口蹄疫疫苗的制作方法

口蹄疫疫苗
1.本技术是申请日为2016年1月15日、申请号为201680005554.8、发明名称为“口蹄疫疫苗”的发明专利申请的分案申请，该原案申请的全文通过引用并入本文。


背景技术：

2.口蹄疫(fmd)为一种对包括家畜(牛、猪、绵羊、山羊等)和多种野生动物的偶蹄类动物传染性极强的病毒疾病。在感染fmdv牛中最显著的疾病症状包括口腔、舌头、乳头和脚上皮细胞的囊泡病变。尽管一些国家(其中美国、加拿大、墨西哥、澳大利亚和欧洲的大部分)被认为是无fmd，但疾病已经遍布全球并且对出口行业具有极大的经济影响。实际上，在过去十年间几乎在每一个大陆上都发生过若干次对经济具有破坏性的爆发。
3.必需在昂贵的生物控制设施中通过使大量(数千升)的经调适以在细胞中生长的毒性fmdv生长来生产目前杀死的抗原fmdv疫苗，这有时是困难的。此方法已造成毒性病毒从制造设施中漏出，从而在牲畜中引发高代价的爆发(参见cottam等人2008.《公共科学图书馆病原体(plos pathogen)》4:1-8)。在生长之后，然后使用化学品灭活病毒并且制备抗原浓缩物，之后进行除去污染蛋白所需的纯化步骤。难以通过血清学诊断测试区分受感染的动物与已接种疫苗的动物(diva)。在血清型和亚型上几乎没有交叉保护，而是需要疫苗和传播野外病毒株之间适当的适当匹配来实现保护。尽管疫苗的这些缺点，但是每年在全世界范围内仍制造数十亿剂量。疫苗的使用已经成为从欧洲根除fmdv和在世界的许多地方通过大规模接种疫苗行动来控制疾病的基础。产生含有骨架和合适限制位点的经基因工程改造的病毒部分地解决灭活疫苗的缺点，因为限制位点为引入不同fmd病毒株的衣壳蛋白提供基因位点。尽管如此，抗原的成本是fmd和大部分其它疫苗的成本的最大贡献因素。
4.fmd控制问题通过病毒续留(virus persistence)现象而进一步加剧。简单来说，历史上，灭活fmd疫苗已不能够预防续留或携带状态(被定义为感染和/或暴露后在28天后病毒排出)。排毒的动物，尽管未呈现任何fmd症状，但可仍然为其它动物的fmd感染源。因而，通常认可的疾病控制操作需要屠宰已接种疫苗的畜群中的所有动物，即使它们没有疾病的临床征象。
5.因而，仍期望产生具有较低抗原负载量而不损害效率和/或降低或消除fmd续留的疫苗的方法和组合物。


技术实现要素：

6.在一个方面中，本发明提供一种包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、免疫刺激寡核苷酸以及聚阳离子聚合物；铝源；并且抗原组分包含量等效于每剂量0.5μg到8μg的fmd病毒的fmd抗原组合物。
7.在某些实施例中，免疫刺激寡核苷酸为含有cpg的寡核苷酸。在某些实施例中，聚阳离子聚合物为deae葡聚糖。
8.在不同实施例中，抗原为fmd病毒组合物，并且以每剂量0.5μg到4μg，或每剂量0.5
μg到2μg，或每剂量0.5μg到1μg的量，或以每剂量约0.5μg的量存在。
9.fmd病毒可被灭活或减毒。在某些实施例中，fmd病毒为灭活fmd a24 cruzeiro病毒株。在所选择的实施例中，灭活病毒株为经基因工程改造的病毒株，其缺失前导编码区(ll)并且任选地含有阴性抗原标记。
10.在某些实施例中，经基因工程改造的病毒含有来自异源病毒株的衣壳蛋白。
11.在另一方面中，本发明提供一种在有需要的动物中预防fmd的方法，所述方法包含向所述动物投与根据先前方面的实施例的免疫原性组合物。在不同实施例中，动物选自牛类、绵羊类、猪类和山羊类。
12.在另一方面中，本发明提供一种在感染fmd的反刍动物中降低fmd续留频率的方法，所述方法包含在感染之前向所述反刍动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原。
13.在又一方面中，本发明提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似与fmd感染接触后，不屠宰畜群的已接种疫苗成员。
14.本发明还提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似与fmd感染接触后，将畜群的已接种疫苗成员隔离0到62天。
15.本发明还提供一种畜群管理的方法，其包含向所述畜群中的动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg到10μg的fmd病毒的fmd抗原，其中，在疑似与fmd感染接触后，将畜群的已接种疫苗成员移出感染区。
16.除了以上之外，本技术还涉及以下实施方案：
17.1.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据本技术的至少一种免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
18.a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(fmd)病毒组合物；
19.b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
20.c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg，
21.并且其中进一步地，在疑似与fmd感染接触后，不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员。
22.2.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据本技术的任何一种免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
23.a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(fmd)病毒组合物；
24.b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
25.c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg，
26.并且其中进一步地，在疑似与fmd感染接触后，将所述畜群的已接种疫苗成员隔离0到30天。
27.3.一种畜群管理方法，其包含向所述畜群中的每个成员投与根据本技术的任何一种免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
28.a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(fmd)病毒组合物；
29.b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
30.c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg，
31.并且其中进一步地，在疑似与fmd感染接触后，将所述畜群的已接种疫苗成员移出感染场所。
32.4.一种在感染fmd的反刍动物中降低fmd续留(fmd persistence)频率的方法，所述方法包含在感染之前向所述反刍动物投与根据本技术的任何一种免疫原性组合物，其中，在所述组合物中，
33.a)所述抗原组分包含每剂量6μg到10μg的口蹄疫(fmd)病毒组合物；
34.b)所述免疫刺激寡核苷酸包含每剂量75μg到200μg；
35.c)所述聚阳离子载体包含每剂量75mg到200mg。
36.5.根据上述实施方案1-4中任一项所述的方法，其中不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员并且将其隔离0到30天。
37.6.根据上述实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述畜群为牛类畜群。
38.7.根据上述实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述fmd病毒组合物通过中空纤维过滤制备。
附图说明
39.图1示出peg沉淀的抗原与中空纤维浓缩的抗原之间的品质差异。
具体实施方式
40.定义
[0041]“约”或“大致”当与可测量数值变量结合使用时是指所述变量的指示值并且是指在指示值的实验误差内(例如，在平均值的95％置信区间内)或在指示值的10％内的变量的所有值，无论哪个更大，除非约参考以周为单位的时间间隔使用，否则其中“3周”为17到25天，并且约2到约4周为10到40天。
[0042]“佐剂”意指提高对抗原的体液或细胞免疫应答的任何物质。佐剂一般用于实现两个目标：抗原从注射部位的控制释放和免疫系统的刺激。
[0043]“抗体”是指由于对特异性抗原的免疫应答可结合到所述特异性抗原的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”和“重”多肽链构成的血清蛋白，并且基于恒定区的组成而分类(例如，iga、igd、ige、igg和igm)。
[0044]“抗原”或“免疫原”是指被动物的免疫系统识别并产生免疫应答的任何物质。所述术语包括经杀死、灭活、减毒或修饰的活细菌、病毒或寄生虫。术语“抗原”还单独地或以其
任何组合包括多核苷酸、多肽、重组蛋白、合成肽、蛋白质提取物、细胞(包括肿瘤细胞)、组织、多糖或脂质或其片段。术语抗原还包括如抗个体基因型抗体或其片段的抗体，和可模拟抗原或抗原决定簇(表位)的合成肽模拟表位。
[0045]“缓冲液”意指防止另一种化学物质的浓度变化的化学体系，例如，质子供体和受体体系充当防止氢离子浓度(ph)显著变化的缓冲液。缓冲液的另一个实例为含有弱酸和其盐(共轭碱)或弱碱和其盐(共轭酸)的混合物的溶液。
[0046]
如应用于佐剂制剂的“主要组成”是指不含有以所述药剂发挥可测量辅助或免疫调节作用量的未列出的附加辅助剂或免疫调节剂的制剂。
[0047]“剂量”是指给予受试者的疫苗或免疫原性组合物。“第一剂量”或“引发疫苗”是指在第0天给予的此类组合物的剂量。“第二剂量”或“第三剂量”或“年剂量”是指在第一剂量之后给予的此类组合物的量，其可为或可不为与第一剂量相同的疫苗或免疫原性组合物。
[0048]
术语“乳化剂”在本发明中广泛地使用。其包括公认为乳化剂的物质，例如，或产品线的不同产品(分别为聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯和经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂)和不同溶解度增强剂如peg-40蓖麻油或另一种聚乙二醇化氢化油。
[0049]“体液免疫应答”是指通过抗体介导的一种免疫应答。
[0050]
受试者的“免疫应答”是指对抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答的研究。免疫应答通常可使用本领域中已知的标准免疫分析和中和分析来测定。
[0051]
抗原的“免疫有效量”或“产生免疫应答的有效量”为在受体中有效诱导免疫原性应答的量。免疫原性应答可足以用于诊断目的或其它测试，或可足以预防疾病的征象或症状，包括由疾病药剂感染引起的不良健康影响或其并发症。可诱导体液免疫或细胞介导免疫中的一者或两者。动物对免疫原性组合物的免疫原性应答可例如，间接通过测量抗体滴度、淋巴细胞增殖分析，或直接通过监测在用野生型病毒株攻击之后的征象和症状来评估，而由疫苗赋予的保护性免疫可通过测量例如如死亡率、发病率、温度数值的临床征象的降低、受试者的总体生理状态和总体健康和表现来评估。免疫应答可包含但不限于诱导细胞和/或体液免疫。
[0052]“免疫原性”意指诱发免疫或抗原应答。因此，免疫原性组合物将为诱导免疫应答的任何组合物。
[0053]“受感染场所”是指其中基于实验室结果、相容性临床征象、fmd病例定义和国际标准存在假定的阳性病例或确认的阳性病例的场所。
[0054]“受感染区”是指超出假定或确认的受感染场所周边3km内的区域。
[0055]“脂质”是指一组包括脂肪、油、蜡、固醇和甘油三酯的有机化合物中的任一种，其不溶于水但可溶于非极性有机溶剂、触摸为油性的并且与碳水化合物和蛋白质一起构成活细胞的主要结构材料。
[0056]“医药学上可接受的”是指物质在合理医学判断的范围内适用于与受试者的组织接触而无不当毒性、刺激、过敏反应等，与合理的效益-风险比相称，并且对其预定用途有效。
[0057]“tcid
50”是指“组织培养物感染性剂量”并且被定义为感染50％给定批次的接种细胞培养物所需的病毒稀释度。多种方法可用于计算tcid
50
，包括在整个本说明书中利用的斯
皮尔曼-卡勃方法(spearman-karber method)。对斯皮尔曼-卡勃方法的描述参见b.w.mahy和h.o.kangro,《病毒学方法指南(virology methods manual)》,第25-46页(1996)。
[0058]
持续感染或携带者动物为在感染临床疾病或临床疾病发病后在28天后排出fmd病毒的动物。
[0059]
佐剂制剂和制备方法
[0060]
本技术案公开适合于本发明的若干种佐剂制剂。这些佐剂的常见特征为存在油和一种或多种乳化剂，其中油相占包围其中公开的佐剂调配物的疫苗组合物的至少50％。
[0061]
多种油和其组合适用于本发明。这些油包括但不限于动物油、植物油以及不可代谢的油。适于本发明的植物油的非限制性实例为玉米油、花生油、大豆油、椰子油和橄榄油。动物油的非限制性实例为角鲨烷。不可代谢的油的合适的非限制性实例包括轻矿物油、直链或支链饱和油等。
[0062]
在一组实施例中，用于本发明的佐剂制剂中的油为轻矿物油。如本文所用，术语“矿物油”是指经由蒸馏技术从矿脂获得的液体烃的混合物。所述术语与“液化石蜡”、“液体矿脂”和“白色矿物油”同义。所述术语还旨在包括“轻矿物油”，“即，类似地通过矿脂的蒸馏获得的油，但其具有比白色矿物油略微低的比重”。参见，例如，《雷明顿的药物科学(remington's pharmaceutical sciences)》,第18版(宾夕法尼亚州伊斯顿(easton,pa.)：马克出版公司(mack publishing company),1990,第788页和1323页)。矿物油可从各种商业来源获得，例如j.t.baker(宾夕法尼亚州菲利普斯堡(phillipsburg,pa))、usb公司(俄亥俄州克利夫兰(cleveland,ohio))。优选的矿物油为可以名称商购的轻矿物油。
[0063]
在特别适合于预防或消除fmd续留的某些实施例中，油相以按体积计50％到95％的量；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以大于50％到60％的量，并且更优选地以大于疫苗组合物的50％v/v到52％v/v的量存在。油相包括油和乳化剂(例如，80、80等)，如果存在任何此类乳化剂的话。油相的体积被计算为油和一种或多种乳化剂的体积的总和。因此，举例来说，如果油的体积为组合物的40％并且一种或多种乳化剂的体积为组合物的12％，那么油相将以组合物的52％v/v存在。类似地，如果油以约45％的量存在并且一种或多种乳化剂以组合物的约6％的量存在，那么油相以组合物的约51％v/v存在。
[0064]
还应理解，由于本发明的佐剂仅形成本发明疫苗的一部分，所以油相以按体积计50％到95％的量；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以50％到60％的量，并且更优选地以本发明佐剂中的每一种的50％v/v到52％v/v的量存在。
[0065]
在实施例的变换实施例中，油和油溶性乳化剂在一起的体积百分比为按体积计至少50％，例如，50％到95％；优选地，以大于50％到85％的量；更优选地，以50％到60％的量，并且更优选地以疫苗组合物的50％v/v到52％v/v的量。因此，举例来说但不限于，油可以45％的量存在并且脂溶性乳化剂将以大于5％v/v的量存在。因此，油和油溶性乳化剂在一起的体积百分比将为至少50％。
[0066]
在适用于本发明的所有疫苗的又一变换实施例中，油的体积百分比为按体积计超过疫苗组合物的40％，例如，40％到90％；40％到85％；43％到60％，44％v/v到50％v/v。
[0067]
适用于本发明乳液的乳化剂包括天然生物相容性乳化剂和非天然合成表面活性剂。生物相容性乳化剂包括磷脂化合物或磷脂的混合物。优选的磷脂为磷脂酰胆碱(卵磷脂)，如大豆卵磷脂或蛋卵磷脂。可通过水洗涤粗植物油并且分离并干燥所得水合胶状物获得作为磷脂和甘油三酯的混合物的卵磷脂。可通过分馏在经由丙酮洗涤去除甘油三酯和植物油之后残留的丙酮不可溶磷脂和糖脂的混合物来获得精炼产物。可替代地，卵磷脂可从各种商业来源获得。其它合适的磷脂包括磷脂酰甘油、磷脂酰环己六醇、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、心磷脂和磷脂酰乙醇胺。磷脂可从天然来源中分离或常规地合成。
[0068]
在附加实施例中，本文所用的乳化剂不包括卵磷脂，或以免疫无效的量使用卵磷脂。
[0069]
适用于本发明的佐剂制剂的非天然、合成乳化剂包括基于脱水山梨糖醇的非离子表面活性剂，例如经脂肪酸取代的脱水山梨糖醇表面活性剂(可以名称或商购)、聚乙氧基化山梨醇的脂肪酸酯来自如蓖麻油来源的脂肪酸的聚乙二醇酯聚乙氧基化脂肪酸(例如，可以名称m-53获得的硬脂酸)、聚乙氧基化异辛基苯酚/甲醛聚合物聚氧乙烯脂肪醇醚聚氧乙烯非苯基醚(n)、聚氧乙烯异辛基苯基醚(x)。优选的合成表面活性剂为可以名称和获得的表面活性剂，如(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯)和(脱水山梨糖醇单油酸酯)。
[0070]
一般来说，一种或多种乳化剂可以按体积计0.01％到40％，优选地，0.1％到15％，更优选地2％到10％的量存在于疫苗组合物中。
[0071]
存在于本发明佐剂制剂中的附加成分包括阳离子载体、免疫刺激寡核苷酸、单磷脂a和其类似物(mpl-a)、聚肌苷酸:聚胞苷酸(聚i:c)、皂苷、季铵、固醇、糖脂、铝源(例如，或湿凝胶)和其组合。
[0072]
合适的阳离子载体包括但不限于葡聚糖、葡聚糖deae(和其衍生物)、peg、瓜尔豆胶、壳聚糖衍生物、聚纤维素衍生物比如羟基乙基纤维素(hec)聚乙烯亚胺、聚氨基酸(比如聚赖氨酸)等。
[0073]
合适的免疫刺激寡核苷酸包括odn(基于dna)、orn(基于rna)寡核苷酸或嵌合odn-orn结构，其可具有经修饰的骨架，包括但不限于硫代磷酸酯修饰、卤化、烷基化(例如，乙基或甲基修饰)和磷酸二酯修饰。在一些实施例中，可使用聚肌苷酸-聚胞苷酸或其衍生物(聚i:c)。
[0074]
cpg寡核苷酸为近来描述的一类药物治疗剂，其特征在于在特异性碱基-序列背景(cpg基序)中存在未甲基化的cg二核苷酸。(hansel tt,barnes pj(编):《用于哮喘、过敏和copd的新药(new drugs for asthma,allergy and copd)》.《呼吸研究进展(prog respir res.)》basel,karger,2001,第31卷,第229-232页，其以引入的方式并入本文中)。这些cpg基序未见于真核dna中，其中cg二核苷酸被抑制并且当存在时通常甲基化，但存在于它们赋予免疫刺激特性的细菌dna中。
[0075]
在所选择的实施例中，本发明的佐剂利用所谓的p类免疫刺激寡核苷酸，更优选地经修饰的p类免疫刺激寡核苷酸，甚至更优选地经e-修饰的p类寡核苷酸。p类免疫刺激寡核苷酸为cpg寡核苷酸，其特征在于存在回文序列，一般6到20个核苷酸长。p类寡核苷酸具有在活体外和/或活体内自发地自组装成多联体的能力。这些寡核苷酸严格说来是单股的，但回文序列的存在允许形成多联体或可能地茎-环结构。p类免疫刺激寡核苷酸的总长度为19和100个核苷酸之间，例如，19到30个核苷酸、30到40个核苷酸、40到50个核苷酸、50到60个核苷酸、60到70个核苷酸、70到80个核苷酸、80到90个核苷酸、90到100个核苷酸。
[0076]
在本发明的一个方面中，免疫刺激寡核苷酸含有5'tlr活化域和至少两个回文区，一个回文区为至少6个核苷酸长的5'回文区并且直接或通过间隔子连接到至少8个核苷酸长的3'回文区。
[0077]
p类免疫刺激寡核苷酸可根据本领域中已知的技术来修饰。举例来说，j-修饰是指经碘修饰的核苷酸。e-修饰是指一种或多种经乙基修饰的核苷酸。因此，经e-修饰的p类免疫刺激寡核苷酸为其中至少一个核苷酸(优选地5'核苷酸)被乙基化的p类免疫刺激寡核苷酸。附加修饰包括6-硝基-苯并咪唑的附接、o-甲基化、用proynyl-du修饰、肌苷修饰、2-溴乙烯基附接(优选地附接到尿苷)。
[0078]
p类免疫刺激寡核苷酸还可含有经修饰的核苷酸间键，包括但不限于磷酸二酯和硫代磷酸酯键。本发明的寡核苷酸可被合成或从商业来源获得。
[0079]
p类寡核苷酸和经修饰的p类寡核苷酸进一步公开于公布的pct申请案第wo2008/068638号中，其在2008年6月12日公布。经修饰的p类免疫刺激寡核苷酸的合适的非限制性实例在下文提供(“*”是指硫代磷酸酯键并且
“‑”
是指磷酸二酯键)。
[0080]
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[0081]
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[0090]
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[0091]
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[0092]
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[0093]
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[0094]
用于佐剂组合物的p类免疫刺激寡核苷酸的量取决于所用的p类免疫刺激寡核苷酸和预期物质的性质。
[0095]
除了油和一种或多种乳化剂以外，佐剂制剂还包含(或主要由以下组成，或由以下组成)免疫刺激寡核苷酸和聚阳离子载体的组合。这些佐剂被称作“txo”。
[0096]
在一组实施例中，txo佐剂还可包括铝源，如al(oh)3凝胶。具有铝的txo佐剂被称
作“txo-a”。
[0097]
在一组实施例中，佐剂txo和txo-a可任选地含有固醇，如例如，胆固醇、羊毛固醇、豆甾醇等。含有固醇的txo和txo-a佐剂分别被称作tcxo和tcxo-a。任选存在的固醇可以每剂量高达约1000μg(例如，100μg到1000μg、200μg到1000μg、250μg到700μg或约400μg到500μg)的量存在。
[0098]
在一组实施例中，在txo佐剂中，免疫刺激寡核苷酸，优选地odn，其优选地含有回文序列并且任选地具有经修饰的骨架，可以每剂量5μg到400μg的量存在，并且聚阳离子载体可以每剂量5mg到400mg的量存在。
[0099]
举例来说，在某些实施例中，一剂量的txo将包含每剂量约5μg和400μg之间(例如，每剂量6.25μg到200μg或6.25μg到100μg或6.25μg到50μg或6.25μg到25μg或6.25μg到10μg或10μg到200μg或25μg到200μg或25μg到100μg或25μg到50μg或25μg到100μg或50μg到100μg)的免疫刺激寡核苷酸，并且聚阳离子载体可以每剂量约5mg和约500mg之间(例如，每剂量6.25mg到200mg或6.25mg到100mg或6.25mg到50mg或6.25mg到25mg或6.25mg到10mg或10mg到200mg或25mg到200mg或25mg到100mg或25mg到50mg或25mg到100mg或50mg到100mg)的量存在。
[0100]
在某些实施例中，txo佐剂制备如下：
[0101]
a)将脱水山梨糖醇单油酸酯溶解于轻矿物油中。所得油溶液经无菌过滤；
[0102]
b)将免疫刺激寡核苷酸、葡聚糖deae和聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯溶解于水相中，因此形成水溶液；和
[0103]
c)在连续均匀化下将水溶液添加到油溶液中，因此形成佐剂制剂txo。
[0104]
在一组实施例中，在txo-a佐剂中，免疫刺激寡核苷酸作为存在于txo佐剂中，铝源以高达40％v/v(例如，35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％)的量存在。在一组实施例中，铝源以疫苗组合物的2％v/v到20％v/v，更优选地以约5％v/v和约17％v/v之间存在。
[0105]
在某些实施例中，txo-a佐剂以类似于txo佐剂制备，并且将铝源添加到水溶液中。
[0106]
在制备tcxo和tcxo-a佐剂中，将胆固醇溶解于油溶液中，并且制备tcxo和tcxo-a的其它步骤分别类似于制备txo和txo-a中使用的步骤。
[0107]
抗原
[0108]
本发明人已出人意料地发现，本发明的佐剂甚至当抗原的剂量从10μg的fmd病毒降低到0.5μg时还能够足够的预防口蹄疫疾病。因此，在本发明的不同实施例中，fmd病毒的量可为0.5μg、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg或约10μg。抗原的量可为在0.5μg和1μg之间、在1μg和2μg之间、在2μg和3μg之间、在3μg和4μg之间、在4μg和5μg之间、在5μg和6μg之间、在6μg和8μg之间、在8μg和10μg之间的fmd病毒(140s颗粒)。
[0109]
当前，已分离出七种血清型的fmd。在此病毒的七种血清型中，a、c、o、asia 1和sat3似乎为不同的谱系；sat 1和sat 2为未解析的进化枝。在每种血清变型内，存在多种病毒株。举例来说，a24cruzeiro属于血清型a，并且o1 campos属于血清型o。
[0110]
任何血清型的fmd病毒可用作本发明中的抗原，其条件是此类病毒不是致病性的。致病性可通过灭活病毒例如，用甲醛或bei处理来降低。
[0111]
在某些实施例中，病毒可通过培养物传代或经由重组方式来减毒。先前已证实，举例来说，在牛和猪中前导蛋白l
pro
编码区的缺失产生减毒的fmd病毒。参见，例如，us 5,824,
316、us 8,765,141，《病毒学(virology)》1997 227(1):96-102,j.virol 2012 86:11675-11685。在l蛋白的sap域内的位置55和58处的点突变还产生活的病毒，所述病毒在细胞培养物中呈现轻度减毒的表现型并且在猪fmd模型中为保护性的。参见美国专利第8,846,057号。
[0112]
在某些实施例中，病毒还含有允许diva(区分受感染的动物与已接种疫苗的动物)分析的阴性抗原标记。在某些实施例中，将阴性抗原标记引入到3d和/或3b蛋白。参见，例如，seq id no 19、seq id no 20、seq id no 21、seq id no 22。
[0113]
如同其它病毒，fmd病毒不断地进化和突变，因此接种抵抗其的困难之一为血清型之间和甚至血清型内的巨大变化。在血清型之间不存在交叉保护(用于一种血清型的疫苗将不必针对任何其它疫苗进行保护)并且此外，在给定血清型内的两种病毒株对于给定基因可具有不同多达30％的核苷酸序列。这意味着fmd疫苗必须对所涉及的病毒株具有高度特异性。
[0114]
因此，在某些实施例中，将核酸内切酶限制位点引入到病毒的基因组中，从而允许引入来自异源fmd病毒株的蛋白(例如，形成外衣壳的蛋白)。
[0115]
在某些实施例中，抗原组分包含fmd病毒株a24 cruzeiro，其可任选地通过在3b和/或3d蛋白中缺失前导蛋白、阴性标记突变体和通过引入限制性核酸内切酶位点以便更容易引入来自异源病毒株的抗原(例如，衣壳蛋白)的序列来修饰。抗原的合适的非限制性实例描述于us8,765,141中。对应于遗传修饰fmdv的rna基因组的dna序列还提供于seq id no:15(a
24
ll3d
yr
)和seq id no:17(a
24
ll3b
pvkv
3d
yr
)中。因此，与阐述于例如seq id no:15中的dna序列互补的dna序列为fmdv病毒的rna基因组(即，编码fmdv的rna)的模板，即与fmdv病毒的rna基因组互补或“编码”fmdv病毒的rna基因组。在某些实施例中，病毒包含异源fmd病毒株(即，除a24 cruzeiro以外的fmd的病毒株，包括但不限于谱系c、o、asia 1、sat3、sat1和sat 2、turkey 06的病毒株和谱系a的其它病毒株)的一种或多种衣壳蛋白。此类异源抗原的非限制性实例示出在seq id no:23(asia1-a
24
ll3b
pvkv
3d
yr
)和seq id no:24(a/turkey/06-a
24
ll3b
pvkv
3d
yr
)中。另外，o1 campos-a
24
ll3b
pvkv
3d
yr
(全基因组，也被称作o1campos)、c3 indaial-a
24
ll3b
pvkv
3d
yr
(全基因组)和衣壳argentina2001iso93(衣壳和2a部分序列)分别提供于seq id no 25、seq id no26和seq id no 27中。
[0116]
还设想了此类抗原的变体。运用使用标准参数描述的比对程序中的一种，变体与参考序列至少80％相同(例如，85％相同、90％相同、95％相同、96％相同、97％相同、98％相同或99％相同)。多个比对工具可用于确定序列一致性，包括但不限于blast、clustal或philip。
[0117]
本领域的技术人员将认识到，这些值可适当地调整，以便通过考虑密码简并、氨基酸类似性、阅读框定位等，确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
[0118]
在某些实施例中，变体涵盖不止特异性示例性核苷酸或氨基酸序列并且包括其功能等效物。引起在给定位点处产生化学等效氨基酸但不影响编码的多肽的功能特性的核酸片段的改变在本领域中是众所周知的。因此，用于氨基酸丙氨酸、疏水性氨基酸的密码子可由编码另一种疏水性较差的残基(如甘氨酸)或疏水性较强的残基(如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，引起一种带负电残基取代另一种残基(如天冬氨酸取代谷氨酸)或一种带正电荷残基取代另一种残基(如赖氨酸取代精氨酸)的变化还可预期产生功
能上等效的产物。引起多肽分子的n端和c端部分改变的核苷酸变化还将预期不改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种修饰在本领域的常规技能内都是良好的，正如确定所编码产物生物活性的保持力。
[0119]
本发明的多肽可以不同方式改变，包括氨基酸取代、缺失、截断和插入。可通过合并本发明的蛋白质的单元和片段以及其它蛋白质来形成具有所关注特性的新颖蛋白质。用于此类操控的方法一般在本领域中是已知的。因此，本发明的基因和核苷酸序列包括天然存在的序列以及突变体形式两者。同样地，本发明的蛋白质涵盖天然存在的蛋白质以及其变异体和经修饰形式。此类变体将继续具有父代fmd病毒的所需经修饰的活性。将在编码变体的dna中作出的突变不得将序列放置在阅读框之外并且优选地将不形成可产生二级mrna结构的互补区。
[0120]
生长和纯化适合于本发明的抗原的方法在本领域中是众所周知的并且包括但不限于中空纤维过滤和peg沉淀。这些方法在某种程度上产生不同的抗原组合物。举例来说，在peg沉淀中，抗原组合物耗尽非结构蛋白。在其它方法如例如中空纤维过滤中，抗原组合物含有结构fmd蛋白和非结构fmd蛋白两者。因此，在一些实施例中，fmd抗原包含结构蛋白。在如例如其中fmd抗原通过中空纤维过滤制备的其它实施例中，fmd抗原包含结构蛋白和非结构蛋白两者，特别是3d蛋白。
[0121]
使用不含区分已接种疫苗动物与受感染动物的内部抗原标记，去除非结构蛋白的目前疫苗平台为期望的，因为由于非结构蛋白抗体的存在可识别受感染动物的事实，所以这仍是期望的。然而，在fmdll3b3d平台的情况下，在抗原制备中非结构蛋白的存在不妨碍区分已接种疫苗动物与受感染动物。在这种背景下，包括非结构蛋白和佐剂的本发明抗原制剂以比经纯化抗原制剂低的剂量提供两种针对临床疾病的保护并且在反刍动物中还更有效地防止持续感染的建立。
[0122]
组合物
[0123]
本发明的组合物可遵循公认惯例来调配以包括用于动物(包括人类)的可接受载体，例如标准缓冲液、稳定剂、稀释剂、防腐剂和/或增溶剂，并且也可经调配以促进持续释放。稀释剂包括水、生理食盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。用于等渗性的添加剂尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白。其它合适的媒剂和添加剂，包括尤其适用于调配经修饰的活疫苗的那些，对本领域那些技术人员是已知的或将是清楚的。参见，例如，《雷明顿的药物科学(remington's pharmaceutical science)》,第18版,1990,马克出版(mack publishing)，其以引用的方式并入本文中。
[0124]
本发明的组合物可进一步尤其包含一种或多种附加免疫调节组分如(例如)附加佐剂或细胞因子。可用于本发明疫苗的此类附加佐剂的非限制性实例包括ribi佐剂体系(蒙大拿州汉密尔顿的瑞比公司(ribi inc.,hamilton,mont.))、弗氏(freund's)完全和不完全佐剂、嵌段共聚物(佐治亚州亚特兰大的cytrx(cytrx,atlanta ga.))、qs-21(马萨诸塞州剑桥的剑桥生物技术公司(cambridge biotech inc.,cambridge mass.))、saf-m(加利福尼亚州爱莫利维尔的凯龙(chiron,emeryville calif.))、佐剂、皂苷、quil a或其它皂苷级分、单磷酰脂质a和阿夫立定(avridine)脂质-胺佐剂。可包括在疫苗中的其它免疫调节剂包括例如一种或多种介白素、干扰素或其它已知的细胞因子。
[0125]
佐剂组合物的投与途径包括不经肠、口服、口鼻、鼻内、气管内、体表、皮下、肌内、
经皮、皮内、腹膜内、眼内、静脉内和舌投与。任何合适的装置可用于投与组合物，包括针筒、滴管、无针注射装置、贴片等。所选择供使用的途径和装置将取决于佐剂的组成、抗原和受试者，并且对本领域技术人员而言是众所周知的。
[0126]
鉴于fmd的高传染性，需要采取遏制和/或消除fmd爆发的测量受监管机构如例如国家农业部(national ministries of agriculture)控制，并且由国际组织如oie(国际兽疫局(international office of epizootics))批准。需要结合爆发进行的测量可包括但不限于动物运动的停止、对包括奶、肉、兽皮等动物产品的运动的有效控制、消灭(stamping-out)策略(屠宰受感染畜群中的动物，以及在适当情况下，已通过动物间直接接触或通过间接接触病原体而暴露于感染的其它畜群中的那些动物)。通常，邻近畜群中的动物接种疫苗，随后被屠宰。
[0127]
本发明人已出人意料地发现，本文所述的某些免疫原性组合物预防续留，所述续留被定义为在感染之后存在或排出fmd持续长于28天。在某些实施例中，此类免疫原性组合物包含抗原组分和佐剂组分，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量至少6μg的fmd病毒的fmd抗原。
[0128]
在某些实施例中，抗原可以等效于每剂量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒的量存在。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
[0129]
因此，本发明还提供一种在感染fmd的反刍动物中降低fmd续留频率的方法，其包含在感染之前向所述反刍动物投与包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量至少6μg的fmd病毒的口蹄疫(fmd)抗原。
[0130]
在不同实施例中，抗原的量可等效于每剂量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg。聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
[0131]
向反刍动物(例如，牛、绵羊、骆驼等)投与这些免疫原性组合物允许改变畜群管理操作。在某些实施例中，在疑似与fmd病毒接触之后，不屠宰畜群的已接种疫苗成员。
[0132]
在替代(或附加)实施例中，将已接种疫苗动物隔离一段较短时间。因此，在某些实
施例中，可将疑似与fmd接触的动物隔离少于30天，例如，28天或29天。
[0133]
此外，指定一个区域为封锁区意指对来自封锁区的动物或动物产品禁止运动的严格限制，一般来说，30天或更长。因此，在某些实施例中，可将疑似与fmd接触的动物在距离疑似与fdm接触的少于30天内例如28天或29天从封锁区中移出。
[0134]
在其中抗原组分需要经基因工程改造的fmd抗原的实施例中，例如如上所述，有可能区分已接种疫苗的动物与受感染的动物。因此，在附加实施例中，畜群管理方法(或在感染fmd的反刍动物中降低fmd续留频率的方法)。
[0135]
换句话说，在某些实施例中，包含抗原组分和佐剂组分的免疫原性组合物可用于畜群管理，其中佐剂组分包含(或主要由以下组成或由以下组成)含有油相的乳液(所述油相占所述免疫原性组合物的至少50％v/v)、量为每剂量75μg到200μg的免疫刺激寡核苷酸和量为每剂量75mg到200mg的聚阳离子聚合物；并且抗原组分包含量等效于每剂量6μg的fmd病毒的fmd抗原，其中在疑似与fmd感染接触后，不屠宰所述畜群的已接种疫苗成员；和/或在疑似接触之后隔离0到30天和/或在疑似接触的30天内被移出感染场所。
[0136]
在不同实施例中，抗原的量可等效于每剂量6μg到20μg的fmd病毒，例如，每剂量8μg到20μg、10μg到20μg、12μg到20μg、14μg到20μg、16μg到20μg、18μg到20μg、6μg到10μg、6μg到12μg、6μg到18μg、8μg到12μg或8μg到10μg的fmd病毒。免疫刺激寡核苷酸的量可为例如每剂量75μg到100μg、75μg到125μg、75μg到150μg、75μg到150μg、100μg到200μg、100μg到150μg、125μg到200μg、125μg到175μg或125μg到150μg聚阳离子聚合物可以例如每剂量75mg到100mg、75mg到125mg、75mg到150mg、75mg到150mg、100mg到200mg、100mg到150mg、125mg到200mg、125mg到175mg或125mg到150mg的量存在。
[0137]
现将在以下非限制性实例中进一步描述本发明。
[0138]
实例
[0139]
实例1.制备抗原
[0140]
两种方法用于制备抗原：中空纤维过滤和peg沉淀。
[0141]
peg(聚乙二醇)沉淀方法已在本领域中已知。简单来说，用fmd病毒感染bhk-21细胞。然后(24到36h后)，细胞通过冷冻-解冻裂解，并且通过低速离心(500x g)细胞碎片使细胞裂解物澄清。将peg添加(8％w/v)到含有结构蛋白和非结构蛋白两者的上清液中。将混合物在4℃下培育12到18hr。在此培育期间，fmdv颗粒与peg缔合。通过以16,000xg离心和收集含有peg和病毒的沉淀离心块来回收抗原。丢弃含有细胞非结构蛋白和病毒非结构蛋白的上清液。然后用小体积的缓冲液洗涤结合病毒颗粒的离心块以从peg洗脱fmdv颗粒。
[0142]
本文所述的附加方法是基于fmdv培养物上清液的中空-纤维浓度。此方法的步骤由连续过滤布置以首先从培养物(用fmd病毒感染并且通过冷冻-解冻裂解的bhk-21细胞)中去除细胞碎片和大的材料组成。将培养物材料连续地泵送通过10μm胶囊过滤器、4.5μm胶囊过滤器，然后最后通过0.8μm/0.2μm过滤器。然后使用允许小于0.01μm的颗粒流过膜的中空纤维超过滤滤芯来浓缩此滤液。fmdv颗粒和许多非结构蛋白仍然在柱回路中而液体和较小的蛋白通过膜变成废物。运行柱回路，直到浓缩物达到所需体积，通常十倍浓度。
[0143]
图1为示出peg沉淀和中空纤维浓缩的抗原之间品质差异的蛋白质印迹(western blot)。中空纤维浓缩的抗原含有大量结构蛋白和非结构蛋白，如在此图中通过使用对蛋白3d(最大fmdv非结构蛋白)具有特异性的抗体和对衣壳蛋白(结构蛋白)具有特异性的抗体
染色的蛋白质印迹所示。相比之下，peg沉淀的抗原(泳道9)含有结构蛋白但不含有可检测水平的3d蛋白。
[0144]
实例2.用txo辅助的fmd疫苗的作用
[0145]
动物和样品收集
[0146]
重180kg到230kg的六到八个月大的霍斯坦阉牛(holstein steers)用于本研究中。如稍后从第0天取的血清样品确定，在接种之前，所述动物无fmdv反应性抗体，如通过3d elisa测试确定。所有28只动物共混在bsl-3-ag动物测试设施中的一个房间中。喂食动物完全日粮球粒或苜蓿立方块，水和盐块可随意获得。在第0天之前，使动物适应设施五天。动物事先用bovi-shield5、300、和处理。具有连续耳标签数字的动物组(每组n＝4)被指派到处理组。
[0147]
在接种后未记录到不良事件。
[0148]
在第0天(在接种之前)、第4天、第7天、第14天、第21天(在攻击之前)、第24天、第28天、第31天和第42天从所有动物收集血清分离器血液试管以获得血清样品。使血清样品保持冷冻直到在血清中和分析中测试抵抗fmdv的中和抗体的存在(报告为在50％的凹孔中中和100tcid
50
的同源fmdv的最终血清稀释度的倒数)或以研究抗3dpol应答(借助于竞争酶联免疫吸附分析(competitive enzyme-linked immunosorbent assay))。
[0149]
如oie(“陆地动物的诊断测试和疫苗手册(manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals)”)所推荐，出于疫苗功效，通过针接种经由皮内经舌(idl)途径攻击已接种疫苗的牛。在接种后21天，所有已接种疫苗的动物和未经处理的动物经idl接种10,000btid
50
(50％牛类动物舌部感染剂量)的同源fmdv a24 cruzeiro，其被分为4次接种，每次0.1ml，2,500btid
50
/0.1ml。在攻击后跟踪所有动物10天以分析如通过发热、鼻分泌物、分泌唾液、食欲不振和/或跛行表现的临床疾病的发展。在镇静(以0.22mg/kg im给予甲苯噻嗪从而在程序期间维持胸骨侧卧)情况下在第21天(在接种之前)和第24天、第28天和第31天进行临床评估蹄囊泡的存在。用妥拉苏林(tolazoline)，iv，以2mg/kg的剂量复原镇静剂。
[0150]
疫苗
[0151]
如实例1中所述制备抗原。抗原储备溶液含有5.51μg/ml通过中空纤维过滤(prep a)制备的抗原或10.26μg/ml通过peg沉淀(prep b)制备的抗原。
[0152]
向动物投与免疫原性组合物的细节在表1中提供。每组含有四只动物。
[0153]
表1.研究设计
[0154][0155]
t02组到t06组的免疫原性组合物在接种的当天均匀化并且在第0天投与到动物。
[0156]
续留被测量为使用病毒分离和定量rrt-pcr两者确定的病毒(fmdv病毒rna和/或感染性fmdv)的存在或不存在。用于定量rrt-pcr的引物为如下：
[0157]
正向(seq id no:28)：gacaaaggttttgttcttggtca
[0158]
反向(seq id no:29)：tgcgagtcctgccacgga
[0159]
taqman探针：(fam报导子，tamra淬灭剂，seq id no:30)tcctttgcacgccgtgggac
[0160]
对fmdv的血清中和滴度汇总于表2中。
[0161]
表2-血清中和滴度
[0162][0163]
a,b,c
在α＝0.05时，在每天内具有相同字母的处理组并非显著不同
[0164]
将fmdv的征象评分为蹄囊泡的存在(1)或不存在(0)，即，在单个蹄上囊泡的存在产生得分1，在仅2个蹄上囊泡的存在产生得分2并且在4个蹄上的囊泡产生得分4。一旦动物得到得分4，就认为在研究期间其具有4分。
[0165]
针对每个蹄和每天检查的来自各个动物的得分在表3中示出。在表4中，呈现了根据任一个蹄是否为阳性的每个动物的得分的汇总。
[0166]
表3-fmdv囊泡评分各个动物列表
[0167]
[0168][0169]
*自动评分为
‘1’
，因为此动物的所有蹄先前在所有四个蹄上具有囊泡。
[0170]
表4-fmdv囊泡评分-任一蹄位置阳性
[0171]
[0172][0173]
*自动评分为
‘
是(yes)’，因为此动物的所有蹄先前在所有四个蹄上具有囊泡。
[0174]
在t01(阴性对照)中的所有动物都在第24天开始表现出蹄囊泡。在第28天和第31天，在所有t01动物中的所有蹄都发现具有囊泡。相比之下，除t03(用peg沉淀的2μg剂量的fmdv)外，对于每一组都观察到全保护(即，无蹄囊泡)，其中一只动物(r14-77)在第24天、第28天和第31天得到得分1。所测试的免疫原性组合物对续留感染的作用在表5和表6中示出。续留被定义为在攻击后28天之后在食道-咽部流体(使用“食道探管(probang)”杯获得)中存在感染病毒或病毒rna(在接种之后第49天，如表5和表6中所示)。在表5中，示出了针对各个动物和处理组的反转化的来自食道探管样品的每ml fmdv rna拷贝数的最小平方均值的定量rrt-pcr结果。在表6中，食道探管样品病毒分离测试的结果报告为阳性或阴性。由于分析的检测限，表5中低于1.87的值被评分为
‘
阴性’。
[0175]
表5-食道探管rrt-pcr各个动物列表和反转化的最小平方均值/处理组
[0176]
[0177][0178]
表6-食道探管样品病毒分离-各个动物列表
[0179]
[0180][0181]
对于第1组(盐水对照)，通过rrt-pcr对于fmdv，三只动物至少一次为阳性的，并且对于病毒分离两只动物一直为阳性的。
[0182]
在t02组中，通过rrt-pcr未曾发现动物携带fmdv，但通过病毒分离发现一只动物(r14-74)仅在单个时间点(第42天：攻击后第21天)为阳性，但其后为阴性(第49天：和第52天，指示不存在持续感染。在第38天和超出第38天，在t02中的其它动物并未携带可通过rrt-pcr或通过病毒分离分析检测的fmdv。
[0183]
在t03组中，一只动物(r14-79)得到完全保护而免遭fmdv感染，两只动物证实在测试天数中的三天或四天存在fmdv(通过rrt-pcr或通过病毒分离分析)，并且一只动物(r14-77)通过在第38天和第42天的两个测试证实fmdv存在，但其后不存在fmdv。
[0184]
在t04组中，通过第52天的一个或两个测试，所有四只动物都表现出fmdv续留。
[0185]
在t05组中，一只动物(r14-62)通过rrt-pcr仅在第38天证实存在病毒，但通过病毒分离证实不存在病毒，并且其后通过任一测试都未检测到病毒。对于t05组中的其它三只动物在任何时间通过rrt-pcr或通过病毒分离分析都未检测到fmdv。
[0186]
在t06组中，两只动物得到完全保护而免遭续留，而其它两在检测的每一时间点都为rrt-pcr或病毒分离阳性。
[0187]
在t07组中，四只动物中的三只得到完全保护，而一只动物(r14-71)对于rrt-pcr和病毒分离两者在每一时间点都为阳性的。
[0188]
表7概括续留实验的结果。如果在第49天(攻击后28天)和第52天(攻击后第31天)rrt-pcr或病毒分离分析都未检测到fmdv，那么认为动物是非续留的。
[0189]
表7续留和非续留频率
[0190][0191][0192]
投与8μg抗原的八只动物(t02组和t05组)中的仅两只表现出存在病毒，并且仅一天存在病毒(一天分别在第37天和第42天)。这些组中的其它动物完全得到保护考虑到在感染之后28天和31天均未检测到病毒存在，投与8μg抗原的动物中无一者被认为是持续感染。投与2μg抗原的八只动物(t03组和t06组)中的五只表现出病毒续留。投与0.5μg抗原的八只
动物八只动物(t04组和t07组)中的四只表现出续留。
[0193]
结合在一起，这些结果指示在投与8μg抗原的动物中保护免遭fmdv病毒续留，并且还可看出，相比于peg沉淀，通过中空纤维过滤纯化抗原是有利的。两种抗原制剂之间的主要差异为在中空纤维过滤制剂中存在除了结构蛋白以外的非结构蛋白。因此，在不受理论束缚的情况下，可看出由其中抗原含有结构蛋白和非结构蛋白(并且具体来说蛋白3d)两者的疫苗引起的免疫应答的品质在预防性fmdv续留方面更有效，如表8中所示。
[0194]
表8.抗原制备方法对免疫应答的影响.
[0195][0196]
本说明书中引用的所有公开案(专利公开案和非专利公开案)表示本发明所属领域的技术人员的技能水平。所有这些公开案在本文中以全文引用的方式并入，其程度如同每一篇个别公开案具体并且单独地说明为以引用方式并入。
[0197]
尽管本文中已参考特定实施例描述本发明，但应理解，这些实施例仅仅说明本发明的原理和应用。因此，应理解，在不脱离如由以下权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下，可对说明性实施例作出众多修改并且可设计出其它配置。