一种基于Dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法与流程

一种基于dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法
技术领域
1.本发明涉及循环肿瘤细胞检测的技术领域，特别是一种基于dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法的技术领域。


背景技术：

2.循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, ctcs），即因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶（原发灶或转移灶）脱落而进入外周血液循环中的肿瘤细胞。虽然大部分ctcs在进入外周血液循环中，会被人体免疫系统杀伤、自身发生凋亡或者被血流和血管壁等碰撞而发生破碎，然而仍存在少数ctcs可能逃逸并锚着发展为转移灶，进而增加恶性肿瘤患者的死亡风险。由于ctcs携带肿瘤和转移组织的遗传和表型的生物学信息，因而对ctcs进行检测有助于肿瘤的临床进展、疗效与预后评估以及肿瘤复发监控。
3.目前，有多种针对肿瘤患者血液中的ctcs分离方法，主要包括基于ctcs的生物学特性和物理特性的两大类分离方法，即免疫亲和富集法（根据细胞表面表达的特异性的蛋白将ctcs筛选出来）和物理特性富集法（根据ctcs的大小和密度等特性将ctcs筛选出来）。其中，基于循环肿瘤细胞表面标志物（如上皮肿瘤细胞标志物epcam和间质细胞标志物vimentin等）捕获鉴定ctcs是最主要的方法之一。利用epcam等抗体，并通过流式细胞仪检测、磁珠分选或微流控芯片的方式可对ctcs进行鉴定和捕获分析。以流式细胞仪检测的方法为例，在获得患者的新鲜血液样本后，通过梯度离心等方法富集血液中的单个核细胞，将耦连荧光染料的epcam抗体与细胞样本孵育，再通过流式细胞仪检测荧光染料的信号来鉴定和捕获与epcam抗体结合的ctcs。
4.但是上述现有技术存在的问题和缺点是灵敏度较差，ctcs的检出率低。这是因为血液中的ctcs通常由于表型转化等原因，导致上皮标志物表达水平下降，进而导致存在相当比例的潜在ctcs上的epcam表达水平不高，而这些低表达epcam的ctcs很可能由于检测荧光信号太弱而造成遗漏和检出率下降。


技术实现要素：

5.本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种基于dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，该dodecamer蛋白基于一个四聚体骨架蛋白，利用生物素与链霉亲和素特异性结合的原理最终偶连抗体，可用于检测血液中抗体阳性的ctcs，检测灵敏度高。
6.为实现上述目的，本发明通过以下技术方案来实现：一种基于dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：a)初次孵育：将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：1～8的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到初次孵育产物；b)二次孵育：将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：8～16
的摩尔比例进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到二次孵育产物，即为目标产物dodecamer；c)外周血样本准备：收集受试者的新鲜外周血样本；d)外周血单个核细胞准备：从步骤c)中所收集的新鲜外周血样本内分离出外周血单个核细胞；e)三次孵育：将6～10ul的步骤b)中所制备的dodecamer与3～7ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞进行混合并孵育，孵育时间为0.25～1 h，使二者充分结合，得到三次孵育产物；f)鉴定和分选：检测步骤e)中所制备的三次孵育产物内的对荧光染料呈阳性的细胞群并进行分选，得到目标细胞群；g)染色和鉴定：对步骤f)中所分选的目标细胞群进行免疫荧光染色和荧光原位杂交鉴定。
7.作为优选，在所述步骤a)中，将生物素化的四聚体骨架蛋白与偶连荧光染料的链霉亲和素按1：4的摩尔比例进行混合。
8.作为优选，在所述步骤a)中，荧光染料为pe荧光染料。
9.作为优选，在所述步骤a)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为常温。
10.作为优选，在所述步骤b)中，将步骤a)中所制备的初次孵育产物与偶连生物素的抗体按1：12的摩尔比例进行混合。
11.作为优选，在所述步骤b)中，抗体为epcam抗体。
12.作为优选，在所述步骤b)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为常温。
13.作为优选，在所述步骤e)中，将8ul的步骤b)中所制备的dodecamer与5ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞进行混合。
14.作为优选，在所述步骤e)中，孵育时间为0.5 h，孵育温度为4℃。
15.作为优选，在所述步骤f)中，按照常规流式细胞仪操作方法检测步骤e)中对荧光染料（pe）呈阳性的细胞群并进行分选。
16.本发明的有益效果：本发明引入了一种偶连有epcam抗体的生物蛋白dodecamer，其结构基于一个四聚体骨架蛋白，具有4个半胱氨酸残端，经生物素化处理，可以与4个偶连荧光染料的链霉亲和素结合，而每个链霉亲和素还剩有三个结合位点可以和偶连epcam抗体的生物素再结合，因此dodecamer上共间接偶连有12个epcam抗体分子，同时有4个偶连荧光染料的链霉亲和素，利用该dodecamer与细胞样本结合可以实现在流式细胞仪检测中对目标epcam抗原检测的信号放大作用，从而可显著提高鉴定捕获血液中epcam阳性ctcs的灵敏度，特别是对epcam表达丰度较低的上皮型ctcs能够提高检出率。此外，本发明中dodecamer亦可根据需要，选择不同偶连的荧光染料和目标抗原的抗体，针对其它ctcs表面标志物进行细胞鉴定，具有很大的灵活性。
17.本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
附图说明
18.图1是使用epcam-pe抗体或本发明中epcam-dodecamer检测实施例1肺癌患者（a）
和实施例2乳腺癌患者（b）外周血循环肿瘤细胞的结果；图2（a）使用本发明中epcam-dodecamer分选出实施例1肺癌患者外周血循环肿瘤细胞后免疫荧光染色检测，箭头所示为epcam阳性、ck-18阳性、cd45阴性的目标细胞；（b）使用本发明中epcam-dodecamer分选出实施例1肺癌患者外周血循环肿瘤细胞后荧光原位杂交，箭头所示为异倍体目标细胞；图3是目标细胞的回收率测试结果；图1中：（a）实施例一肺癌患者；（b）实施例二乳腺癌患者；dodecamer为本发明中所构建偶连epcam抗体的检测蛋白；epcam-pe为偶连荧光染料pe的epcam抗体。
19.图2中：（a）实施例一分选细胞免疫荧光染色结果：epcam为抗体（epcam）的荧光显微照片；ck-18为细胞角蛋白18（cytokeratin 18）的荧光显微照片；cd45为白细胞共同抗原的荧光显微照片；dapi为经过荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚（dapi）染色的dna的荧光显微照片；merge为上述荧光显微照片的叠合照片；（b）实施例一分选细胞荧光原位杂交结果。
20.图3中：将不同比例的胰腺癌细胞系bxpc3混入健康人外周血单个核细胞中；hpbmcs为不混有bxpc3细胞的外周血单个核细胞；0.01% bxpc3 in hpbmcs为bxpc3与pbmcs按1：10000混合；0.1% bxpc3 in hpbmcs为bxpc3与pbmcs按1：1000混合；1% bxpc3 in hpbmcs为bxpc3与pbmcs按1：100混合；10% bxpc3 in hpbmcs为bxpc3与pbmcs按1：10混合；bxpc3为不加入hpbmcs的纯bxpc3。
具体实施方式
21.实施例一、对一例肺癌患者进行血液内循环肿瘤细胞的检测：一种基于dodecamer蛋白的血液内循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：（一）dodecamer构建：a)初次孵育：将生物素化的四聚体骨架蛋白（scaffold）与偶连荧光染料（pe）的链霉亲和素（sa）按1：4的摩尔比例进行混合并孵育，室温下孵育时间为0.5 h，使二者充分结合，得到初次孵育产物（scaffold pe-sa）；b)二次孵育：将步骤a)中所制备的初次孵育产物（scaffold pe-sa）与偶连生物素（biotin）的抗体（epcam）按1：12的摩尔比例进行混合并孵育，室温下孵育时间为0.5 h，使二者充分结合，得到二次孵育产物（scaffold pe-sa biotin-epcam），即为目标产物dodecamer；（二）受试者血样本处理：c)外周血样本准备：收集新鲜的肺癌受试者的外周血样本5ml，两份；d)外周血单个核细胞准备：采用常规梯度离心的方式从步骤c)中所收集的新鲜外周血样本内分离出外周血单个核细胞（pbmcs）；e)三次孵育：将8ul的步骤b)中所制备的二次孵育产物dodecamer（scaffold pe-sa biotin-epcam）与5ml的步骤d)中所分离的外周血单个核细胞（pbmcs）进行混合并孵育，孵育时间为0.5 h，孵育温度为4℃，使二者充分结合，得到三次孵育产物；f)对照：将直接偶连荧光染料（pe）的抗体（epcam）与步骤d)中所获取的另一份外周血单个核细胞（pbmcs）混合并孵育，作为对照组；
（三）ctcs检测与鉴定：g)鉴定和分选：按照常规流式细胞仪操作方法，检测步骤e)中所制备的三次孵育产物内以及步骤f)所制备的对照组内对荧光染料（pe）呈阳性的细胞群并进行分选，分别得到目标细胞群，结果如图1所示，分选出0.2%的阳性细胞；h)免疫荧光染色鉴定：对步骤g)中所分选出的阳性细胞进行上皮标志物免疫荧光染色，采集照片，鉴定到目标细胞（epcam阳性，ck-18阳性，cd45阴性）；i)荧光原位杂交鉴定：对步骤g)中所分选出的阳性细胞进行染色体荧光原位杂交，采集照片，鉴定到目标细胞（异倍体细胞）（图2）。
22.实施例二、对一例乳腺癌患者进行血液内循环肿瘤细胞的检测：a)血样本准备：收集新鲜的乳腺癌受试者的外周血样本5ml，两份；其他同实施例一。
23.如图1所示，分选出0.2%的阳性细胞。
24.实施例三、检测方法的灵敏度测试：将epcam表达阳性的胰腺癌细胞（bxpc3）与pbmcs按不同比例（1：10、1：100、1：1000以及1：10000）混合。然后使用本技术的基于dodecamer蛋白的信号放大系统对上述细胞样本进行流式细胞仪检测分析，如图3所示，可以得到很好的目标细胞回效率。
25.上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。