诱导液更换为破骨细胞诱导液，隔天换液，并注意光镜下观察细胞形态及融合情况。
[0066]
2.4破骨细胞trap染色
[0067]
(1)待观察到典型的破骨细胞形态后，取出24孔板，弃去培养液，pbs清洗，2.4％多聚甲醛固定细胞，pbs清洗；
[0068]
(2)按照说明书配置trap染色工作液，取出1个1.5ml ep管，加入fast garnet gbc base solution 0.5ml，sodium nitrite solution 0.5ml，二者轻轻混匀30秒，室温静置2min；
[0069]
(3)取出1个50ml离心管，依次加入37℃超纯水45ml，步骤(2)的液体1ml，naphthol as-bi phosphate solution 0.5ml，acetate solution 2ml，tartrate solution 1ml(避光加入)，混匀后，置于37℃水浴锅中5min左右，使混合液温度尽量达到37℃；
[0070]
(4)取出配置好的染液，依次加入24孔板，避光放于37℃水浴锅中，孵育25-30min；
[0071]
(5)取出24孔板，超纯水轻轻冲洗3次，自然风干后镜下观察。
[0072]
2.5丝线法诱导实验性牙周炎模型的建立
[0073]
将无菌6-0丝线结扎在小鼠磨牙颈部，未结扎的牙齿为对照牙。每日检查丝线状态。结扎后3周后μct检测骨丧失程度。
[0074]
2.6牙龈组织单细胞悬液制备与流式检测
[0075]
小鼠组织来源：小鼠结扎磨牙周围2mm的牙龈从颌骨小心剥离，以pbs冲洗附着血污后将牙龈组织以15号手术刀片切成小块。人组织来源为牙周手术或智慧牙拔除时的牙龈组织。将上述组织后置于含有2mg/ml的胶原酶iv和1mg/ml的dnase i的消化液中进行孵育消化，20分钟后用滤网过滤获得单细胞悬液，以4℃，320g离心后弃上清并用pbs重悬，计数后进行流式细胞术的分析，小鼠破骨细胞前体的定义为b220-cd3-cd11b
low
cd115

cd117

。人
破骨细胞前体的定义为cd14

cd254

。
[0076]
2.7 ceramide扣板实验
[0077]
c-24ceramide和pc(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)以20μg/ml溶于甲醇。50μl上述溶液扣板于maxisorp 96孔板中，风干后用甲醇洗两次。接下来可实施上述共培养体系的构建。
[0078]
2.8 ceramide体内治疗实验
[0079]
在牙周炎造模开始第2、6、10天，于小鼠尾静脉注射100μg ceramide或对照脂质pc(方法参考于matsukawa t et al,gut,2016)。
[0080]
2.9骨相关μct检测
[0081]
动物处死后，骨丧失程度将使用μct检测：取实验性牙周炎磨牙部位颌骨后固定于70％乙醇溶液进行扫描，测量磨牙颊侧与腭侧近中、中部和远中共六点牙槽嵴顶部至釉牙骨质界距离以获得牙周附着丧失量。
[0082]
2.10骨相关病理检测
[0083]
牙槽骨变化的定量为计算釉牙骨质界与牙槽嵴顶之间的距离。破骨分化程度通过trap染色检测，trap 细胞多核(≥3)并且与牙槽骨接触的阳性染色细胞为破骨细胞。将牙周组织切片(5μm)脱蜡和脱水后实行免疫组化染色。在10mm tris、1mm edta溶液中微波法进行抗原修复。牙槽骨中trap

破骨细胞进行计数。
[0084]
3.实验结果
[0085]
3.1cd300lf在破骨细胞表达的体内外研究
[0086]
(1)rankl诱导破骨细胞前体融合获得破骨细胞
[0087]
破骨细胞来源于造血干细胞，在巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)、核kappa b配体受体激活因子(receptor activator of nuclear kappa b ligand，rankl)等的作用下逐渐分化融合形成多核细胞。rankl与破骨细胞膜上的rank受体结合，招募traf6等adaptor分子调控下游信号通路。激活核转录因子ap-1和nfatc1促进细胞分化和骨吸收相关基因如酒石酸抵抗酸性磷酸酶(tracp)、基质金属蛋白酶9(mmp 9)、整合素β3和组织蛋白酶k(ctsk)的表达。
[0088]
m-csf可以促进骨髓单核细胞(bone marrow mononuclear cells，bmms)向破骨细胞前体分化，并且促进其增殖。从小鼠骨髓中分离得到bmms，用骨髓单核细胞培养液中培养1d后，可以看到大量的bmms悬浮生长，细胞形态呈圆形。收取悬浮的bmms，然后接种到24孔板，更换培养液为含有20ng/ml m-csf的破骨细胞前体诱导液，诱导3d后，全部bmms贴壁生长，并可见破骨细胞前体增殖。待破骨细胞前体长满孔板后，更换为rankl破骨细胞诱导液，待破骨细胞前体融合为破骨细胞时，进行抗酒石酸酸性磷酸酶(trap)染色。将trap染色阳性且细胞核数目3个以上的细胞视为破骨细胞(图1)。
[0089]
(2)破骨细胞前体膜表达cd300lf，破骨向分化过程中cd300lf表达下调。
[0090]
通过免疫荧光和qpcr探究cd300lf在破骨细胞前体和破骨细胞的表达情况。如图2所示，m-csf刺激bmm分化为破骨细胞前体后，利用cd300lf单克隆抗体进行免疫荧光染色，结果显示cd300lf高表达于破骨细胞前体的细胞膜。加入rankl诱导破骨细胞，可见诱导出拥有多个核的破骨细胞。结果显示，随着破骨细胞的分化，cd300lf表达消失。为了进一步探究破骨细胞分化过程中cd300lf的表达变化，通过qpcr探索破骨细胞分化过程中cd300lf的
基因表达水平。结果显示，破骨细胞分化的前4天，破骨细胞活化t细胞核因子(nuclear factor-activated t cell 1，nfatc1)表达逐渐升高，表明破骨前提细胞逐渐分化为破骨细胞(图3)。nfatc1是破骨细胞重要的转录因子。在破骨细胞中，它由上游rankl信号通路的诱导、ca
2
相关协同刺激信号通路与ca
2
非依赖信号通路的扩增，最终介导破骨细胞的分化、融合及对无机和有机骨基质的降解作用。nfatc1的调节过程受其自身节律的影响，可代表破骨细胞的分化状态。qpcr结果显示，cd300lf的表达在分化后第2天即迅速降低，随着破骨向分化，cd300lf的表达逐渐降低(图3)。以上结果表明，cd300lf主要表达于破骨细胞前体的细胞膜上，并随着破骨细胞的分化表达逐渐降低。
[0091]
(3)体内小鼠牙周炎模型显示破骨细胞前体cd300lf表达下降。
[0092]
为了探究cd300lf在体内表达情况，我们构建了小鼠牙周炎模型。通过丝线法构建小鼠牙周炎模型3周，μct结果显示牙周炎模型成功构建，表现为牙槽骨的丧失和跟分叉的暴露。收集小鼠牙龈制成单细胞悬液后利用流式细胞术检测破骨细胞前体cd11b

细胞上cd300lf的表达。结果显示，牙周炎小鼠牙龈中cd11b

细胞较对照组增加，且表面cd300lf的表达较对照组降低(图4)。以上结果表明，在cd300lf的体内牙周炎模型中破骨细胞前体上的表达较未患有牙周炎的小鼠降低。
[0093]
3.2 cd300lf抑制牙周炎破骨细胞分化的体内外研究
[0094]
(1)应用crisper-cas9技术获得cd300lf ko小鼠
[0095]
cd300lf基因(ncbi参考序列：nm_001169153；ensembl：ensmusg00000047798)位于小鼠染色体11。共鉴定出7个外显子，atg起始密码子位于外显子1，taa终止密码子位于外显子7(转录本：ensmust00000106561)。外显子2～6将被选为靶位点。cas9和grna将共同注射到受精卵中，用于cd300lf敲除小鼠(cd300lf knock out mice，以下简称ko鼠)的生产(图5)。ko鼠将通过pcr进行基因分型，并进行测序分析，结果表明已成功获得ko鼠。
[0096]
采用高分辨率微ct(μct)检测10周littermates(wt)和ko小鼠的胫骨。结果表明，胫骨的形态学参数如骨小梁骨体积(bv/tv)，骨小梁数目(tb.no)和骨小梁间距(tb.sp)没有统计学差异，而与wt小鼠相比，ko小鼠骨小梁厚度(tb.th)增加(图6)，结果提示cd300lf可能参与体内骨调控。
[0097]
(2)cd300lf信号缺失在体外促进破骨向分化
[0098]
接下来我们探究cd300lf在体外是否参与rankl介导的破骨细胞分化的调控。利用ko小鼠骨髓诱导破骨细胞获ko破骨细胞，与wt littermates来源的对照破骨细胞进行trap染色和actin染色。结果表明，ko破骨细胞的trap

细胞较对照组增加，且actin环形成较对照组增加(图7)。因此，cd300lf信号缺失在体外可促进破骨细胞的分化。
[0099]
(3)ko小鼠牙周炎模型骨吸收增加
[0100]
为了确定cd300lf在体内是否调节牙周炎中破骨细胞的生物学行为，我们利用ko小鼠构建牙周炎模型。μct结果的骨改建情况显示，ko牙周炎小鼠的根分叉和牙槽嵴顶的骨吸收较对照小鼠严重(图8a)。μct形态学参数显示，与野生型小鼠相比，ko小鼠骨小梁骨体积(bv/tv)减少，而骨小梁厚度(tb.th)、骨小梁数目(tb.no)和骨小梁间距(tb.sp)没有统计学差异(图8b)。he染色同样显示，与野生型小鼠相比，ko小鼠牙槽骨吸收更严重(图8c)。此外，trap染色显示，与对照组小鼠相比，患有牙周炎的ko小鼠的牙槽骨有明显的破骨细胞形成(图8d)。以上结果表明，cd300lf的缺失在体内可促进牙周炎的破骨细胞生成以及加重
牙槽骨的丧失。
[0101]
(4)ko小鼠破骨细胞前体数量增加
[0102]
为明确小鼠牙周炎中cd300lf对破骨细胞的影响，我们通过流式细胞术检测ko小鼠和对照小鼠牙周炎模型中牙龈组织破骨细胞前体的数量。将ko和对照小鼠的炎症牙龈制备成单细胞悬液后进行流式细胞染色。圈门策略流程图显示，破骨细胞前体定义为cd45

cd11b-cd3-cd115

cd117

细胞。流式细胞术结果显示，ko小鼠炎症牙龈中的破骨细胞前体数量较对照组小鼠增多(图9)，提示cd300lf的敲除可促进牙周炎中破骨细胞前体数量的增加。
[0103]
(5)ko小鼠牙龈中破骨相关基因表达增加
[0104]
为明确小鼠牙周炎中cd300lf对破骨细胞激活与分化相关基因表达的影响，我们收集ko和对照组小鼠炎症牙龈提取rna后进行qpcr检测。破骨细胞关键转录因子nfatc1，以及破骨细胞激活与分化相关基因trap以及ctsk，破骨细胞功能缺失和骨形相关基因atp6v0d2表达升高。介导破骨细胞融合的关键基因dc-stamp在ko中表达升高，但相比于对照组无统计学差异(图10)。以上结论提示，cd300lf的敲除可促进破骨相关基因的表达。
[0105]
3.3 cd300lf-ceramide轴影响小鼠牙周炎发展的体内外研究
[0106]
(1)ceramide可增加破骨细胞前体cd300lf的表达和抑制破骨关键基因nfatc1的表达。
[0107]
神经酰胺(ceramide)是正常生物膜结构中的一种脂质成分，分布于脂双层结构的外层，在中枢神经细胞尤其是脑细胞中含量丰富。ceramide是一类高度疏水性物质，由鞘氨醇长链碱基和不同碳数的脂肪酸通过酰胺键组成。在细胞内，它是鞘磷脂信号途径的中心分子，是细胞内脂质第二信使，在细胞增殖、分化、衰老、迁移、凋亡和炎性反应等过程中发挥重要调节作用。ceramide是鞘脂代谢的核心，其合成与代谢对细胞内稳态具有重要意义。进一步研究还表明，ceramide与皮肤的结构和功能也有着极为密切的关系，外源补充ceramide可促进皮肤的修复、抗衰老等。
[0108]
既往研究表明，细胞外ceramide是cd300lf的配体。cd300lf-ceramide轴在多种炎性疾病中发挥作用。为了探究ceramide对破骨细胞表面cd300lf表达的影响以及对破骨细胞分化的影响，我们首先通过ceramide扣板实验在体外探究ceramide对cd300lf以及对破骨关键基因nfatc1的表达影响。阴性对照组为二棕榈酰磷脂酰胆碱(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，pc)和作为溶解剂的甲醛。研究结果表明，ceramide可维持破骨细胞cd300lf的表达，并降低nfatc1的表达(图11)。因此，cd300lf-ceramide轴可能可以影响破骨细胞的分化与功能。
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(2)ceramide在体外抑制破骨细胞的分化
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由于ceramide可影响cd300lf的表达并影响破骨分化中的关键转录因子nfatc1的表达，接下来我们探究ceramide是否可以直接影响破骨细胞的分化。通过ceramide扣板实验发现ceramide组的破骨细胞分化受到了抑制，表现为trap染色中破骨细胞数量的降低以及actin环形成的减少(图12)。因此，ceramide可在体外抑制破骨细胞的分化。
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(3)ceramide在体外抑制破骨细胞前体stat3、akt和erk的表达
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丝裂原活化蛋白激酶(mapks)包括细胞外信号调节激酶(erk)、p38和c-jun n末端激酶(jnk)通路调控细胞增殖和骨骼发育。此外，akt信号通路在各类细胞的生理和病理生
理中发挥关键作用，对破骨细胞增殖、迁移、代谢和分化等多种过程具有深远影响。信号传感器和转录激活因子3(stat3)信号通路在骨发育和代谢中起重要作用。既往研究表明，stat3突变导致job综合症的疾病，而大多数患有这种疾病的患者都与颅面和骨骼特征有关。此外，大量研究表明mapk、akt、stat3信号通路之间存在相互影响。
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为了探索ceramide对破骨细胞的细胞通路和机制的影响，我们通过ceramide扣板实验加rankl刺激破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化，并用western blot探究ceramide对破骨细胞分化过程中的关键信号通路的影响。研究结果表明，ceramide可抑制stat3、akt和erk的磷酸化水平(图13)。破骨细胞表面受体rank与其配体rankl结合，招募胞内的主要衔接分子traf6，激活下游信号通路，包括stat3、erk激酶、akt等。这些通路控制破骨细胞的存活、凋亡、分化以及骨降解和骨吸收的功能。因此，ceramide可能通过影响stat3、erk和akt信号影响破骨细胞的生物学行为。
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(4)ceramide在体内可促进cd300lf的表达
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前述结果提示ceramide在体外可维持cd300lf的表达并通过stat3、erk和akt信号通路影响破骨细胞的分化。接下来我们探究ceramide在体内对cd300lf表达的影响。流式细胞术结果显示，cd11b

破骨细胞前体数量比较：牙周炎小鼠》ceramide处理的牙周炎小鼠》无牙周炎的对照小鼠。cd300lf表达比较：无牙周炎的对照小鼠》ceramide处理的牙周炎小鼠》牙周炎小鼠(图14a)。进一步取牙龈提取rna进行qpcr检测，结果表明ceramide处理后的牙周炎小鼠的牙龈组织中cd300lf表达高于牙周炎小鼠(图14b)。以上结果表明，ceramide在体内可一定程度维持cd300lf在破骨细胞前体上的表达。
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(5)ceramide在体内可抑制牙周炎的骨吸收
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为了进一步探究ceramide在体内对牙周炎破骨细胞和骨组织的影响，我们构建了牙周炎模型并在牙龈组织中注射ceramide，通过μct、he染色和trap染色对牙槽骨吸收情况和破骨细胞的数量进行了探究。μct和he染色结果表明，ceramide组牙槽骨吸收较对照组减少，且跟分叉病变较对照组减轻(图15a、b)。进一步trap染色结果显示，ceramide组的破骨细胞较对照组数量少，但无统计学差异(图15c)。以上结果表明，ceramide在体内可抑制牙周炎的牙槽骨吸收。
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最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。