一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及生物检测技术领域，具体而言，涉及一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒。


背景技术：

2.叶酸由蝶啶、对氨基苯甲酸和l-谷氨酸组成，也叫蝶酰谷氨酸，是一种水溶性维生素，为人体细胞生长和繁殖所必需，是孕妇的营养素补充剂。补充叶酸可显著降低新生儿神经管缺陷的发生率，也有助于降低心脑血管疾病的发生风险。
3.血清叶酸被认为是反映近期叶酸营养状况的指标，单独检测血清叶酸水平并不能区分一过性膳食叶酸摄入不足和慢性叶酸缺乏状态；而红细胞叶酸水平可反映慢性或长期(4个月内)叶酸营养状况，更适合于评价叶酸干预效果。叶酸检测方法较多，其中，最可靠的是微生物法，其他的叶酸检测方法还包括经典的高效液相色谱法、免疫法和离子捕获法等。
4.活性叶酸是5-甲基四氢叶酸，是稳定性的天然叶酸，无需代谢，可直接进入循环，被人体吸收利用。它是由亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)催化生成，是红细胞中存在的主要叶酸类型。mthfr催化生成5-甲基四氢叶酸这步酶促反应至关重要，是叶酸代谢通路中的限速步骤。
5.目前，临床所使用的叶酸检测方法主要为化学发光法的红细胞叶酸，与其他检测方法相比，精密度较差，在低水平叶酸浓度时，普遍检测偏高，并且不能对活性叶酸等进行分型；针对两个mthfr的基因位点检测最多可以直观的判断出基因型但推知该酶的活性能力，并不能直观了解因为酶活力而导致的叶酸分布和存储情况，进而无法了解临床补充叶酸后真实发生作用的活性叶酸情况，为后续的临床指导带来困扰。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法以及检测方法和试剂盒。
8.本发明是这样实现的：
9.第一方面，本发明实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括：将红细胞裂解后的血液样本、内标溶液与保护剂混合，得到加标样本，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇；在所述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，所述巯基乙醇的体积分数≥0.1％；将所述加标样本进行蛋白失活、水解孵育和固相萃取后，用于后续对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测。
10.第二方面，本发明实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括采用如前述实施例所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法对样本进行前处理，然后对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
11.第三方面，本发明实施例提供了一种叶酸及其代谢物的检测试剂盒，其包括：保护剂与叶酸及其代谢物的内标品；其中，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇，所述保护剂中抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，巯基乙醇的体积分数≥0.1％。
12.本发明具有以下有益效果：
13.本发明提供了一种检测叶酸及其代谢物的前处理方法和检测方法，主要通过采用特定作用浓度的抗坏血酸和巯基乙醇与样本接触，使得样本中的叶酸及其代谢物具有很好的稳定性，有效增强了液相色谱串联质谱检测叶酸及其代谢物的准确度和精密度。
14.本发明的检测方法能够同时实现对叶酸、四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸含量的检测，进而能够获得总叶酸含量以及活性叶酸比的结果，具有稳定性高，精密度好等优点，且整个检测过程方便快捷，适于推广。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
16.图1为质控样本qcm的质谱检测的总离子流图，其中，
①
四氢叶酸
②
5-甲基四氢叶酸
③
5-甲酰四氢叶酸
④
叶酸。
具体实施方式
17.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
18.本发明克服了现有检测的弊端，具有选择性好、特异性佳、灵敏度高等特点，可以对于叶酸及叶酸代谢物进行分型定量，并在叶酸储量、活性叶酸总量和活性叶酸占比的检测上具有明显的优势。
19.具体地，本发明实施例提供了一种叶酸及其代谢物的样本前处理方法，其包括：将红细胞裂解后的血液样本、内标溶液与保护剂混合，得到加标样本，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇；在所述加标样本中所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，所述巯基乙醇的体积分数≥0.1％；
20.将所述加标样本进行蛋白失活、水解孵育和固相萃取后，用于后续对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测。
21.本文中“所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇”是指保护剂可以包括单独分装的抗坏血酸和巯基乙醇，或含有抗坏血酸和巯基乙醇中至少一种的溶液，只要添加后能够使得加标样本中抗坏血酸和巯基乙醇达到设定浓度即属于本技术所述的保护剂。
22.具体地，抗坏血酸除了防止叶酸损失的作用外，还有加速裂解红细胞的作用，作用浓度在0.1％～2％之间可以满足基本要求，具体可以在0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选地，在所
述加标样本中，所述抗坏血酸的质量分数为0.1％～1％，优选为0.2％～0.9％，更优选为1％，优选范围的效果更好。
23.巯基乙醇能够显著提高叶酸及其代谢物的稳定性，且作用浓度在0.1％以上都具有较好的效果，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％和2.0％中的任意一种或任意两种之间的范围。在所述加标样本中，所述巯基乙醇的体积分数为0.1％～2％，优选为0.2％～1％，优选范围的效果更好。
24.优选地，所述保护剂含有抗坏血酸和巯基乙醇的水溶液。
25.保护剂中的抗坏血酸和巯基乙醇还有利于保护样本前处理过程的蛋白失活和水解孵育两个过程的叶酸及其代谢物的保护，进而使得液相色谱串联质谱的检测结果更加的稳定和准确。
26.优选地，在进行所述蛋白失活前，对加标样本进行冻融裂解。对加标样本进行冻融裂解，有利于红细胞内的叶酸物质得到充分释放，提高红细胞叶酸的存储稳定性，而未冻融裂解的样本无法完全地释放红细胞内的叶酸物质。
27.所述冻融裂解的条件包括：温度为-20～-90℃，时间为10～60分钟。每次冻融后，还包括取出样本恢复至室温。冻融的温度可以具体可以为-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃和-90℃中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为-80℃。冻融的时间可以为10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min、60min中的任意一种或任意两种之间的范围。
28.优选地，所述冻融裂解的次数为1～2次。
29.优选地，所述方法还包括将待冻融裂解的样本进行分装，可以有效减少后期复测过程中的冻融测试，分装为50～150μl，分装的体积具体可以为50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、110μl、120μl、130μl、140μl、150μl中的任意一种或任意两种之间的范围。
30.优选地，所述代谢物选自：四氢叶酸、5-甲基四氢叶酸和5-甲酰四氢叶酸中的至少一种。
31.对加标样本进行蛋白失活的目的在于使样本中的蛋白物质变性沉淀并灭活原有样本中的水解酶类，优选采用热变失活的方法。优选地，所述蛋白失活的条件为：60～100℃，金属浴1～30min，优选为10～20min。
32.蛋白失活的温度具体可以为60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃中的任意一种或任意两种之间的范围，金属浴的时间可以为1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为10～20min。
33.优选地，所述水解孵育的步骤包括：在蛋白失活后的样本中添加动物血清，然后于30～45℃孵育3h以上，优选为3～24h。
34.水解孵育的温度具体可以为30℃、35℃、40℃、45℃中的任意一种或任意两种之间的范围，时间可以为3h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h中的任意一种或任意两种之间的范围。
35.优选地，所述动物血清选自大鼠血清、小鼠血清和人血清中的至少一种，优选为大鼠血清。选择动物血清主要是利用其中含有的γ-谷氨酸水解酶，且大鼠血清酶活更好，且比小鼠血清取血更为方便易得。
36.优选地，所述固相萃取包括：活化、平衡、上样、淋洗和洗脱步骤。
37.优选地，所述活化采用的活化液包括甲醇。相比乙腈、乙醇和异丙醇等有机试剂而言，甲醇具有更好的活化效果。
38.优选地，所述平衡采用的平衡液包括0.01％～2％的氨水，该范围可以们组使用，具体可以为0.01％、0.1％、0.15％、0.2％中的任意一种或任意两种之间的范围，0.2％具有更好的效果。
39.优选地，所述淋洗采用的淋洗液包括水，优选为纯水。
40.优选地，所述洗脱采用的洗脱液包括：甲醇、甲酸和稀释液。所述稀释液中含有抗坏血酸和巯基乙醇，所述稀释液中含有的抗坏血酸的质量分数为0.5％～2％，具体可以为0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为0.5％～1.5％，巯基乙醇的体积分数为≥0.1％，优选为0.1％～2％，具体可以为0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％中的任意一种或任意两种之间的范围，更优选为0.1％～1％，优选范围的效果更好。
41.优选地，在所述洗脱液中，甲醇的体积分数为85％～95％，具体可以为85％、86％、88％、90％、92％、94％、95％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为88％～92％，所述稀释液的体积分数为3％～13％，具体可以为3％、4％、6％、8％、10％、12％、13％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为6％～10％。甲酸的体积分数为0.1％～5％，具体可以为0.1％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％中的任意一种或任意两种之间的范围，优选为1％～5％。
42.本发明提供的洗脱液的效果很好，尤其适用于固相萃取板为waters oasis max 96-wellμelution plate，主要洗脱原理为阴离子交换(碱性上样，酸性洗脱)，兼有反向洗脱原理(高水相上样，高有机相洗脱)。两种洗脱原理使得洗脱更加充分。经验证甲酸在0.1％～5％的范围内都满足使用，1.5％～2.5％的甲酸效果更好。
43.本发明还提供了一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括采用如前述任意实施例所述的叶酸及其代谢物的样本前处理方法对样本进行前处理，然后对样本中的叶酸及其代谢物的液相色谱串联质谱检测；所述方法不以疾病的诊断或治疗为直接目的。
44.优选地，色谱条件如下：洗针液为70％～90％甲醇；色谱柱为acquity uplc hss t3，色谱柱的规格为：长度为50～80mm，优选为50mm，内径为2～3mm，优选为2.1mm，颗粒粒径为1～5μm，优选为1.8μm；色谱柱的柱温为35～45℃，优选为40℃，色谱柱的进样体积为2～10μl，优选为5μl。
45.优选地，液相色谱的流动相和洗脱条件如下：
46.流动相a为含体积分数为0.01％～0.2％甲酸的水溶液(记为0.0％～0.2％的甲酸水)，甲酸的体积分数具体可以为0.01％、0.1％、0.15％、0.2％中的任意一种或任意两种之间的范围。流动相b包括乙腈。优选地，所述流动相b为含体积分数为0.01％～0.2％甲酸的乙腈溶液。乙腈溶液中，甲酸的体积分数具体可以为0.01％、0.05％、0.1％、0.15％、0.2％中的任意一种或任意两种之间的范围。
47.梯度洗脱条件：
48.0～1.5min，流动相a的体积分数从95％到85％，流动相b的体积分数从5％到15％，流速0.1～0.7ml/min；
49.1.5～2.0min，流动相a的体积分数从85％到20％，流动相b的体积分数从15％到
80％，流速0.1～0.7ml/min；
50.2.0～2.5min，流动相a的体积分数维持20％～30％，流动相b的体积分数维持在70％～80％，流速0.1～0.7ml/min；
51.2.5～2.51min，流动相a的体积分数从20％到95％，流动相b的体积分数从80％到5％，流速0.1～0.7ml/min；
52.2.51～3.0min，流动相a的体积分数维持在90％～95％，流动相b的体积分数维持在5％～10％，流速0.1～0.7ml/min。
53.优选地，所述血液样本选自：全血样本、血浆样本以及环境样本中的任意一种。环境样本可以为土壤样本、水样本，或含有血液的土壤样本、水样本，目的可能是为了分析环境中叶酸及其代谢物的含量，或基于采集的环境样本进行样品来源的身份信息的分析、鉴定或辅助鉴定。
54.优选地，在进行样本前处理前，所述检测方法还包括：检测血液样本的红细胞压积。
55.优选地，所述检测方法还包括计算获得叶酸及其代谢物的含量；叶酸或其代谢物的含量＝叶酸或其代谢物液相色谱串联质谱的检测结果/红细胞压积。
56.优选地，所述检测方法还包括计算获得总叶酸含量：总叶酸含量＝叶酸的含量 代谢物的含量。
57.优选地，所述检测方法还包括计算获得活性叶酸比：活性叶酸比＝5-甲基四氢叶酸/总叶酸。
58.优选地，所述检测方法还包括获取标准品以制备标准曲线。
59.优选地，制备标准曲线时，采用标准品稀释液对标准品进行稀释；所述标准品稀释液包括甲醇和前处理方法中所述的稀释液。
60.优选地，在所述标准品稀释液中，甲醇的体积分数为80％～95％，具体可以为80％、85％、90％、95％中的任意一种或任意两种之间的范围，所述稀释液的体积分数为5％～20％，具体可以为5％、10％、15％、20％中的任意一种或任意两种之间的范围。
61.标准品稀释液以及洗脱液中含有特定浓度的抗坏血酸和巯基乙醇能进一步提高检测的稳定性和精准度。
62.本发明提供的检测方法能够高选择性、高特异性、高灵敏度地准确检测红细胞内叶酸、5-甲基四氢叶酸、5-甲酰四氢叶酸、四氢叶酸四个化合物，以准确评估人体叶酸代谢和储存情况，为人体叶酸代谢和储存情况提供了有效精准的获取途径。
63.本发明的检测原理：主要是通过水解孵育水解叶酸多聚谷氨酸盐，通过固相萃取技术分离纯化全血中各种叶酸，并运用先进的液相色谱串联质谱(lc-ms/ms)技术进行定量检测，最终全血hct计算出红细胞中叶酸及其代谢物的含量、总叶酸含量和活性叶酸比。由通过以上检测和计算所得数据可以了解红细胞中叶酸以及各种代谢物的分布情况，特别是通过总叶酸来评估人体中全部叶酸的存储量以及通过活性叶酸比来推测亚甲基四氢叶酸还原酶(mthfr)的活性和该酶的基因位点(677c/t和1298a/c)突变状况。
64.此外，本发明实施例还提供了一种叶酸及其代谢物的检测试剂盒，其包括：保护剂与叶酸及其代谢物的内标品；其中，所述保护剂包括抗坏血酸和巯基乙醇，所述保护剂中抗坏血酸的质量分数为0.1％～2％，巯基乙醇的体积分数≥0.1％。
65.可以理解的是，保护剂的具体选择可以同前述任意实施例所述，不再赘述。
66.优选地，所述试剂盒还包括：如前述任意实施例所述样本前处理方法中采用的活化液、平衡液和淋洗液中的至少一种。
67.优选地，所述检测试剂盒包括：如前述任意实施例所述检测方法中所采用的流动相、标准品和标准品稀释液中的至少一种。
68.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
69.实施例1
70.一种叶酸及其代谢物的检测方法，其包括以下步骤。
71.(1)检测血液样本的红细胞压积hct
72.本实验使用血红蛋白仪自带的检测红细胞压积(hct)检测功能对全血样本进行检测，对于hct的检测包括但不限于此种方法，本方法的优点在于快速简便易于掌握，但相比传统离心方法测量的hct存在一定的偏差，此偏差在本实验应用中处于可接受范围。
73.(2)样本前处理：
74.冻融裂解；对样本进行分装，可以有效减少后期复测过程中的冻融测试，有利于红细胞叶酸的存储稳定性。将分装好的100μl全血样本放入-80℃冰箱内快速冷冻，至少30分钟，取出后恢复室温，红细胞冻融裂解。
75.加标稀释；每100μl冻融结束的样本，添加10μl内标溶液和700μl的稀释液(同保护剂)。其中，稀释液含有抗坏血酸和巯基乙醇的水溶液，稀释液中，抗坏血酸的质量分数为1％，巯基乙醇的体积分数为0.5％。
76.热变失活；将加标稀释后的样本置于金属浴中，90℃加热15分钟。
77.水解孵育；将上一步骤中的样本置于高速冷冻离心机中，4℃，15000rpm离心10分钟，然后取上清溶液650μl转移到另一洁净ep管内，添加30μl大鼠血清，混匀后放于37℃恒温孵育箱内，孵育3小时以上(也可孵育过夜)。
78.固相萃取；固相萃取处理共分五步，分别为活化、平衡、上样、淋洗、洗脱。其中，活化液为400μl纯甲醇；平衡液为400μl 0.2％氨水；上样液为水解孵育后的溶液；淋洗液为100μl纯水；洗脱液为自配试剂(含90％甲醇，8％稀释液-同加标稀释中的稀释液，2％甲酸)；100μl洗脱两次；以上步骤控制流速为3-5秒一滴，上样和洗脱时略慢效果更佳。吹干复溶：洗脱下来的溶液在氮气下50℃加热吹干，再用100μl纯水复溶，震荡混匀后，离心10分钟，取上层清液90μl准备上机。
79.(3)上机检测并计算结果；
80.用已经优化好的色谱条件和质谱条件，在tqs或性能相当的液质联用仪上进行检测。
81.色谱条件见表1。
82.表1液相方法信息表
83.[0084][0085]
质谱条件如下。
[0086]
表2离子源参数信息表
[0087][0088]
备注：capillary：喷雾电压；cone(v)为锥孔电压；desolationtemp为脱溶剂气温度；desolation(l/hr)为脱溶剂气流速；cone(l/hr)为锥孔气流速。
[0089]
表3质谱方法信息表
[0090][0091]
[0092]
图1为质控样本qcm的质谱检测的总离子流图，其中，
①
四氢叶酸
②
5-甲基四氢叶酸
③
5-甲酰四氢叶酸
④
叶酸。
[0093]
检测数据用定量软件输出，红细胞中的各项指标(叶酸及其代谢物)均用实际检测浓度比上hct值计算所得，总叶酸的浓度由各项叶酸实际检测值加合计算所得，而活性叶酸比为5-甲基四氢叶酸与总叶酸的比值。
[0094]
实施例2
[0095]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中抗坏血酸作用浓度的不同，区别如下：抗坏血酸的质量分数为0.1％。
[0096]
实施例3
[0097]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中抗坏血酸作用浓度的不同，区别如下：抗坏血酸的质量分数为0.3％。
[0098]
实施例4
[0099]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中抗坏血酸作用浓度的不同，区别如下：抗坏血酸的质量分数为2％。
[0100]
实施例5
[0101]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中巯基乙醇作用浓度的不同，区别如下：巯基乙醇的体积分数为0.5％。
[0102]
实施例6
[0103]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中巯基乙醇作用浓度的不同，区别如下：巯基乙醇的体积分数为1％。
[0104]
对比例1
[0105]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中抗坏血酸浓度的不同，区别如下：抗坏血酸的质量分数为0.01％。
[0106]
对比例2
[0107]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中抗坏血酸浓度的不同，区别如下：抗坏血酸的质量分数为2.5％。
[0108]
对比例3
[0109]
一种叶酸及其代谢物的检测方法，大致与实施例1相同，区别在于，稀释液(同保护剂)中巯基乙醇作用浓度的不同，区别如下：巯基乙醇的体积分数为2.5％。
[0110]
试验例1
[0111]
检测实施例1提供的检测方法的精密度和加标回收率。
[0112]
试验结果见表4～表5。
[0113]
表4精密度检测结果
[0114]
检测精密度叶酸5甲基四氢叶酸5甲酰四氢叶酸四氢叶酸本底3.10％4.30％1.50％6.80％低质控加标4.90％4.10％4.60％0.80％高质控加标2.90％4.00％2.30％4.80％
[0115]
表5加标回收率结果
[0116]
加标回收率叶酸5甲基四氢叶酸5甲酰四氢叶酸四氢叶酸
低质控加标109.90％102.90％97.30％106.90％高质控加标109.50％107.50％112.10％112.10％
[0117]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。