尿液中生物标志物检测试剂在制备预测新冠肺炎神经精神后遗症的试剂盒中的用途

1.本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及尿液中生物标志物检测试剂在制备预测新冠肺炎感染后遗症的试剂盒中的用途。


背景技术：

2.2019年爆发的新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，covid-19)是由新型冠状病毒引起的以肺炎为主的异类传染病，目前有研究报道，新型冠状病毒肺炎患者愈后部分会表现出明显的后遗症。taquet m等，新型冠状病毒肺炎确诊后6个月内神经和精神疾病高发[j]，中华医学杂志，2021,101(19),1414，通过对新冠肺炎感染确诊者恢复出院6个月后随访统计发现，产生神经或精神疾病相关后遗症的发生率为33.62％，对于危重患者确诊的估计发生率为46.42％。
[0003]
目前还没有能预测新冠病毒肺炎感染后遗症的研究，更没有能准确预测新冠病毒肺炎感染者愈后神经精神后遗症症状的试剂或装置的报道。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种新的预测新冠肺炎后遗症的生物标志物，以及该标志物的检测试剂在制备预测新冠肺炎后遗症的试剂盒和/或装置中的用途。
[0005]
本发明的技术方案包括：
[0006]
一种尿液中生物标志物检测试剂在制备预测新冠肺炎后遗症的试剂盒和/或装置中的用途，所述生物标志物为氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇。
[0007]
进一步地，所述尿液中生物标志物检测试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂，优选高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
[0008]
进一步地，所述新冠肺炎后遗症为神经精神症状；所述神经精神症状包括歧视、冷漠和记忆衰退。
[0009]
本发明还提供了一种用于预测新冠肺炎后遗症的试剂盒，它包括用于检测尿液中生物标志物的试剂；所述生物标志物为氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇。
[0010]
进一步地，所述检测尿液中生物标志物的试剂为液相色谱-质谱分析试验用试剂，优选，高效液相色谱-飞行时间质谱分析试验用试剂。
[0011]
本发明还提供了一种用于预测新冠肺炎后遗症的装置，所述装置包括：
[0012]
1)检测装置；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基
苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇；
[0013]
2)分析装置；
[0014]
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果；
[0015]
所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎愈后神经精神症状群体尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇的检测结果，得到预测新冠肺炎愈后是否表现出神经精神症状症状的二分类模型；
[0016]
所述分析装置还能将待检者尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇的检测结果代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎愈后神经精神症状群体尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇检测结果的相似度分数，得出新冠肺炎愈后是否表现出神经精神症状。
[0017]
进一步地，所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪。
[0018]
进一步地，所述检测结果为生物标志物的丰度值。
[0019]
进一步地，所述机器学习算法为随机森林算法。
[0020]
进一步地，所述新冠肺炎愈后神经精神症状包括歧视、冷漠和记忆衰退。
[0021]
本发明最后提供了一种前述的装置在制备预测新冠肺炎后遗症的设备中的用途。
[0022]
本发明用尿液中7种代谢物作为预测新冠肺炎后遗症的生物标志物，可有效判断新冠肺炎患者愈后是否表现出神经精神症状，为新冠肺炎患者愈后精神疾病的预防和治疗提供了依据，同时，由于是以尿液为检测样本，极大方便了样本采集，降低了新冠病毒传播，提高了待检者的顺应性，方便了医疗机构开展新冠肺炎后遗症筛查工作，具备实际推广应用的价值。
[0023]
本发明的关键在于对待检测尿液生物指标物的集合，不在于检测生物标志物的具体技术手段，因为具体检测生物标志物的技术手段都是本领域常规手段。检测尿液中氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇这7个生物标志物的试剂，在用于制备预测新冠肺炎后遗症的试剂盒的用途，无论具体试剂是什么，均在本发明的保护范围内。
[0024]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0025]
以下通过具体实施方式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0026]
图1尿液代谢物能有效预测新冠肺炎感染者神经精神后遗症的不良预后展示图。
[0027]
(a.使用7种尿液代谢物，在149例发生或不发生神经精神症状不良预后的新冠患者中进行预测，曲线下面积(auc)为0.931；b.预测模型与真实发生情况的混淆矩阵；c.7种
尿液代谢物作为诊断模型的诊断效果；occur：新冠肺炎感染者出院半年后发生神经精神症状不良预后；not occur：新冠肺炎感染者出院半年后不发生神经精神症状不良预后；误诊率(misdiagnosis rate)：16.44％；漏诊率(missed diagnossis rate)：14.47％；约登指数(youden index)：0.69；标志物个数(panel size)：7个。注释：假如a是患者被诊断为阳性的例数，即真阳性；b是非患者被诊断为阳性的例数，即假阳性；c是患者被诊断为阴性的例数，即假阴性；d是非患者被诊断为阴性的例数，即真阴性。误诊率(％)＝b/(b d)
×
100％，漏诊率(％)＝c/(a c)
×
100％，约登指数＝a/(a c) d/(b d)－1)
具体实施方式
[0028]
实施例1本发明用于预测新冠肺炎感染后遗症的装置
[0029]
1)检测装置；所述检测装置包括高效液相色谱-飞行时间质谱仪；所述检测装置内置检测尿液中如下生物标志物的试剂：氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇；
[0030]
2)分析装置；
[0031]
所述分析装置内置数据输入端口，用于接收前述检测装置的检测结果生物标志物的丰度值；
[0032]
所述分析装置内置机器学习算法，可基于已知新冠肺炎愈后神经精神症状群体尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇的丰度值，得到预测新冠肺炎愈后是否表现出神经精神症状的二分类模型；
[0033]
所述分析装置还能将待检者尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇的丰度值代入前述二分类模型，计算与已知新冠肺炎愈后神经精神症状群体尿液的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇的丰度值的相似度分数，得出新冠肺炎愈后是否表现出神经精神症状；
[0034]
所述神经精神症状为歧视、冷漠和记忆衰退。
[0035]
以下通过试验例进一步说明本发明的有益效果
[0036]
试验例1尿液中生物标志物氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇与新冠肺炎后遗症的关系研究。
[0037]
一、临床资料
[0038]
本发明共纳入sars-cov-2感染患者248例，其中非重症患者(包括轻、中度患者)161例，无症状患者60例，重症患者(包括重症和危重型患者)27例。健康组(hc)为102例的健康人群，其中女性40例，男性62例，中位年龄41.0岁。hc组与covid-19组无人口学差异(性别：p＝0.125，卡方检验；年龄：p＝0.952，t检验)。收集重庆市公共卫生医疗中心248例新冠肺炎患者的横断面尿液样本。
[0039]
二、病人出院后随访
[0040]
针对covid-19患者出院后可能会发生的20种精神类后遗症和9种神经相关身体后遗症(表1)，在研究中，由训练有素的医务人员通过电话设定的随访。如果错过了随访预约，患者将有三次机会重新安排就诊时间。151名新冠肺炎感染者在出院后6个月接受电话问卷调查。所有的随访者都完成了一系列的问卷调查，包括中文版一般焦虑障碍量表(gad-7)、患者健康问卷(phq-9)和创伤后应激障碍(ptsd)问卷(the ptsd checklist-civil version,pcl-c)。当得到的分数高于普遍接受的标准分界点时(gad-7≥10；phq-9≥10；pcl-c≥38)，就被认为属于病理范围。
[0041]
[0042][0043]
二、用于代谢组学的尿液样本制备
[0044]
所有covid-19患者和hc的尿样rt-pcr均为阴性。尿液样本56℃灭活灭菌30min，并
进行一些修饰前处理。150微升的尿液样本、450微升甲醇-氯仿混合物溶液(甲醇和氯仿的体积比是1：2)和10微升的内参溶液(0.3毫克/毫升2-cl-phe，甲醇作为溶剂)混匀，放置在-20℃2h，收集150微升上清液，用于uplc-q-tof/ms检测，-80℃保存，待分析。取每个代谢产物样品的等份上清(10微升)汇集在一起作为质量控制样品(qc)。
[0045]
三、高效液相色谱/飞行时间质谱分析(uplc-q-tof/ms)
[0046]
代谢产物样品应用uplc-q-tof/ms分析，采用waters i-class acquity uplc(waters,uk) vion ims qtof(waters，uk)，beh酰胺柱(100mm
×
2.1mm，1.7μm)(waters，uk)进行hilic分离。流动相a为10mm甲酸铵水溶液，流动相b为乙腈与10mm甲酸铵水溶液(乙腈与水的体积比为95：5)。在以下条件下，梯度洗脱分离代谢产物：0.0min，92％b；0.5min，92％b；5.0min，80％b；9.0min，70％b，10.0min，50％b；11.0min，20％b；12.0min，20％b；12.5分钟，92％b；15.0min，92％b；流速0.4ml/min。柱内注射2μl，柱温保持在45℃。加热电喷雾电离(hesi)质谱在正负两种模式下工作。
[0047]
仪器参数如下：加热器温度350℃；护套气流量，50arb；辅助气体流量，15arb；喷雾电压，3.2kv(正模式)和2.8kv(负模式)；毛细管temp，320℃；s-lens射频，50％；ms1扫描范围，67-1000。全扫描分辨率，70000；ms/ms的分辨率，17500。
[0048]
四、代谢组学分析
[0049]
通过代谢组学处理软件progenesis qi(waters corporation)进行基线过滤、峰识别、整合、保留时间校正、峰对齐和归一化，利用原始数据获得保留时间、质量-电荷比和峰强度的数据矩阵。准确识别的分子通过kegg代谢途径数据库进一步注释。生物功能分析采用在线软件metaboanalyst 5.0。利用在线数据库ipa version 13.0提供代谢物的疾病相关信息。
[0050]
将归一化代谢产物数据矩阵导入simca-p 14.0软件包(umea,umea,sweden)进行无监督主成分分析(non-supervised principal components analysis,pca)，观察样本的总体分布和分析过程的稳定性。然后，使用监督(正交)偏最小二乘法(o)pls-da来区分总体代谢谱的差异，并识别组间的代谢产物差异。在预测变量重要度(vip)得分大于1的变量被认为是差异变量。为防止模型过拟合，采用7个交互验证周期和200个响应排序试验对模型的质量进行了研究。
[0051]
通过对151例病人出院后半年内的随访结果，发现新冠病人愈后仍会出现精神和身体上的后遗症，主要包括20种精神类后遗症和9种身体上后遗症。在院期间具有临床症状的病人在出院后，“歧视”、“冷漠”和“记忆力衰退”三类后遗症具有更高风险。进一步采用多元统计方法评估整体代谢组学特征发现，出院后表现出神经精神症状的新冠患者与出院后未表现出神经精神症状的新冠患者，其在院期间尿液呈现41种差异代谢物。
[0052]
五、尿液代谢物标志物组的建立
[0053]
使用一个随机森林分类器(python的scikit-learn包)来识别具有潜在预测价值的代谢物，生成分类模型，并评估预测器的性能。获得受试者工作特征(receiver operating characteristic,roc)曲线(medcalc v19)用于显示所构建的模型，然后用曲线下面积(area under the curve,auc)表示roc效应(图1a)。此外，通过误诊率、漏诊率和约登指数(yi)来评估covid-19患者中存在的潜在生物标志物的预测效果。所有筛选模型采用五倍交叉验证作为内部验证。为了调整合并症(高血压和糖尿病)的贡献，我们进行了额外
的统计，排除了高血压或糖尿病患者。当代谢物在无合并症患者和hc之间的比较变得不显著时，将其排除。
[0054]
通过随机森林分类器，使用并量化了41种差异尿液代谢物对新冠肺炎愈后是否表现出神经精神症状的临床诊断筛查能力。经过反复优化，确定了包含7种尿液微生物代谢物(氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇)的二分类模型，它可以有效地预测新冠肺炎后遗症，即神经精神症状“歧视”、“冷漠”和“记忆衰退的发生。
[0055]
六、模型准确性验证
[0056]
选76例表现出不良预后风险的新冠患者和73例未表现出不良预后风险的新冠患者尿液，采用高效液相色谱/飞行时间质谱分析检测尿液中的氧代戊二酸，4-烯-丙戊酸，吲哚丙酮酸，5'-(3',4'-二羟基苯基)-γ-戊内酯硫酸盐，4-羟基-5-(二羟基苯基)-戊酸-o-硫酸盐，对甲酚硫酸盐，1-磷酸肌醇七种代谢物。将代谢物高效液相色谱/飞行时间质谱分析检测丰度，输入二分类模型，通过模型计算样品中七种代谢物丰度值与新冠肺炎后遗症“歧视”、“冷漠”和“记忆衰退患者的相似度分数，并根据相似度分数与0.5的大小关系预测新冠肺炎愈后神经精神症状。验证结果如下：76例发生了神经精神不良预后的患者中，65人(86％)被准确预测(二分类模型得分》0.5)；73例未发生神经精神不良预后的患者中，61人(84％)被准确预测(二分类模型得分《0.5)；使用python的scikit-learn包计算综合预测准确率为0.8456375838926175(图1b-c)。
[0057]
综上，本发明用尿液中7种代谢物作为预测新冠肺炎后遗症的生物标志物，可有效判断新冠肺炎患者愈后是否表现出神经精神症状，为新冠肺炎患者愈后精神疾病的预防和治疗提供了依据。