用于免疫组化检测质控品的缓冲液及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于免疫组化技术领域，具体涉及一种免疫组化检测质控品的缓冲液及其制备和应用。


背景技术：

2.免疫组织化学检测，简称免疫组化检测，是一种通过抗原抗体特异性结合并通过显色剂显色的常规免疫学检测方法。该方法主要应用于生物组织切片样本的病理检测。在检测中使用特定一抗与生物组织切片样本中的抗原特异性结合，进一步使用一个通用性二抗与前述一抗结合，并通过连接在二抗上的显色分子显色。分析检测的染色情况即可判断该生物组织切片的病理状态。由于免疫组织化学检测方法步骤多，流程长；使用的试剂种类繁多，且生物组织切片多样性的因素容易出现各种假阴性染色和假阳性染色的情况导致检测结果不可信，无法进行病理判读。
3.为了确认免疫组织化学检测的可靠性，需要引入一个染色结果明确并且性质稳定的质控品。只有在质控品染色结果符合预期的情况下，才能确认免疫组织化学检测结果可信。质控品的材料一般是确认性状的病理组织或细胞株。质控品实现形式可以是组织/细胞石蜡切片或组织/细胞悬液。组织/细胞悬液相对于传统石蜡切片其施加方式更加简便快捷，在使用上有很大的优势。但是由于液体的扩散不受控，质控品如果滴加位置靠近待检测生物组织切片则容易和待检测生物组织切片产生交叉污染，如果质控品滴加位置为了避开待检生物组织切片而靠近边缘又因为实验过程中试剂覆盖范围有限容易造成无法染色或染色不均匀的情况导致最终结果判读无效；另外，由于液体的表面张力会导致悬液中的组织/细胞聚集堆叠形成多层结构，该结构在显微镜下将无法清晰判断细胞定位和阴阳性情况，造成结果判读出现问题。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明提供一种新型缓冲液，通过调整缓冲液溶剂、粘度、添加稳定剂、抗菌剂使其具有挥发迅速、不易扩散、性质稳定、耐超低温储存等特性，解决了现有技术易发生交叉污染、组织/细胞不均匀易堆叠的问题；另外可以通过改变搭配溶剂的配方，利用该缓冲液制备组织/细胞质控品，可更长期的保证缓冲液中的组织/细胞抗原稳定，实现超长期保存。具体地，本发明的技术方案如下：
5.本发明第一方面提供一种用于免疫组织化学检测质控品的缓冲液，各组分的质量百分数为：卡波姆0.2％～1％、醇30％～40％、三乙醇胺0.1％～0.25％、叠氮钠0.005％～0.015％，余量为去离子水。
6.在本发明中，卡波姆(carpol)作为增稠剂增加溶剂粘度。卡波姆是由丙烯酸与丙烯基蔗糖交联而成的高分子聚合物，为白色疏松，微有特臭、吸湿性极强的粉末。卡波姆被中和羧基离子化后，由于负电荷的相互排斥作用，分子链弥散伸展，成极大的膨胀状态，并具有粘性，可形成澄清的粘稠凝胶。
7.在本发明的一些实施方案中，所述卡波姆为传统型卡波姆，例如，所述卡波姆为卡波姆940，其在所述缓冲液中的质量百分数为0.2％～1％。
8.在本发明的一些实施方案中，述卡波姆为改良型卡波姆，例如，所述卡波姆为卡波姆980，其在所述缓冲液中的质量百分数为0.2％～0.5％。
9.在本发明中，所述醇和去离子水一样，作为溶剂。
10.在本发明的一些实施方案中，所述醇为乙醇，其在所述缓冲液中的质量百分数为35％～40％。
11.在本发明的一些实施方案中，所述醇为异丙醇，其在所述缓冲液中的质量百分数为30％～35％。当使用异丙醇时，可在-80℃的条件下保持液体状态，在缓冲液中加入组织/细胞后，能够更长时间地保持抗原稳定，实现超长期保存。
12.在本发明中，三乙醇胺作为稳定剂，用于调节缓冲液ph值和维持卡波姆的稳定性。本发明的一些实施方案中，所述三乙醇胺在所述缓冲液的质量百分数为0.2％。
13.在本发明中，叠氮钠作为抗菌剂保证缓冲液无菌防腐。现有技术认为，叠氮钠会干扰任何含有氨基的偶联，因此在需要偶联带有氨基的抗体，本领域不会使用叠氮钠作为抗菌剂。然而，在本发明中，使用叠氮钠作为抗菌剂，不会影响基于抗体的免疫组化检测。在本发明的一些优选实施方案中，所述叠氮钠在所述缓冲液的质量百分数为0.01％。
14.本发明第二方面提供本第发明第一方面任一所述的缓冲液的制备方法，包括以下步骤：
15.s1，称取卡波姆加入至所述醇中，震荡均匀；
16.s2，向所述不透明悬浊液中加入部分去离子水至所述卡波姆完全溶解；
17.s3，吸取三乙醇胺逐滴加入，边滴加边搅拌，每加入1滴搅拌20～40sec至ph值平衡，直至ph值为7.2
±
0.1；
18.s4，加入叠氮钠并用去离子水补足余量，搅拌均匀后，置于摇床上震荡充分混匀，即可得到所述缓冲液。
19.在本发明的一些实施方案中，步骤s2为在摇床上震荡至所述卡波姆充分溶解。
20.本发明的第三方面提供本发明第一方面任一所述的缓冲液在制备用于免疫组织化学检测的质控品中的应用。
21.本发明第四方面提供一种用于免疫组织化学检测的质控品，包括本发明第一方面任一所述的缓冲液。
22.在本发明的一些实施方案中，所述质控品是将细胞加入至所述缓冲液中得到的。在本发明的另一些实施方案中，所述质控品是将组织加入至所述缓冲液中得到的，具体地，先将组织切片后进行匀浆，分散后加入至所述缓冲液中，其效果与利用细胞制备细胞悬液质控品效果等同。
23.在本发明的一些实施方案中，所述质控品中，细胞的含量为1～100
×
106个/ml，优选地，细胞的含量为1～100
×
106个/ml。
24.本发明的有益效果
25.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
26.本发明通过调整缓冲液溶剂、粘度、添加稳定剂、抗菌剂，使其具有挥发迅速、不易扩散、性质稳定、耐超低温储存等特性，解决了原有技术易发生交叉污染、组织/细胞不均匀
易堆叠的问题。
27.利用本发明的缓冲液制备组织/细胞质控品，可更长期地保证缓冲液中的组织/细胞抗原稳定，实现超长期保存。
28.本发明的缓冲液使用叠氮钠作为抗菌剂，在保证缓冲液无菌防腐的前提下能够保证染色效果，这是本领域技术人员无法预期的。
29.本发明的缓冲液的制备方法简单、易于操作。
30.本发明的缓冲液用途广泛，可能适用于不同的组织或细胞，具有巨大的推广价值。
附图说明
31.图1示出了本发明实施例3中利用缓冲液b2制备的细胞悬液进行染色时的细胞分布情况。
32.图2示出了本发明实施例3中利用缓冲液r1制备的细胞悬液进行染色时的细胞分布情况。
33.图3示出了本发明实施例3中利用缓冲液r2制备的细胞悬液进行染色时的细胞分布情况。
34.图4示出了本发明实施例4中病理样品扁桃体切片淋巴细胞的染色情况。
35.图5示出了本发明实施例4中利用缓冲液a1制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
36.图6示出了本发明实施例4中利用缓冲液a2制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
37.图7示出了本发明实施例4中利用缓冲液a3制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
38.图8示出了本发明实施例4中利用缓冲液a4制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
39.图9示出了本发明实施例4中利用缓冲液b1制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
40.图10示出了本发明实施例4中利用缓冲液b2制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
41.图11示出了本发明实施例4中利用缓冲液b3制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
42.图12示出了本发明实施例4中利用缓冲液b4制备的细胞悬液在作为免疫组化检测质控品时的染色情况。
43.图13示出了本发明实施例5中实验组c的染色结果。
44.图14示出了本发明实施例5中实验组p的染色结果。
45.图15示出了本发明实施例5中实验组q的染色结果。
46.图16示出了本发明实施例5中实验组o的染色结果，棕褐色(实线箭头)为阳性，蓝紫色(虚线箭头)为阴性。
47.图17示出了本发明实施例5中实验组h的染色结果。
48.图18示出了本发明实施例5中实验组n的染色结果。
49.图19示出了本发明实施例5中实验组g的染色结果。
50.图20示出了本发明实施例6中利用未消泡缓冲液制备的细胞悬液细胞分布情况。
51.图21示出了本发明实施例6中利用消泡后缓冲液制备的细胞悬液细胞分布情况。
具体实施方式
52.除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本技术中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本技术的提交日期同步的。在适用的情况下，本技术中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本技术中提供的任何定义不一致，则以本技术中提供的术语定义为准。
53.本技术中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值，例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5)的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例，并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本技术中。
54.关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
55.术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本技术中披露无关。为消除任何疑问，除非明确说明，否则本技术中所有使用术语“包含”，“包括”，或“具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性能所必要的那些，术语“基本上由
……
组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任何该术语下文叙述的范围之外。术语“由
……
组成”不包括未具体描述或列出的任何组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
56.为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
57.实施例
58.以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
59.除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
60.那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
61.下述实施例中未作具体说明的实验方法，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
62.实施例1卡波姆的溶解方案优化
63.为了溶解卡波姆，发明人设计以下几种方案：
64.方案一：
65.称取40g无水乙醇和50g左右去离子水搅拌30sec充分混匀，称取1g卡波姆940缓慢分散加入乙醇和去离子水溶液中。搅拌或在水平摇床上120rpm震荡30min至卡波姆充分溶解，呈透明含气泡略粘稠液体，测量ph值为6.1。滴加约0.2g三乙醇胺，调节ph值至7.2，此时呈现透明含气泡粘稠液体。加入10mg叠氮钠并用去离子水补足余量，继续放置在水平摇床上120rpm室温震荡过夜消泡即可形成澄清稳定凝胶状缓冲液。
66.方案二：
67.称取1g卡波姆940缓慢分散加入50g左右去离子水中，搅拌或在水平摇床上180rpm震荡120min至卡波姆充分溶解，呈透明含气泡胶状体，加入40g无水乙醇，搅拌或在水平摇床上120rpm震荡30min至充分混匀，此时呈现透明含气泡略粘稠液体，测量ph值为6.0。滴加约0.2g三乙醇胺，调节ph值至7.2，此时呈现透明含气泡粘稠液体。加入10mg叠氮钠并用去离子水补足余量，继续放置在水平摇床上120rpm室温震荡过夜消泡即可形成澄清稳定凝胶状缓冲液。
68.方案三：
69.称取1g卡波姆940加入40g无水乙醇中，甩动震荡10sec形成不透明悬浊液，此时加入50g左右去离子水搅拌或在水平摇床上120rpm震荡2min至卡波姆充分溶解，呈透明略粘稠液体，测量ph值为6.1。滴加约0.2g三乙醇胺，调节ph值至7.2，此时呈现透明粘稠液体。加入10mg叠氮钠并用去离子水补足余量，继续放置在水平摇床上120rpm震荡5min充分混匀即可形成澄清稳定凝胶状缓冲液。
70.由此可见，上述三个方案均能形成澄清稳定凝胶状缓冲液，但是方案三在制备时间上具有方案一和方案二不可比拟的优势：在溶解过程中，仅需要2min左右，而方案一需要至少30min，方案二甚至至少需要120min；在加入叠氮钠后，方案三无需像方案一和方案二那样需要室温震荡过夜(8～12h)的消泡过程，仅需震荡5min即可，大大缩短了制备凝胶状缓冲液的时间，节约能源的同时提高检测效率。
71.因此，发明人最终选择方案三作为卡波姆的溶解方案。
72.实施例2免疫组织化学检测质控品的缓冲液及其制备
73.为了验证不同的缓冲液的性能，按照表1制备不同的缓冲液。
74.表1缓冲液中各组分含量(g)及ph值
75.缓冲液r1r2a1a2a3a4b1b2b3b4卡波姆940//0.2/1.0/0.2/1.0/卡波姆980///0.2/0.5/0.2/0.5无水乙醇/3535354040////异丙醇//////30303535
去离子水10065余量余量余量余量余量余量余量余量三乙醇胺//0.1-0.20.1-0.20.1-0.20.1-0.20.1-0.20.1-0.20.1-0.20.1-0.2叠氮钠//0.010.010.010.010.010.010.010.01ph值//7.27.27.27.27.27.27.27.2
76.以上各缓冲液的配制方法如下：
77.1.对照缓冲液r1和r2的配制：
78.r1为纯去离子水；r2为35％的乙醇溶液。
79.2.改进缓冲液a1～a4和b1～b4的配制：
80.a.按表1中的量称取卡波姆加入相应的醇中，甩动震荡10sec形成不透明悬浊液；
81.b.此时加入适量去离子水搅拌或在水平摇床上120rpm震荡2min至卡波姆充分溶解，呈透明略粘稠液体，测量ph；
82.c.吸取三乙醇胺逐滴加入，边滴加边轻柔搅拌，每加入1滴搅拌约30秒至ph值平衡，直至ph值为7.2(
±
0.1)，此时液体粘稠度增加，呈现透明、澄清、粘稠状态；
[0083][0084]
d.加入10μl 1mg/ml叠氮钠并用去离子水补足余量，搅拌均匀后，置于水平摇床上120rpm震荡5min充分混匀，即可形成澄清稳定凝胶状缓冲液。
[0085]
实施例3利用不同缓冲液制备的细胞悬液中细胞的分布情况
[0086]
1.细胞悬液的配制
[0087]
在实施例2制备的各缓冲液中，按照每ml缓冲液中10m(10
×
106个)细胞的浓度分别加入细胞，配制成不同的细胞悬液。
[0088]
2.细胞悬液中细胞分布的观察
[0089]
对于每种细胞悬液，取1μl滴加至玻片上，使用ki-67抗体作为检测一抗进行染色。可观察到利用缓冲液b2配制的细胞悬液，滴加至玻片上后细胞不扩散，室温完全挥发仅需约3min，在显微镜下观察发现可形成均匀细胞片(图1)，且缓冲液a1～a4、b1～b4配制的细胞悬液质控品表现基本相同；利用缓冲液r1配制的细胞悬液，滴加到玻片后同样不产生扩散，但在室温下完全挥发时间约20分钟，在显微镜下观察发现细胞分布呈圆环状，集中堆积在边缘(图2)，不适宜作为免疫组化检测的质控品；利用缓冲液r2配制的细胞悬液滴加后，室温完全挥发时间约3分钟，细胞分布较均匀，但扩增比较严重，有明显扩散圈(图3)，同样不适宜作为免疫组化检测的质控品。
[0090]
实施例4不同细胞悬液在作为质控品中的应用
[0091]
利用实施例3的方法制备不同的细胞悬液。对于每种细胞悬液，取1μl滴加至待检扁桃体组织切片所在玻片上。
[0092]
滴加完细胞悬液的玻片进行免疫组织化学检测，使用ki-67抗体作为检测一抗进行染色。染色后可观察到利用a1～a4、b1～b4细胞悬液细胞均匀，且染色定位、强度不受影响(图4～图12)，可以作为免疫组化检测的质控品。
[0093]
实施例5质控品的稳定性比较
[0094]
发明人通过实验证明，利用缓冲液b2制备的细胞悬液质控品，可以在-20℃到-80℃下保存长达90天，具有非常高的稳定性。为了证明这一点，发明人分别利用实施例2的缓冲液a2和缓冲液b2分别按照实施例3的制备细胞悬液作为质控品，并在不同的保存下保存不同的时间，实验设置如表2所示：
[0095]
表2稳定性对比实验
[0096][0097][0098]
各取1μl不同的细胞悬液滴加于同一切片玻片上，进行免疫组织化学检测，使用ki-67抗体作为检测一抗进行染色，结果如图13-图19所示。需要补充说明的是，发明人发现，利用缓冲液a2制备细胞悬液作为质控品，在-80℃会冻结成固态，冰晶破坏细胞结构，导致无法进行免疫组织化学检测，因此未提供相应的检测结果。
[0099]
由染色结果可知，利用缓冲液b2制备的细胞悬液在-80℃下保存90天后(实验组c，染色结果如图13)，细胞染色强度和阳性率与利用缓冲液b2新鲜配制的细胞悬液(实验组p，染色结果如图14)没有差异，与利用缓冲液a2新鲜配制的细胞悬液(实验组q，染色结果如图15)也没有明显差异。利用缓冲液a2和b2分别制备的细胞悬液在-20℃下仅保存30天后(实验组o和实验组h)，染色强度和阳性率就显著下降(如图16和图17所示)。而利用缓冲液a2和b2分别制备的细胞悬液在4℃下分别保存30天后(实验组n和实验组g)，染色结果就显示转为了阴性(如图18和图19所示)。
[0100]
综上可知，利用缓冲液b2配置的细胞悬液，利用缓冲液b2制备的细胞悬液的稳定性远高于利用a2等缓冲液制备的细胞悬液，可在-80℃稳定保存90天。
[0101]
实施例6缓冲液消泡与否对细胞分布的影响
[0102]
为了证明本发明实施例1中选择的溶解方案时间上的重大优势，发明人采用方案二制备两种缓冲液：第一种经过水平摇床震荡过夜消泡的过程，第二种未经过水平床震荡消过夜消泡的过程。其中，第二种由于没有过夜，时间上与方案三相差不大，利用第二种缓冲液制备的细胞悬液如图20所示，可见很多细胞被气泡挤到四面八方，中间细胞少，导致细胞分布很不均匀。而利用消泡后的缓冲液制备细胞悬液如图21所示，可见细胞分布均匀，与利用方案三缓冲液制备的细胞悬液(如图1所示)效果相当。
[0103]
由此可见，利用方案三可以快速获得无泡凝胶状缓冲液，制备出来的细胞悬液细胞分均匀，更加适宜制备质控品。
[0104]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。