瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备改善炎性衰老的化妆品、药物中的用途的制作方法

1.本发明涉及一种已知活性物质及包含其的提取物在化妆品或药物中的用途，具体而言，本发明涉及瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备用于改善炎性衰老的化妆品及药物中的用途。


背景技术：

2.瓜蒌为葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥成熟果实，性甘、微苦，味寒，归肺、胃、大肠经，具有清热涤痰，宽胸散结，润燥滑肠的功能，主要含有多糖、糖苷和氨基酸类等成分。
3.苦杏仁为蔷薇科植物山杏的干燥成熟种子，味苦性温有小毒。作为药食同源的传统中药，苦杏仁具有降气、止咳、平喘、润肠通便等功效。
4.紫外线照射、干燥、炎症反应及氧化损伤会加速皮肤老化。通过探究瓜蒌苦杏仁复方提取物的抗炎效果，为该复方提取物通过改善炎症反应减缓皮肤衰老，进而开发为抗衰老化妆品提供基础研究依据。


技术实现要素：

5.因此，本发明的一个目的在于改善皮肤炎性衰老。
6.本发明的另一个目的在于抑制黑色素瘤细胞的增殖。
7.根据本发明的一个实施方式，其提供了一种瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备用于改善炎性衰老的化妆品及药物中的用途。
8.根据本发明的另一个实施方式，其提供了高浓度的瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备黑色素瘤治疗药物中的用途。
9.有益效果
10.(1)瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357生物安全性良好，是一种可用于化妆品添加的天然来源及、安全的原料。
11.(2)瓜蒌苦杏仁复方提取物抗炎效果好，为该提取物制备的功能性化妆品提供实证，对各种内外因素引起的皮肤炎症问题具有缓解及修复作用。
附图说明
12.图1为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对巨噬细胞增殖的影响的图。
13.图2为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对lps诱导的巨噬细胞炎性因子释放的影响的图。
14.图3为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对lps诱导的巨噬细胞炎症模型ikba和il-17a mrna表达的影响的图。
15.图4为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对巨噬细胞炎症模型p-pi3k、p-akt蛋白表达的
影响的图。
16.图5为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对黑色素瘤细胞增殖作用的影响的图。
17.图6为表明瓜蒌苦杏仁复方提取物对黑色素瘤细胞b16-f10凋亡的影响的图。
具体实施方式
18.为使本领域具有普通知识的人员可了解本发明的特点及效果，以下谨就说明书及申请专利范围中提及的术语及用语进行一般性的说明及定义。除非另有指明，否则文中使用的所有技术及科学上的字词，皆具有本领域技术人员对于本发明所了解的通常意义，当有冲突情形时，应以本说明书的定义为准。
19.在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其他任何类似用语均属于开放性连接词(open-ended transitional phrase)，其意欲涵盖非排他性的包括物。举例而言，含有复数要素的一组合物或制品并不仅限于本文所列出的这些要素而已，而是还可包括未明确列出但却是该组合物或制品通常固有的其他要素。除此之外，除非有相反的明确说明，否则用语“或”是指涵盖性的“或”，而不是指排他性的“或”。例如，以下任何一种情况均满足条件“a或b”：a为真(或存在)且b为伪(或不存在)、a为伪(或不存在)且b为真(或存在)、a和b均为真(或存在)。此外，在本文中，用语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”的解读应视为已具体公开并同时涵盖“由
…
所组成”及“实质上由
…
所组成”等封闭式或半封闭式连接词。
20.在本文中，所有以数值范围或百分比范围形式界定的特征或条件仅是为了简洁及方便。据此，数值范围或百分比范围的描述应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的个别数值，特别是整数数值。举例而言，“1至8”的范围描述应视为已经具体公开如1至7、2至8、2至6、3至6、4至8、3至8等等所有次级范围，特别是由所有整数数值所界定的次级范围，且应视为已经具体公开范围内如1、2、3、4、5、6、7、8等个别数值。除非另有指明，否则前述解释方法适用于本发明全文的所有内容，不论范围广泛与否。
21.若数量或其他数值或参数是以范围、较佳范围或一系列上限与下限表示，则其应理解成是本文已特定公开了由任一对该范围的上限或较佳值与该范围的下限或较佳值构成的所有范围，不论这些范围是否有分别公开。此外，本文中若提到数值的范围时，除非另有说明，否则该范围应包括其端点以及范围内的所有整数与分数。
22.在本文中，在可实现发明目的的前提下，数值应理解成具有该数值有效位数的精确度。举例来说，数字40.0则应理解成涵盖从39.50至40.49的范围。
23.以下具体实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明及其用途。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下具体实施方式或实施例中所描述的任何理论的限制。
24.根据本发明的一个实施方式，其提供了瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备用于改善炎性衰老的化妆品及药物中的用途。
25.根据本发明的一个实施方式，其中，所述炎性衰老是机体由于受到年龄、自身病理产物或外界刺激等因素而造成的炎性衰老损伤。
26.根据本发明的一个实施方式，其中，所述炎性衰老是与细胞因子tnf-α、il-6、il-10的释放有关的炎性衰老。
27.根据本发明的一个实施方式，其中，所述炎性衰老是与il-17a mrna的表达有关的
炎性衰老。
28.根据本发明的一个实施方式，其中，所述炎性衰老是与pi3k/akt信号通路的过度激活有关的炎性衰老。
29.根据本发明的一个实施方式，其提供了高浓度的瓜蒌苦杏仁复方提取物在制备黑色素瘤治疗药物中的用途。
30.根据本发明的一个实施方式，其中，所述高浓度是指瓜蒌苦杏仁复方提取物的浓度大于80μg/ml。
31.根据本发明的一个实施方式，其中，所述瓜蒌苦杏仁复方提取物是指瓜蒌与苦杏仁经过水提取及醇沉除杂后制备的提取物。
32.实施例
33.以下将通过实施例说明本发明的作用。
34.在以下实施例中，瓜蒌苦杏仁复方提取物按照以下方法制备：瓜蒌苦杏仁复方提取物(sg357，生药浓度为8.445g/ml)：将苦杏仁、瓜蒌皮、瓜蒌子以2:1:1的重量比混合(或将苦杏仁与全瓜蒌以1:1的重量比混合)，加入适量去离子水回流提取，放冷，过滤，滤渣再用去离子水回流提取，放冷，过滤，合并两次滤液，然后加入适量无水乙醇搅拌，冷藏，然后抽滤，取上清液浓缩后得到提取物。
35.所使用的巨噬细胞(thp-1、pbmc)和黑色素瘤细胞(b16-f10、a-375)由复旦大学药学院生物药物学系提供。
36.所使用的仪器如下：
37.血球计数板(型号：02270113)：购自上海求精仪器设备有限公司；
38.倒置显微镜(型号：xds-1a)：购自尼康仪器(上海)有限公司；
39.rt-pcr仪器(型号：abi steponeplus)：购自thermo fisher scientific公司；
40.酶标仪(型号：multiskan go)：购自thermo fisher scientific公司；
41.凝胶成像分析系统(型号：universal hood ii)：购自bio-rad公司；
42.流式细胞仪(型号：cytoflex s)：购自贝克曼库尔特公司。
43.所使用的其他试剂如下：
44.rpmi培养基(货号：a1049101)购自gibco公司；
45.胎牛血清(货号：10100147)购自gibco公司；
46.cell counting kit(cck-8)细胞增殖检测试剂盒(货号：c0040)购碧云天生物技术公司；
47.抗p-pi3k抗体(货号：13857s)、抗p-akt抗体(货号：4060s)、抗gapdh抗体(货号：5174s)购自cst公司；
48.细胞因子tnf-αelisa试剂盒(货号：70-ek182-96)、细胞因子il-6elisa试剂盒(货号：70-ek106/2-96)、细胞因子il-10elisa试剂盒(货号：70-ek110/2-96)购自联科生物公司；
49.试剂盒superscripttmiv one-step rt-pcr(货号：12594025)购自thermofisher公司；
50.annexin v-fitc细胞凋亡检测试剂盒(货号：c1062l)购自碧云天公司。
51.实施例1：细胞增殖试验
52.取巨噬细胞(thp-1、pbmc)和黑色素瘤细胞(b16-f10、a-375)，调整细胞浓度，分别以每孔5000个细胞接种到96孔板中，细胞充分贴壁后，除去上层培养基，加入含sg357(1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、80μg/ml)的培养基，另设空白对照组(培养基)及阴性对照组(细胞、培养液)。孵育24h后每孔加入10μl的cck-8溶液。在细胞培养箱内继续孵育4h，在450nm处检测吸光度值。
53.药物影响两种细胞存活率的结果列于图1和图2中。
54.存活率(％)＝(给药组吸光度值-空白组吸光度值)/(阴性对照组-空白组吸光度值)
×
100％。
55.两种细胞试验如下：
56.瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对巨噬细胞的细胞毒作用
57.采用thp-1和pbmc来源的巨噬细胞评价sg357对巨噬细胞的细胞毒作用。如图1所示，与正常对照比较，sg357浓度在1-32μg/ml范围内对巨噬细胞(thp-1)生长没有明显影响；当浓度增加到80μg/ml时，与正常对照比较，巨噬细胞(thp-1)的活力明显下降，差异有统计学差异(*p《0.05)。与正常对照比较，sg357浓度在1-80μg/ml范围内对巨噬细胞(pbmc)生长没有明显影响。本试验结果表明，sg357对巨噬细胞的细胞毒作用较弱。
58.瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对黑色素瘤细胞的增殖作用
59.如图2所示，与正常对照比较，sg357浓度在1-16μg/ml范围内对黑色素瘤细胞b16-f10生长没有明显影响；当浓度增加到32μg/ml时，与正常对照比较，黑色素瘤细胞的活力明显下降，差异有统计学差异(*p《0.05，**p《0.01)。与正常对照比较，sg357浓度在1-32μg/ml范围内对黑色素瘤细胞a-375生长没有明显影响；当浓度增加到80μg/ml时，与正常对照比较，黑色素瘤细胞的活力明显下降，差异有统计学差异(*p《0.05)。本试验结果表明：sg357对黑色素瘤细胞的细胞毒作用较弱，高浓度时能够显著抑制黑色素瘤细胞的增殖。
60.在此，黑色素瘤细胞是判断药物安全性的细胞模型，而非治疗，因此，数据体现出药物是安全的，增殖从化妆品来说是不期望的，相当于不影响其生长。即，瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对于黑色素瘤细胞是大体上惰性的。
61.然而另一方面，该模型也表明在高浓度时，瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对黑色素瘤细胞具有抑制作用，表明了瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对黑色素瘤具有潜在的治疗效果。
62.注：对照组为不造模且不给药、模型组为造模且不给药、给药组为造模且给药。以下实施例均同。
63.实施例2：流式细胞术
64.收集黑色素瘤细胞b16-f10，用pbs轻轻重悬细胞并计数。取1
×
105细胞，在1000g条件下，4℃下离心5min，弃上清，加入195μl annexin v-fitc结合液轻轻重悬细胞。加入5μl annexin v-fitc，轻轻混匀。加入10μl碘化丙啶染色液，轻轻混匀。室温避光孵育20min，上机检测。
65.瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对黑色素瘤细胞凋亡的影响
66.结果如图3所示，与对照组比较，4μg/ml的sg357未显著增加黑色素瘤细胞b16-f10的凋亡细胞比例。
67.这表明在这些浓度范围内，瓜蒌苦杏仁复方提取物对黑色素瘤细胞是惰性的。
68.实施例3：elisa检测
69.收集巨噬细胞培养上清，在300g条件下，4℃下将细胞离心10min，去除沉淀物，立即检测。准备好所有需要的试剂及工作浓度标准品，浸泡酶标板，分别加标准品和样本，加检测抗体孵育1.5h，洗涤后加酶孵育30min，加底物显色，加终止液后在30min之内，使用酶标仪检测，od值为450nm波长下的测定值减去570nm波长下的测定值。
70.瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对lps诱导的巨噬细胞tnf-α，il-6，il-10释放的影响
71.如图4所示，与对照组比较，模型组在lps(100ng/ml)处理24h后，巨噬细胞tnf-α，il-6，il-10的释放显著增加。与模型组比较，2μg/ml和4μg/ml的sg357能抑制lps诱导的巨噬细胞tnf-α，il-6，il-10的释放，其中4μg/ml的sg357作用更加明显，差异具有统计学意义(*p《0.05，**p《0.01)。
72.本试验结果显示：sg357能够显著抑制lps诱导的巨噬细胞tnf-α，il-6，il-10的释放，表明sg357可能通过抑制细胞因子分泌产生抗lps引起巨噬细胞炎症反应。
73.实施例4：rt-pcr试验
74.取生长状态良好的细胞，接种于12孔板中，每孔5
×
104个细胞，细胞悬液1ml。细胞贴壁后更换培养基，药物处理后提取细胞总rna。按照superscripttmiv one-step rt-pcr逆转录试剂盒说明书将rna逆转录成cdna。pcr引物经genebank数据库检索，由生工生物工程有限公司设计合成，以gapdh作为内参(表1)。
75.表1.pcr引物序列
[0076][0077]
瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对lps诱导巨噬细胞炎症模型ikba和il17a mrna表达的影响
[0078]
如图5所示，与对照组比较，lps降低了巨噬细胞ikba mrna的表达；与模型组比较，4μg/ml的sg357逆转了lps对巨噬细胞ikba mrna表达的作用，显著增加了ikba mrna的表达，差异具有统计学意义(**p《0.01)。
[0079]
与对照组比较，lps增加了巨噬细胞il-17a mrna的表达；与模型组比较，2μg/ml和4μg/ml的sg357均有抑制lps诱导巨噬细胞il-17a mrna表达的作用，差异具有统计学意义(*p《0.05，**p《0.01)。
[0080]
本试验结果显示：sg357能够显著增加巨噬细胞炎症模型ikba mrna的表达，同时显著抑制巨噬细胞炎症模型il-17a mrna的表达。
[0081]
实施例5：免疫印迹实验
[0082]
巨噬细胞蛋白样品的准备：细胞经过分组处理后，收集细胞，pbs洗涤一遍，用含有pmsf的ripa强细胞裂解液冰浴条件下裂解细胞30min，然后离心收取上清液。检测蛋白浓度并将样品的浓度调成一致后，加入5
×
上样缓冲溶液，100℃变性后-20℃保存。配制sds-page凝胶(分离胶12％、积层胶5％)，组装电泳仪的电泳装置，加入样品和预染蛋白marker，开始电泳，当溴酚蓝电泳到分离胶底部时，结束电泳。然后取出待转膜的胶，按照“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法制作夹层。转膜结束后，取出pvdf膜，加入适量的bsa封闭液，根据目的蛋白的大小，裁剪出需要的条带，与抗体进行孵育。然后用凝胶成像系统获取图像。
[0083]
瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对lps诱导的巨噬细胞炎症模型p-pi3k、p-akt蛋白表达的影响
[0084]
结果如图6所示，与对照组相比，模型组lps激活了巨噬细胞(thp-1、pbmc)pi3k、akt的磷酸化，引起p-pi3k和p-akt蛋白表达增加。与模型组相比，2μg/ml和4μg/ml的sg357均能降低p-pi3k和p-akt蛋白表达。本部分试验结果表明：sg357能够降低lps诱导的巨噬细胞p-pi3k和p-akt蛋白的表达，可能与其抗炎作用机制有关。
[0085]
以上试验结果表明，瓜蒌苦杏仁复方提取物sg357对巨噬细胞的细胞毒作用较弱。在lps诱导的巨噬细胞炎症模型中，sg357的抗炎作用与抑制tnf-α，il-6，il-10等细胞因子的释放、增加ikba mrna的表达、抑制il-17amrna的表达、抑制pi3k/akt信号通路的过度激活有关。同样，sg357对黑色素瘤细胞的细胞毒作用也较弱，试验条件下没有引起黑色素瘤细胞凋亡。初步研究结果表明，sg357是一种安全的、具有抗炎作用的中药瓜蒌苦杏仁复方提取物，具有治疗炎症相关疾病的潜力，或将其开发为用于改善皮肤炎性状态的功能性化妆品。