一种斑马鱼肥胖模型的构建方法与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种斑马鱼肥胖模型的构建方法。


背景技术：

2.肥胖是一种由遗传因素、环境因素等多种原因相互作用而引起的慢性代谢性疾病，其发生机理是能量摄入超过消耗，导致体内脂肪过度蓄积和体重超过理想20％以上。目前，肥胖已经成为全球患病数量最多的慢性疾病之一。
3.动物模型是研究肥胖的一种不可或缺的手段及方法，受到越来越广泛的关注。采用斑马鱼替代传统的大小鼠的造模方法，符合动物保护原则，存在降低造模成本、缩短造模周期、对药物反应敏感等诸多优势，一直是学界研究是对象。
4.公开号为cn 109906979 a的专利说明书公开了一种斑马鱼高胆固醇模型建立的方法包括如下步骤：s1、斑马雌雄成鱼以1:2～2:3的比例置于交配盒，交配后收卵，将健康的卵在28℃恒温培养，5天后显微镜下挑选健康斑马鱼幼鱼；s2、在蛋黄粉中添加胆固醇制作高胆固醇饲料，将不添加胆固醇的蛋黄粉作为普通饲料，用于饲养所述健康斑马鱼幼鱼；s3、将斑马鱼幼鱼用高胆固醇饲料连续培养后，同时用普通饲料喂养的斑马鱼幼鱼作为对照组，斑马鱼血管胆固醇积累量显著性高于对照组时，斑马鱼高胆固醇模型建成。该专利技术采用乙醚为助溶剂，且没有造模动物生存率测试。
5.浙江大学徐剑2018年硕士论文进行了《环境内分泌干扰物诱导肥胖的斑马鱼模型研究》，其公开了致肥物bpa(双酚a)、dehp(邻苯二甲酸二异辛酯)分别在50μg/l、100μg/l浓度，对受精后7-30天的斑马鱼幼鱼持续暴露，可引起斑马鱼脂代谢异常，bpa中、高剂量组bmi中、高剂量组高脂率分别为81％、84％，dehp中、高剂量组高脂率分别为83％、89％；该研究中斑马鱼幼鱼的存活率最高仅83％，且死亡原因不清楚是药物原因还是自身原因。
6.成功率高的斑马鱼造模主要采用特殊食物诱导和单一化学物诱导，均存在时间长、效果差、死亡率高等弊端。
7.bpa和dehp普遍应用于塑料工业，是全球最普遍的污染物之一，是两种有致肥作用的环境内分泌干扰物，具有明确的生殖毒性。本发明联合使用两种化学物质和膳食诱导，效果好、死亡率低、可操作性强，尚无报道应用。


技术实现要素：

8.针对上述技术问题以及本领域存在的不足之处，本发明提供了一种斑马鱼肥胖模型的构建方法，成模率高、造模周期短、可操作性强。
9.一种斑马鱼肥胖模型的构建方法，包括：将斑马鱼雌雄成鱼置于交配盒，交配后收卵，将健康的卵恒温培养孵化，受精后挑选健康斑马鱼幼鱼；bpa和dehp以丙酮助溶配成混合水溶液，用于饲养所述斑马鱼幼鱼；孵化后起投喂熟鸡蛋黄，直至受精后第21天，斑马鱼肥胖模型建成。
10.本发明通过联合化学物诱导、优选助溶剂等方式协同作用，缩短了造模时间、降低
了模型动物的死亡率，并且效果也更为显著。
11.所述的斑马鱼肥胖模型的构建方法，优选采用ab品系斑马鱼雌雄成鱼。
12.作为优选，所述雌雄成鱼中雄、雌比例为2:1。其有益效果是雌鱼受精比例高。
13.所述的斑马鱼肥胖模型的构建方法，优选受精后第5-7天挑选健康斑马鱼幼鱼。其有益效果是增加斑马鱼的存活率。
14.作为优选，所述bpa和dehp以丙酮助溶配成混合水溶液的具体方法包括：bpa、dehp均以丙酮助溶，分别配成浓度25μg/l和50μg/l溶液，各溶液中丙酮的体积分数均不大于1
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，然后将两种溶液等体积混合均匀，连续搅拌曝气24h得到所述混合水溶液。其有益效果是联合用药发挥了两种致肥物的协同效应，快速引发动物脂代谢异常，缩短致肥时间，减少了药物作用时间，从而提升了存活率；通过优选丙酮作助溶剂一方面减少了对斑马鱼毒副作用，也提升存活率，另一方面可更好地发挥bpa、dehp的协同作用。
15.作为优选，所述混合水溶液用于饲养所述斑马鱼幼鱼时，每天1次更换1/2的所述混合水溶液。其有益效果是在维持药物浓度恒定的同时，最大化减少了换水带来的环境改变对存活率的影响。
16.所述的斑马鱼肥胖模型的构建方法，优选斑马鱼孵化条件：经活性炭除氯曝气的自来水，ph值为6.5-7.5，溶解氧10.5
±
0.5mg/l，硬度以caco3计为200-250mg/l，水温27
±
1℃。其有益效果是斑马鱼处于较为适宜的生存环境，提高存活率。
17.所述的斑马鱼肥胖模型的构建方法，孵化后起每天2次投喂熟鸡蛋黄，每次投喂量以5分钟内吃完且不留残渣为限。其有益效果是通过恒定一致的食物给与，在保证斑马鱼生存的同时，减少因食物改变因素而导致的死亡。
18.本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明构建的斑马鱼肥胖模型，具有成模率高、动物死亡率低、成模时间短、经济性好、效率高的优点，可为环境内分泌干扰物的毒性评估和机制研究，以及治疗药物筛选等方向提供方便、快捷、高效的研究工具。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
20.实验动物：
21.ab品系斑马鱼，购自国家斑马鱼资源中心。
22.实验仪器：
23.光学显微镜(olympus)，酶标仪(上海科华实验系统有限公司)，冰冻切片机(莱卡)，电子天平(梅特勒)，恒温磁力搅拌器(常州诺基仪器有限公司)，游标卡尺(上海首丰)。
24.实验材料：
25.甘油三酯检测试剂盒(南京建成生物制品公司)，bpa(国药集团化学试剂有限公司)，dehp(国药集团化学试剂有限公司)，市售鸡蛋。
26.实施例1
27.将ab品系斑马鱼10尾雄斑马鱼和5尾雌斑马鱼置于交配盒，交配后收卵。将健康的卵恒温培养于ph值为6.5-7.5，溶解氧10.5
±
0.5mg/l，硬度200-250mg/l(以caco3计)，水温
27
±
1℃的经活性炭除氯曝气的自来水中孵化。受精后第7天挑选健康的斑马鱼幼鱼200尾，随机分成2组，饲于玻璃缸(10l)，一组为处理组，一组为溶剂对照组。处理组，bpa、dehp均以丙酮助溶，分别配成浓度25μg/l和50μg/l溶液，各溶液中丙酮的体积分数均不大于1
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，然后将两种溶液等体积混合均匀，连续搅拌曝气24h得到混合水溶液，用于饲养所述斑马鱼幼鱼，每天1次更换混合水溶液的1/2。溶剂对照组不含bpa和dehp，其他处理同处理组。斑马鱼孵化后投喂熟鸡蛋黄，直至受精后第21天斑马鱼肥胖模型建成，投喂量以5分钟吃完不留残渣为限，每天2次。
28.诱导结束后第2天，处理组动物存活率95％，对照组动物存活率96％，差异无显著性。采用酶联免疫法测定斑马鱼全身组织中甘油三酯(tg)，测得处理组tg为38.5μmol/g prot，对照组tg为18.0μmol/g prot，差异有极显著性意义。
29.可见，本发明利用bpa和dehp联合使用造模方法是可行的，可作斑马鱼肥胖模型快速、经济的制作方法，用于环境内分泌干扰物的毒性评估和机制研究，以及治疗药物筛选。
30.对比例1
31.方法源于浙江大学徐剑2018年硕士论文《环境内分泌干扰物诱导肥胖的斑马鱼模型研究》，采用健康的斑马鱼幼鱼200尾，随机分成2组，饲于玻璃缸(10l)，一组为处理组，一组为溶剂对照组。bpa以dmso助溶，配成终浓度为25μg/l的水溶液，溶液中dmso的体积分数为3
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，用于饲养所述斑马鱼幼鱼，每天1次更换溶液。溶剂对照物不含bpa，其他处理同处理组。受精后第5天的幼鱼投喂larval ap100(30mg/d)，受精后第9天天投喂丰年虫，受精后第14天后在水中曝气饲养，直至受精后第21天。在造模后第2天，处理组动物存活率74％，对照组动物存活率86％，差异有显著性。采用酶联免疫法测定斑马鱼全身组织中tg，测得处理组tg为17.5μmol/g prot，对照物tg为18.0μmol/g prot，差异无显著性意义，造模不成功。
32.对比例2
33.方法源于浙江大学徐剑2018年硕士论文《环境内分泌干扰物诱导肥胖的斑马鱼模型研究》，采用健康的斑马鱼幼鱼200尾，随机分成2组，饲于玻璃缸(10l)，一组为处理组，一组为溶剂对照组。dehp以dmso助溶，配成终浓度为50μg/l的水溶液，溶液中dmso的体积分数为3
×
10-5
，用于饲养所述斑马鱼幼鱼，每天1次更换溶液。溶剂对照物不含dehp，其他处理同处理组。斑马鱼孵化后受精后第5天后投喂larval ap100(30mg/d)，受精后第9天投喂丰年虫，受精后第14天后在水中曝气饲养，直至受精后第21天。在造模后第2天，处理组动物存活率76％，对照组动物存活率83％，差异无显著性。采用酶联免疫法测定斑马鱼全身组织中tg，测得处理组tg为18.5μmol/g prot，对照物tg为19.1μmol/g prot，差异无显著性意义，造模不成功。
34.由以上试验结果可知，本发明方法用时短，仅仅需要21天，而且造模动物生存率高，达95％，浙江大学徐剑硕士论文《环境内分泌干扰物诱导肥胖的斑马鱼模型研究》的方法，需要30天，造模动物生存率最高仅为76％，且本发明饲料源于生活日常，获取简单经济，成本低。综上所述，本发明的肥胖斑马鱼造模方法具有用时更短、更经济、造模效率更高的优点，产生了显著的技术效果。
35.此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。