五味子甲素的医药用途

1.本发明属于医药领域，具体涉及五味子甲素的新应用。


背景技术：

2.肥胖已经成为威胁人类生命健康和生活质量的主要公共健康问题之一。肥胖可以诱使相关严重并发症的发生，如ⅱ型糖尿病、非酒精性脂肪肝、心血管疾病等。根据国际卫生部预测， 2030年肥胖患者可能超过10亿人。因此，寻找治疗肥胖、改善并发症的新型治疗策略俨然已经成为亟待关注和研究的科学问题。
3.非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，nafld)是一种与胰岛素抵抗和遗传易感密切相关的代谢应激性肝损伤，是肥胖诱发的主要并发症之一。其疾病谱为单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)、肝硬化到肝癌。非酒精性脂肪肝目前已成为危害全球生命健康的主要慢性疾病之一。
4.fxr是配体激活的转录因子，属于核受体超家族成员之一，因其转录活性可被超生理浓度的法尼醇增强而命名。fxr是由nr1h4基因编码，其在肝脏、肠道、肾脏和肾上腺高表达，可被内源性配体胆汁酸激活，其中鹅脱氧胆汁酸(chenodeoxycholic acid，cdca)为激动活性最强的配体。配体激活后的fxr通过对靶基因的调节，在甘油三酯，胆汁酸和糖代谢中发挥重要作用。fxr能通过对胆汁酸和脂蛋白的直接和间接调控而调节胆固醇以及甘油三酯 (tg)的合成转运和分解代谢：(1)fxr能诱导小异二聚体伴侣分子(small heterodimer partner， shp)的表达，可下调甾醇调节元件结合蛋白1c(stero1 regulatory element-binding proteins， srebp-lc)的表达，从而抑制肝脏tg的合成。(2)fxr可上调磷脂转运蛋白(phospholipidtransfer protein，pltp)转录，加速肝脏对高密度脂蛋白(high density lipoprotein，hdl)中脂质的摄取和清除；(3)fxr可诱导黏结蛋白聚糖-1(syndecan-1，sdc1)的转录，降低血浆tg；(4)fxr能诱导载脂蛋白cii(apoc-ii)的表达，进而激活脂蛋白脂肪酶，水解乳糜微粒中的脂类成分，加速清除体内tg；(5)过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子-1α (peroxisomeproliferators-activatedr receptor-γcoactivator-1α，pgc-1α)也可作为fxr的辅激活因子参与减少肝脏tg合成，增加tg清除，并促进pgc-1α介导的脂肪酸β氧化。fxr 作为胆汁酸核受体，是近年来报道治疗非酒精性脂肪性肝炎药物研发的热门靶点之一，它通过对细胞内的信号调控参与多种代谢通路的调节。肝脏fxr激动能改善非酒精性脂肪性肝炎，而肠道fxr激动能通过fxr-fgf15信号传导，改善肝脏糖脂代谢，同时能增加能量代谢而减轻体重。因此，寻找开发肠道fxr激动剂为肥胖和非酒精性脂肪肝的治疗提供了新的思路和方向。
5.五味子甲素(schisandrin a)是一种天然的木脂素类化合物，主要存在于五味子中。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种五味子甲素的新用途。
7.具体来说，本发明提供了一种五味子甲素在制备降脂药物中的应用。
8.在一优选例中，所述五味子甲素是作为唯一的活性成分用于制备降脂药物。
9.本发明还提供了五味子甲素在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用。
10.在另一优选例中，所述五味子甲素是作为唯一的活性成分用于制备治疗非酒精性脂肪肝的药物。
11.本发明各个方面的细节将在随后的章节中详尽描述。通过下文以及权利要求的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
附图说明
12.图1体现了五味子甲素对fxr转录活性的影响；与dmso组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001；
13.图2体现了五味子甲素对fxr靶基因调控的影响；(a)五味子甲素scha对小鼠肝原代细胞 fxr靶基因的影响；(b)五味子甲素scha对小鼠肠道细胞系mode-k细胞fxr靶基因的影响； (c)对fgf15蛋白分泌的影响；与dmso组比较，
*
p《0.05，
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p《0.01，
***
p《0.001；
14.图3体现了五味子甲素对nafld小鼠脂质代谢的影响；(a)体重；(b)摄食量；(c)肝重体重比；(d)肝脏中甘油三酯含量；(e)肝脏he染色及油红o染色代表图(放大倍数：200 倍)；与gan组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001。
15.gan：高脂高糖高胆固醇饲料诱导模型组；
16.图4五味子甲素对nafld小鼠葡萄糖代谢的影响；(a)空腹血糖；(b)葡萄糖耐量实验(gtt)； (c)gtt的曲线下面积；(d)血清中胰岛素含量；(e)胰岛素耐受实验(itt)；(f)itt 的曲线下面积；与gan组比较，
*
p《0.05，
**
p《0.01，
***
p《0.001。
17.图5体现了五味子甲素组织分布的变化；
18.图6体现了五味子甲素对nafld小鼠代谢表型的改善依赖于肠道fxr的调控作用；a：体重；b：肝重体重比；c：肝脏he染色及油红o染色代表图(放大倍数：200倍)；与gan 组比较，
**
p《0.01；
19.图7五味子甲素4.3mg/kg剂量对nafld小鼠代谢表型的影响。(a)体重；(b)肝重体重比； (c)肝脏中甘油三酯含量；(d)葡萄糖耐量实验(gtt)；(e)胰岛素耐受实验(itt)。
具体实施方式
20.本发明基于五味子甲素(scha)体外筛选结果，确定五味子甲素为胆汁酸核受体fxr 的激动剂。基于fxr为非酒精性脂肪性肝炎药物研发的热门靶点，我们进一步评价五味子甲素(sch a)对高脂高糖高胆固醇饮食诱导的非酒精性脂肪肝小鼠的影响，结果显示其能显著抑制非酒精性脂肪肝小鼠体重增加，改善肝脏脂质累积和葡萄糖代谢。同时，机制研究结果表明，五味子甲素可能通过激动肠道fxr改善非酒精性脂肪肝小鼠代谢表型。因此，五味子甲素(sch a)可以用于治疗肥胖及非酒精性脂肪肝相关疾病。
21.进而本发明提供了五味子甲素(scha)在制备治疗肥胖及非酒精性脂肪肝相关疾病的药物中的应用。
22.本发明的五味子甲素(schisandrin a)的分子式为：c
24h32
o6，分子量为：416.51，其结构式如下：
[0023][0024]
本发明的五味子甲素可用本领域的常规方法从五味子中提取获得。亦可通过商业途径购买获得。其纯度均符合药用标准。五味子甲素的纯度以》98％最佳。
[0025]
以将本发明的五味子甲素(scha)制成药物为例。本发明的五味子甲素(scha)可以单独使用或以药物组合物的形式使用。药物组合物包括作为主要活性成分的本发明的五味子甲素(scha)及可药用载体。通常，本发明的药物组合物应当含有0.1-99.9％重量百分比的本发明的活性天然成分五味子甲素(scha)。“可药用载体”不会破坏本发明的五味子甲素(scha) 的药学活性；同时，其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒害作用。
[0026]
所述可药用载体包括但不限于：软磷脂、硬脂酸铝、氧化铝、离子交换材料、自乳化药物传递系统、吐温或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如磷酸盐、氨基乙酸、山梨酸、水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅酸镁、饱和脂肪酸部分甘油酯混合物等。
[0027]
其他常用的药物辅料如粘合剂(如微晶纤维素)、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳糖和乳糖珠粒)、崩解剂(如交联pvp、交联羧甲基淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠、低取代羟丙基纤维素)以及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释剂、润湿剂等。
[0028]
本发明的五味子甲素(scha)以及其药物组合物可按本领域常规方法制备并通过胃肠道途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂等。因此，本发明的五味子甲素(scha)以及其药物组合物的给药途径应选择口服递药途径。
[0029]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计。
[0030]
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0031]
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
[0032][0033]
实施例一、五味子甲素降脂和治疗非酒精性脂肪肝的活性研究
[0034]
1.材料与试剂
[0035]
1.1主要仪器和设备：
[0036]
细胞培养箱、生物安全柜(esco，sg)；倒置显微镜(olympus，jpn)；细胞计数仪(同仁， jpn)；蠕动泵(雷弗，chn)；分析天平(上海菁海仪器，chn)；多功能酶标仪(tecan， jpn)；超纯水系统(millipore，usa)；冷冻离心机(eppendorf，usa)；g154dw立式自动压力蒸汽灭菌锅(schneider electric，fr)；4℃冰箱、-80℃低温冰箱、pcr扩增仪、nanodrop 微量紫外分光光度仪、quantstudio
tm
6flex实时荧光定量pcr仪(thermo，usa)；涡旋震荡仪、微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器，chn)；多功能酶标仪(pe，usa)。
[0037]
1.2主要试剂与耗材
[0038]
五味子甲素(分子量：416.51，hplc纯度≥99％)：南京广润生物制品有限公司(中国，南京)，批号：gr-138-210903；william’e培养基、p/s、dmem培养基、dpbs、trypsin、胎牛血清、rpmi1640培养基(gibco，usa)；gw4064、l-谷氨酰胺、dmso(sigma，usa)； luciferase试剂盒(promega，usa)；转染试剂(invitrogen，usa)；引物(上海捷瑞，chn)；无水乙醇、氯仿(国药，chn)；hbss、1m hepes(hyclone，usa)；etga(thermo， usa)；rna提取试剂盒(ezbioscience，usa)；prime script tm
rt
mastermix、sybr green (takara，jpn)；384反应板、透明粘性封板膜(applied biosystems，usa)；fgf15酶联免疫试剂盒(武汉华美，chn)；depc水、bca 蛋白测定试剂盒(上海翊圣，chn)。优泌林精蛋白锌重组人胰岛素混合注射液(lilly，美国)；胰岛素测定elisa试剂盒(linco，美国)；甘油三酯(tg)测试盒、(南京建成，chn)；血糖试纸(johnson&johnson，美国)
[0039]
2、实验方法
[0040]
2.1细胞转染及检测
[0041]
hek293细胞用dmem培养液(含10％胎牛血清、100mg
·
l-1
链霉素和青霉素100u
·
l-1
) 置于37℃含5％co2培养箱中常规培养，2d换液一次，取对数生长期的细胞用于实验。取细胞悬液，按2
×
105个/ml的细胞密度进行铺板，待细胞生长至50％密度时，使用lipofectamine 2000转染试剂进行转染，转染效率在6-8h为最大。fxr质粒转染体系为fxr：rxr-α：ecre： renilla＝25：25：50：1，转染剂量为5μg dna/孔，注意配制转染体系时使用不含fbs及双抗的培养基溶液。转染7h后，分别加入含dmso、gw4064以及五味子甲素的dmem培养基(含10％fbs及0.1％双抗)继续培养24h。
[0042]
加药24h后，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行实验操作。吸取细胞培养基后，加入20μl cell lysis buffer，室温条件静置裂解15min。取10μl细胞裂解液加至荧光白板中，加入100μl含底物的firefly luciferase reaction buffer，混合均匀后，使用酶标仪检测firefly luciferase报告基因活性。检测完成后，在反应液中继续加入100μlrenilla检测工作液，混合均匀后，使用酶标仪检测renilla luciferase报告基因活性。
[0043]
2.2 fxr靶基因及靶蛋白检测
[0044]
mode-k细胞培养：使用含10％fbs及0.1％双抗的rpmi1640培养基，在含5％co2的37℃培养箱进行常规培养。每两天换液一次，当细胞在培养皿中覆盖率达到80％-90％时传代，选择对数生长期的细胞进行实验，实验操作均在生物安全柜中进行。
[0045]
小鼠原代肝细胞分离
[0046]
(1)小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠溶液进行麻醉。
[0047]
(2)将小鼠固定后打开腹腔，充分暴露出肝脏、下腔静脉及肝门静脉，将留置针缓慢插入下腔静脉，剪开肝门静脉。
[0048]
(3)打开蠕动泵，首先使用a液进行灌流，约15min，清除肝脏血液及钙离子，灌流至肝脏变为土黄色后，使用b液开始灌流，消化肝组织，约10min。
[0049]
(4)在培养皿中加入约5ml b液，使用无菌剪刀剪下肝脏，置于培养皿中，摘除胆囊，于细胞培养箱中孵育5min后，使用无菌镊子将肝细胞缓慢抖落于培养皿中，成细胞悬液。
[0050]
(5)将细胞悬液过100μm细胞滤网后，4℃，600g离心2min，弃去上清，加入20mldpbs溶液洗涤细胞两次。
[0051]
(6)细胞使用培养基b重悬，使用台盼蓝进行细胞存活率计算。死细胞因细胞膜通透性增大，台盼蓝能进入死细胞内从而将细胞染色。取细胞悬液与台盼蓝等体积混合后，使用细胞计数板进行计数，细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数 死细胞数)
×
100％，当小鼠原代肝细胞存活率大于80％时，进行后续实验操作。
[0052]
(7)使用2
×
105个/ml的细胞密度进行铺板，待4-6h细胞贴壁后，更换培养基a进行实验。
[0053]
mode-k细胞或原代肝细胞铺板贴壁后，分别加入含dmso、gw4064以及五味子木脂素类化合物的dmem培养基(含10％fbs及0.1％双抗)继续培养24h收集细胞检测靶基因及蛋白表达。
[0054]
2.3实验动物
[0055]
c57bl/6j(wt)野生型雄性小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，以c57bl/6j为背景的肠道fxr基因敲除小鼠(fxr
△
in
)由美国希望之城国际医学研究中心赠送。体重20
±
2 g的野生型c57bl/6雄性小鼠与fxr
△
in
雄性小鼠，饲养于上海中医药大学实验动物中心。
[0056]
spf级饲养室饲养环境：温度15～25℃，相对湿度45～55％，12小时交替照明，饲料和水新鲜无污染，自由摄食和饮水；动物适应环境一周后，所有小鼠进行高脂高糖高胆固醇饲料(gan饲料：research diets，inc，usa，d09100310)或正常饲料喂养；12周后进行分组：正常对照组(vehicle)、高脂高糖高胆固醇饲料诱导模型组(gan)、五味子甲素(灌胃给予50mg/kg低剂量及100mg/kg高剂量)组，阳性对照奥贝胆酸组(30mg/kg)；野生型正常对照组以正常饲料喂养6周。野生型及基因敲除实验组小鼠继续以gan饲料饲养6周，同时口服给药6周，并每周测量小鼠的体重和摄食量；实验结束前测定小鼠空腹血糖值，测定前禁食12小时，并进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量测试；摘眼收集小鼠血液以测定血清指标，取小鼠肝脏以测定肝脏脂质指标。
[0057]
2.4葡萄糖耐量(ipgtt)及胰岛素耐量(ipitt)实验.
[0058]
小鼠禁食12-16h后测定空腹血糖之后，腹腔注射葡萄糖(1.5g
·
kg-1
体重)，分别于15、 30、60及120min检测小鼠血糖。胰岛素耐量实验(itt)：小鼠禁食4-6h后，腹腔注射胰岛素(0.75u
·
kg-1
体重)，分别于0、15、30、60及120min采血测血糖.
[0059]
2.5血清和肝脏生化指标测定
[0060]
全血室温静置2h，4℃离心15min(3500rpm)，取上层血清，按酶联免疫试剂盒所述方法测定并计算血清中胰岛素(insulin)水平。
[0061]
另称取小鼠肝脏50mg，加入0.5ml组织裂解液后超声粉碎均浆，加入0.5ml氯仿后
涡旋30s，3000rpm离心15min后取氯仿层，挥干氯仿后用50μl异丙醇复溶，测定总总甘油三酯(tg)含量。
[0062]
2.6病理组织学分析
[0063]
切取相同部位(肝大叶)的部分肝组织，10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，4～5 μm厚度连续切片，放在载玻片上。经脱蜡后进行苏木素伊红染色，脱水封片保存。
[0064]
小鼠肝组织经4％多聚甲醛固定过夜，15％和30％的蔗糖溶液梯度置换，oct包埋后迅速冷冻。莱卡冷冻切片机切至8μm。用洁净的硅化载玻片粘取冷冻切片，切片干燥后入60％异丙醇浸洗10min。油红o工作液染色10min。60％异丙醇分化3-10s至间质清晰，水洗。mayer 苏木素复染1min，自来水返蓝。滤纸小心吸干水分，甘油明胶封片。
[0065]
2.7组织分布分析
[0066]
给药溶液的配制：称取一定量的五味子甲素置于50ml离心管中，加0.5％cmc-na溶液配制成终浓度为8mg
·
ml-1
的药液，临用前配制。
[0067]
动物实验：雄性c57bl/6j小鼠20只，实验前小鼠禁食12h，随机分为2组，其中一组为空白对照组(n＝8)，另外一组口服给五味子甲素cmcna混悬液(n＝12)，分别在给药7天时用戊巴比妥钠(30mg
·
kg-1
)腹腔注射麻醉小鼠，分别按顺序收集脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠、脑、心、肺、肝、肾脏、附睾脂肪组织，腹股沟脂肪组织、颈部棕色脂肪组织、肌肉组织，置-80℃冰箱中保存。取出的全血4000rpm离心5min，取上层血清于1.5ml ep 管中，置-80℃冰箱中保存。
[0068]
2.8数据处理
[0069]
所有数据用means
±
s.e.m.表示，采用spss 19.0软件进行分析。多组间比较采用 one-way anova处理，方差齐使用lsd-t法，方差不齐使用dunnett法，以p《0.05表示差异有统计学意义。
[0070]
3实验结果
[0071]
3.1五味子甲素体外增加fxr转录活性
[0072]
fxr转录活性筛选结果显示五味子甲素显示出fxr的激动活性(图1)，在1-25μm/l浓度范围内具有剂量依赖性，其ec
50
为7.4μm/l。
[0073]
3.2五味子甲素体外调控fxr靶基因转录水平
[0074]
五味子甲素促进原代肝细胞fxr靶基因shp mrna水平的表达，抑制fxr反向调控的肝脏 cyp7a1与cyp8b1mrna水平的表达(图2a)。同时，五味子甲素显著增加小鼠肠上皮细胞系mode-k细胞fxr靶基因fgf15、ibabp、ostβ和ostα的mrna表达水平(图2b)及fgf15 蛋白分泌(图2c)。
[0075]
3.3五味子甲素对非酒精性脂肪肝小鼠脂质代谢的影响
[0076]
体外筛选结果显示五味子甲素是胆汁酸核受体fxr的激动剂。因而我们用非酒精性脂肪肝小鼠模型对五味子甲素的体内作用进行评价。实验结果显示，野生型小鼠经过六周口服给予五味子甲素后，高剂量组(100mg/kg)小鼠体重显著降低(图3a)，但是其未能影响进食量(图3b)。说明五味子甲素对小鼠体重的影响不是通过降低食欲引起的。
[0077]
其次，我们观察肝脏中的脂质积累。野生型小鼠给予五味子甲素，高剂量组显著改善小鼠肝重体重比例(图3c)，肝脏tg含量(图3d)。肝脏病理切片结果显示，高剂量组肝脏中脂滴的积累显著减轻(图3e)。以上结果证实五味子甲素显著改善非酒精性脂肪肝小鼠体内
脂质代谢。
[0078]
3.4五味子甲素对非酒精性脂肪肝小鼠糖代谢的影响
[0079]
野生型小鼠给予五味子甲素六周后，高剂量组及低剂量组空腹血糖值显著低于非酒精性脂肪肝模型组(图4a)。葡萄糖耐量实验结果显示，给予葡萄糖后高剂量组及低剂量五味子甲素均能显著改善糖耐量，快速清除葡萄糖，两组小鼠血糖的曲线下面积与模型组相比均具有统计学差异(图4b、c)。同时，五味子甲素高剂量组显著降低模型小鼠的胰岛素水平(图 4d)。胰岛素耐量实验结果显示，给予0.75u/kg胰岛素后，只有五味子甲素高剂量组血糖的曲线下面积与模型组比具有显著性差异(图4e、f),说明五味子甲素高剂量能显著改善胰岛素抵抗。
[0080]
3.5五味子甲素口服后主要分布于肠道
[0081]
五味子甲素的组织分布结果显示，其主要分布在肠道中，其他代谢器官中含量很低，说明五味子甲素生物利用度很低(图5)。
[0082]
3.6五味子甲素改善非酒精脂肪肝的作用在肠道fxr敲除小鼠中消失
[0083]
图6结果显示，五味子甲素可以调控肠道fxr进而改善非酒精性脂肪肝小鼠的代谢表型。与模型组小鼠比较，五味子甲素改善体重的作用在fxr肠道敲除小鼠中消失(图6a)。肝重体重比测定及肝脏病理切片结果显示，五味子甲素改善肝脏脂质累积的作用在肠道fxr敲除小鼠中消失(图6b、6c)，说明肠道fxr是五味子甲素改善非酒精性脂肪肝的关键起效靶点。
[0084]
综上研究结果表明，五味子甲素作为胆汁酸核受体fxr的配体能通过激活肠道fxr参与非酒精性脂肪肝小鼠机体内糖脂代谢的调控。我们研究结果显示，五味子甲素可以作为治疗肥胖及非酒精性脂肪肝的先导化合物。
[0085]
实施例二
[0086]
1.材料与试剂
[0087]
1.1主要仪器和设备：
[0088]
多功能酶标仪(tecan，jpn)；超纯水系统(millipore，usa)；冷冻离心机(eppendorf， usa)；g154dw立式自动压力蒸汽灭菌锅(schneider electric，fr)；4℃冰箱、-80℃低温冰箱、涡旋震荡仪、微孔板恒温振荡器(杭州奥盛仪器，chn)；多功能酶标仪(pe， usa)。
[0089]
1.2主要试剂与耗材
[0090]
五味子甲素(分子量：416.51，hplc纯度≥99％)：南京广润生物制品有限公司(中国，南京)，批号：gr-138-210903；优泌林精蛋白锌重组人胰岛素混合注射液(lilly，美国)；甘油三酯(tg)测试盒、(南京建成，chn)；血糖试纸(johnson&johnson，美国)
[0091]
2、实验方法
[0092]
2.1实验动物
[0093]
c57bl/6j(wt)野生型雄性小鼠购自斯莱克动物有限公司，体重20
±
2g的c57bl/6雄性小鼠饲养于上海中医药大学实验动物中心。
[0094]
spf级饲养室饲养环境：温度15～25℃，相对湿度45～55％，12小时交替照明，饲料和水新鲜无污染，自由摄食和饮水；动物适应环境一周后，所有小鼠进行高脂饲料(gan饲料：research diets，inc，usa，d09100310)或正常饲料喂养；12周后进行分组：高脂高糖高
胆固醇饲料诱导模型组(gan)、五味子甲素(灌胃给予4.3mg/kg剂量)组；各组小鼠继续以gan饲料饲养6周，同时五味子甲素组口服给药6周，并每周测量小鼠的体重和摄食量；实验结束前进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量测试；取小鼠肝脏以测定肝脏脂质指标。
[0095]
3.2葡萄糖耐量(ipgtt)及胰岛素耐量(ipitt)实验.
[0096]
小鼠禁食12-16h后测定空腹血糖之后，腹腔注射葡萄糖(1.5g
·
kg-1
体重)，分别于15、30、60及120min检测小鼠血糖。胰岛素耐量实验(itt)：小鼠禁食4-6h后，腹腔注射胰岛素(0.75 u
·
kg-1
体重)，分别于0、15、30、60及120min采血测血糖.
[0097]
2.3肝脏生化指标测定
[0098]
称取小鼠肝脏50mg，加入0.5ml组织裂解液后超声粉碎均浆，加入0.5ml氯仿后涡旋 30s，3000rpm离心15min后取氯仿层，挥干氯仿后用50μl异丙醇复溶，测定总总甘油三酯 (tg)含量。
[0099]
2.4数据处理
[0100]
所有数据用means
±
s.e.m.表示，采用spss 19.0软件进行分析。多组间比较采用 one-way anova处理，方差齐使用lsd-t法，方差不齐使用dunnett法，以p《0.05表示差异有统计学意义。
[0101]
4实验结果
[0102]
3.1五味子甲素4.3mg/kg剂量对非酒精性脂肪肝小鼠脂质代谢的影响
[0103]
实验结果显示五味子甲素4.3mg/kg剂量未能显著改善模型小鼠体重(图7a)，亦未能显著改善模型小鼠肝重体重比例和肝脏tg含量(图7b、7c)。
[0104]
3.2五味子甲素4.3mg/kg剂量对非酒精性脂肪肝小鼠糖代谢的影响
[0105]
野生型小鼠给予五味子甲素4.3mg/kg剂量六周后，给药组糖耐量曲线各点葡萄糖水平值与模型组相比无显著差异(图7d)。胰岛素耐量实验结果显示，五味子甲素4.3mg/kg组在给予 0.75u/kg胰岛素后0、15、30、60、120分钟各点血糖值与模型组相比均无显著差异(图7e)，说明五味子甲素在该剂量时未能改善模型小鼠胰岛素抵抗。
[0106]
综上研究结果表明，五味子甲素4.3mg/kg剂量对高脂高糖高胆固醇诱导非酒精性脂肪肝小鼠无显著改善糖脂代谢表型的作用。
[0107]
本发明所涉及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本技术所附权利要求的覆盖范围。