用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜

1.本发明属于可穿戴生理指标检测领域，具体涉及一种用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜。


背景技术：

2.人体的健康诊断常规方式是血液分析，但是作为一种侵入性的分析方法，需要刺破皮肤并抽血，易导致创口感染，且采样过程较复杂，需要专业技术人员，不适用于长期连续地监测。而汗液作为具有潜在诊断意义的生物标志物的载体，可以提供人类生理健康状况和身体机能的相关信息。作为一种无创采样的方法，汗液比其他体液更易于获得，且能够进行连续的生物监测，提高慢性病的日常护理效果。汗液是身体用来调节体温，由汗腺分泌的一种非常重要的生物体液，主要成分是水，还包括调节体内渗透压的电解质离子：钠(na

)，氯(cl-)，钾(k

)；微量元素：钙(ca
2
)，镁(mg
2
)，铁(fe
2
)，维生素等；还有代谢物：葡萄糖，乳酸，尿素，尿酸，氨基酸和乙醇等，以及其他化合物，例如细胞因子，皮质醇，激素和小蛋白质等。这些汗液组成提供了大量有关生理和代谢状态的化学信息，并为汗液诊断提供帮助和指明方向。因此，一种可针对微量汗液进行一体化收集和处理的可穿戴设备具有重要意义。
3.利用汗液分析对人体进行健康监测，需要简易可行，且灵敏度、重现性高的方法。汗液分析涉及汗液收集，提取，储存和检测四个步骤。传统的汗液收集与后续步骤分离，无法满足动态、原位监控的需求，并且可能导致样品蒸发，降解或污染的问题。可穿戴设备在这些方面表现出卓越的性能，能够无创地监测汗液中的重要生物标志物，为个人提供了动态监测自身生理状况的机会。
4.而由于汗液中的相关指标含量较低，极性分布较广，同时监测多种微量待测物需要全面兼顾其特性。因此，选用薄膜叠加的固相萃取技术可以实现多种物质一体化处理。在汗液分析中，固相萃取技术可以实现收集、提取和储存为一体。薄膜微萃取不仅保留了传统纤维头快速、易操作的优点，而且利用薄膜大而薄的几何构造，增大了与固定相的接触面积，缩短萃取时间同时提升富集倍率。薄膜基质可以极性材料和非极性材料相结合，选用极性的纤维素萃取强极性物质，同时商业化的固相萃取材料聚二甲基硅氧烷(pdms)可以实现对弱极性物质的萃取。
5.pdms作为一种有机硅类的聚合物，具有良好的热稳定性、生物相容性、透光性和化学惰性等，是一种基于光刻蚀法制作微芯片、微薄膜的良好材料。利用光刻蚀技术可以在聚合物薄膜上产生所需的微结构，增大了传统意义上光滑薄膜的表面积，提升富集倍率。而光刻蚀过程中的倒模可以重复使用，聚合物具有生产成本低，生产量大且快速的优点。因此利用光刻蚀法制作有微结构的pdms薄膜，可用于汗液的收集、提取和存储。
6.微流控芯片具有体积小、功能强等优点，其通道尺寸常处于微米级别，试样和试剂消耗量小，更容易分析微量目标物，缩短分析时间，大大提升了实验效率。3d打印技术应用到微流控芯片的制备中，可实现制作工艺的标准化、一体化和自动化。相比于传统的光刻芯
片技术，缩短了芯片的制作时间，提高了加工的精密度，为一体式制备复杂结构的三维芯片奠定基础。
7.液相色谱质谱联用设备，结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力，与质谱仪特有的组分鉴定能力。是一种高自动化的分离分析复杂有机混合物的有效手段。能够准确鉴定和定量复杂样品基质中的微量化合物，具有较高的灵敏度和精密度，能够快速分析，同时检测，可多个化合物结合分析，并且所需样品量少等优点，广泛应用于生物和化学等领域，并已成为一种重要的分析技术。


技术实现要素：

8.本发明针对现有技术的不足，提供一种用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜。
9.用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜，利用光刻蚀的方法制作具有微阵列的非极性pdms薄膜，该薄膜的中间有微颗粒阵列作为萃取单元，四周设有固定放置ph试纸的位置，分别放置一种广泛试纸和三种精密试纸，再与一层极性的纤维素薄膜结合，封装成为一体的可穿戴汗液分析薄膜，最后用购买的医用无菌敷贴将其固定在人体皮肤上。待汗液与两层薄膜充分接触后取下，微颗粒阵列薄膜和纤维素薄膜分离后分别置于洗脱芯片和超声仪浸泡洗脱，洗脱液用液相色谱质谱仪器检测。此外ph试纸也会随之变色，用移动电话拍下照片，可根据基于matlab编写的程序确定汗液的ph值范围。即可得各汗液指标的情况，进而分析人体的健康状态。
10.采用薄膜微萃取的方式对汗液中的待测物进行萃取和富集，所述薄膜分为两层，一层为光刻蚀制备的非极性聚合物薄膜，中间有微颗粒阵列作为萃取单元，能够增大与样品的接触面积，周围光滑的部分透光性较好，四个位置放置ph试纸，能较好地分辨颜色变化，该层薄膜由疏水性的pdms制成，主要萃取极性较弱的物质。另一层为极性纤维素薄膜，依照灵敏度需要选用合适的宣纸，置于整个穿戴设备的最底层，直接与人体皮肤接触，既可阻挡皮肤上一些灰尘或其他物质的污染，又具有较好的吸水性，且是亲水材料，主要萃取极性较强的物质。
11.上述方案中，所述双层薄膜的长为30-40mm，宽为20-28mm。
12.上述方案中，所述共集成四种ph试纸，其中广泛ph试纸的测量范围为ph 1-14，三种精密试纸的测量范围分别为ph 3.8-5.4，5.4-7.0和5.5-9.0。
13.上述方案中，所述用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜，包含以下步骤：
14.(1)用无菌敷贴将制备好的双层可穿戴汗液分析设备固定在人体皮肤上，然后运动收集汗液；
15.(2)薄膜被完全润湿后，用移动电话拍照，利用已有的颜色提取计算程序根据照片测定汗液的ph范围；
16.(3)将其从人体皮肤上取下，两层薄膜分离，微颗粒阵列薄膜放入洗脱芯片中，洗脱剂在其表面缓慢流过从而充分接触目标物质洗脱，纤维素薄膜放入超声仪中浸泡洗脱，将洗脱液用液相色谱质谱联用仪检测。根据线性方程，将得到的检测信号换算成浓度。
17.上述方案中，所述的汗液指标包括极性较弱的皮质醇、尿酸，极性较强的酪氨酸、硫胺素、抗坏血酸，以及汗液的ph值。
18.上述方案中，所述移动电话在固定光源下，放大1-10倍拍照。
19.上述方案中，所述最终所得ph结果为使用matlab编写的颜色提取计算程序，通过提取各部分ph试纸的rgb值a(r1，g1，b1)，与标准库中每一个标准ph值的rgb值b(r0，g0，b0)比较，用欧式距离公式计算出空间三维距离，经过数据分析和聚类比对，结合标准数据库确定最终ph范围；汗液ph的检测范围为ph 4.0-9.0；欧式距离公式：
20.上述方案中，所述萃取时间为1-25min，即出汗后保留的时间。
21.上述方案中，所述洗脱芯片由上下两部分组成。上部分包括洗脱液进样口，薄膜承载槽和洗脱液出口，薄膜承载槽上有一段总长为70-80mm的鱼肠状通道。下部分为对应承载槽的支撑台，周围套有o型密封圈。上下两部分均有八个固定螺丝的贯穿孔道，位于承载槽和支撑台的四周。把薄膜放入承载槽后，下部分的支撑台对准放入，再用八个螺丝和螺母固定，使上下两部分紧密压实。
22.上述方案中，所述洗脱芯片中的洗脱溶剂从进样口进入，通过鱼肠状通道时，洗脱剂与薄膜充分接触，溶解薄膜上的待测物洗脱下来，然后通过出样口流出芯片。
23.上述方案中，所述洗脱微颗粒阵列薄膜的洗脱剂是含甲酸的乙腈溶液，洗脱纤维素薄膜的是含甲酸的甲醇溶液，甲酸的含量为0.05-0.5％。含少量的甲酸能促进洗脱完全，和促进分析物电离。微颗粒阵列薄膜体系中目标物质极性较弱，使用较弱极性的乙腈能更好地洗脱，检测得到的离子强度最强。纤维素薄膜体系中的目标物质极性较强，因此使用极性较强的甲醇溶液。
24.上述方案中，所述洗脱液体积为38-80μl含甲酸的乙腈溶液，和40-80μl含甲酸的甲醇溶液。洗脱液在洗脱过程中有残留在洗脱芯片或其他容器中，体积过小检测的进样量受限，体积过大，目标物在溶剂中的浓度过小。
25.上述方案中，所述洗脱芯片中，洗脱微颗粒阵列薄膜的洗脱剂流速为1-40μl/min，流速过小虽然与薄膜接触时间较长，但是由于在洗脱芯片中停留时间过长，芯片材料会微量溶解于洗脱溶剂中，对目标物离子检测形成掩蔽效应，流速过大则洗脱剂与薄膜接触时间较短，溶解在洗脱剂里的目标物质较少。
26.上述方案中，所述洗脱纤维素薄膜的超声浸泡时间为3-30min，浸泡时间短则待测物溶解在洗脱剂里的量少，而达到上限后，增长超声时间也不能增大溶解量。
27.上述方案中，所述洗脱纤维素薄膜的超声仪温度为15-35℃。
28.上述方案中，所述检测5种目标待测物的线性范围为0.0188-1200μg/l，检测限为0.004-0.08μg/l。
29.上述方案中，所述储存时间为0-168h，即从人体皮肤上取下后可密封储存的时间。
30.上述方案中，所述固定于人体皮肤较平坦区域，如手臂、腿部、额头、颈侧等适用该可穿戴薄膜汗液检测的部位。
31.本发明所述用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜工作原理为：光刻蚀法制作的微颗粒阵列薄膜和纤维素薄膜均是多孔且具有吸附性，是很好的固相萃取材料，对极性物质和非极性物质分别有很好的富集效果。两种薄膜结合ph试纸封装成一体的可穿戴汗液分析设备，用无菌敷贴将其固定在人体皮肤上，然后运动发汗，待汗液被充分萃取后，用移动电话拍照，用已编写好的颜色提取程序确定ph范围。将可穿戴设备从人体皮肤上取
下，两层薄膜分离，微颗粒阵列薄膜放入洗脱芯片中，洗脱剂在其表面缓慢通过从而充分接触待测物进行洗脱，纤维素薄膜放入超声仪中浸泡洗脱，得到的两部分洗脱液用液相色谱质谱联用仪检测。
32.本发明的有益效果如下：
33.(1)本发明的微颗粒阵列薄膜在传统光滑的薄膜上增加了大量颗粒状的萃取单元，不仅增大了与目标样品的接触面积，扩大了富集倍率，而且利用光刻蚀的方法制备能循环利用光倒膜，扩大了生产方式，降低生产成本。
34.(2)本发明将两层不同极性的薄膜和ph试纸整合封装为一体，作为固相萃取剂可以分别富集不同极性的目标物质，扩大了检测范围，集检测ph值和多种目标物质于一体，避免了复杂的样品前处理方式，降低了操作难度，简便、高效，大大提高了分析效率。
35.(3)本发明体积小，易携带，不会影响人体的正常活动，收集汗液时可以进行任何形式的运动发汗，不拘泥于传统的静态运动形式，也可对远距离的样品进行采样分析。并且属于非侵入性的生理指标分析方法，可实现长期连续的日常采样工作，对人体无伤害和副作用。
36.(4)洗脱芯片能利用微通道控制洗脱剂的流速，进而控制与目标物之间的接触来控制洗脱效率，使待测物在洗脱溶剂和薄膜之间很快达到萃取平衡，降低了操作难度，且溶剂消耗量小，降低了微量样品的处理难度。该洗脱芯片消除了传统意义上利用注射器和筛板固定薄膜的方式中，薄膜大小裁剪较难，且需要筛板来固定位置，溶剂消耗量大，使得检测误差大，重复性低等问题。
附图说明
37.图1为双层类固定相可穿戴设备的实物图，其中最上一层为微颗粒阵列聚合物薄膜，它的中部是具有微颗粒阵列的萃取部分。周围为四种ph试纸，1号ph试纸为检测范围1-14的广泛试纸，2号ph试纸为检测范围5.5-9.0的精密试纸，3号ph试纸为检测范围5.4-7.0的精密试纸，4号ph试纸为检测范围3.8-5.4的精密试纸。最下层为纤维素薄膜，可直接接触人体皮肤。
38.图2为双层类固定相可穿戴设备的结构图，其中最上一层较大的薄膜为无菌敷贴，第二层为光刻蚀法制作的微颗粒阵列薄膜，中间部位是具有微颗粒阵列的萃取部分。第三层为四种ph试纸，左上为检测范围1-14的广泛试纸，左下为检测范围5.5-9.0的精密试纸，右上为检测范围5.4-7.0的精密试纸，右下为检测范围3.8-5.4的精密试纸。最下面的一层为纤维素薄膜。
39.图3为微颗粒阵列聚合物薄膜的微颗粒阵列部分的电镜表征图。
40.图4为洗脱芯片两部分分开的实物图，分为上下两部分，上部分有洗脱液进样口、出样口和薄膜承载槽，薄膜承载槽中有鱼肠状通道可供洗脱液与薄膜中的待测物充分接触。下部分是对应承载槽的带有o型密封圈的支撑台，上下两部分均有八个贯穿的孔道，位于承载槽和支撑台的四周。
41.图5为洗脱芯片两部分合并搭置完成的实物图。把薄膜放入承载槽后，下部分的支撑台对准放入，上下两部分用八个螺丝和螺母固定，紧密压实。洗脱液从上端的进样口进入后，通过鱼肠状通道将薄膜中的目标物质洗脱出来，然后从侧面的出样口流出芯片。
具体实施方式
42.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
43.用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜，聚合物微颗粒阵列薄膜在传统光滑的薄膜上增加了大量颗粒萃取单元，增大了与目标样品的接触面积，扩大了富集倍率。将两层多孔且具有吸附性的不同极性的薄膜和ph试纸整合封装为一体，可以富集宽极性的目标物质，扩大了检测范围，集检测ph值和多种目标物于一体。整个可穿戴设备体积小，易携带，不会影响人的正常活动，可以进行任何形式的运动发汗，属于非侵入性的分析方法，可实现长期连续的日常采样工作，对人体无任何伤害和副作用。洗脱芯片能利用微通道控制洗脱溶剂与目标物之间的接触流速，进而控制洗脱效率，降低了操作难度，提高检测精密度。
44.如图1和图2所示的双层类固定相可穿戴汗液分析设备，用无菌敷贴将其固定在人体皮肤上，然后进行运动，直到开始发汗，待汗液将纤维素薄膜完全浸湿并充分接触微颗粒阵列薄膜的萃取单元后，用移动电话拍照，利用颜色提取计算程序进行ph范围的测定。将可穿戴设备从人体皮肤上取下，将两层薄膜分离，微阵列薄膜放入图3和图4所示的洗脱芯片中洗脱，洗脱剂在薄膜表面缓慢通过，从而充分接触目标样品将其洗脱下来，纤维素薄膜放入超声仪中浸泡洗脱，得到的两部分洗脱液利用提供的液相色谱质谱联用仪检测；
45.液相色谱质谱检测的工作方法是：通过流动相带动样品进入分离色谱柱，利用物质在固定相和流动相中的分配系数差异达到分离的效果，再进入质谱检测器检测得到目标物质的分子量，从而提供定性、定量和峰纯度等信息。目标物质首先通过优化其萃取条件和洗脱条件，定量得到峰面积和物质浓度的线性关系，此后可根据得到的峰面积换算得目标物质的浓度。
46.实施例1
47.用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜，其特征在于，包括如下步骤：
48.(1)首先利用光刻蚀的方法制作出微颗粒阵列聚合物薄膜，裁剪ph试纸的大小(长为3mm，宽为6mm)，纤维素薄膜的大小(长为36mm，宽为23mm)，将微颗粒阵列聚合物薄膜、ph试纸、纤维素薄膜依次贴紧固定封装成一体可穿戴设备；
49.(2)其次用无菌敷贴将其固定在志愿者一的手臂前端皮肤上，在25℃室温下进行20min的登山器运动，开始发汗后等待10min；
50.(3)然后用移动电话拍下汗液浸湿可穿戴设备的图片，将其取下，两层薄膜分离，微颗粒阵列薄膜放入图3和图4所示的洗脱芯片中，用洗脱剂充分接触样品(皮质醇和尿酸)将其洗脱下来，纤维素薄膜放入超声仪中，将目标物质(酪氨酸、硫胺素、抗坏血酸)洗脱下来，得到的两部分洗脱液用提供的液相色谱质谱联用仪检测；
51.(4)根据检测所得提取各目标物质的eic分子量图，积分得到峰面积，再根据线性方程换算得到浓度。移动电话拍下颜色变化的图片传入电脑，使用颜色提取计算程序确定汗液的ph范围。
52.其中，微颗粒阵列型薄膜的洗脱溶剂为55μl含0.1％甲酸的乙腈溶液，以5μl/min的流速洗脱。纤维素薄膜在超声仪中于35℃下，用50μl含0.1％甲酸的甲醇溶液超声10min。
53.本实施例中志愿者一的手臂采样检测结果如下：
[0054][0055]
该志愿者的相关指标的浓度检测结果均在正常范围，其中皮质醇稍高；ph偏弱酸性，属正常范围。根据以上指标表明，该志愿者可能中短期存在一定的压力，睡眠质量相对一般，但在正常范围，身体的生理代谢能力和营养状态均正常，没有出现因尿酸过高产生的痛风症状。与志愿者自身描述的身体状况对应，实现了对汗液中相关指标反应人体健康状况的准确表达。
[0056]
以上结果表明，我们所构建的用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜可以实现对人体汗液相关指标的准确检测，这使得该分析设备和方法在人体代谢的检测和疾病预知的可穿戴领域具有潜在的应用价值。
[0057]
实施例2
[0058]
用于汗液指标分析的可穿戴类固定相双层薄膜，其特征在于，包括如下步骤：
[0059]
(1)首先利用光刻蚀的方法制作出微颗粒阵列聚合物薄膜，裁剪ph试纸的大小(长为3mm，宽为6mm)，纤维素薄膜的大小(长为36mm，宽为23mm)，将微颗粒阵列聚合物薄膜、ph试纸、纤维素薄膜依次贴紧固定封装成一体的可穿戴设备；
[0060]
(2)其次用无菌敷贴将其固定在志愿者二的额头皮肤上，在25℃室温下进行20min的登山器运动，开始发汗后等待10min；
[0061]
(3)然后用移动电话拍下汗液浸湿可穿戴设备的图片，将其取下，将两层薄膜分离，微颗粒阵列薄膜放入图3和图4所示的洗脱芯片中，用洗脱溶剂充分接触样品(皮质醇和尿酸)将其洗脱下来，纤维素薄膜放入超声仪中，将目标物质(酪氨酸、硫胺素、抗坏血酸)洗脱下来，得到的两部分洗脱液利用提供的液相色谱质谱联用仪检测；
[0062]
(4)根据检测所得提取各目标物质的eic分子量图，积分得到峰面积，再根据线性方程换算得到浓度。移动电话拍下颜色变化的图片传入电脑，使用颜色提取计算程序确定汗液的ph范围。
[0063]
其中，微颗粒阵列型薄膜的洗脱溶剂为55μl含0.1％甲酸的乙腈溶液，以5μl/min的流速洗脱。纤维素薄膜在超声仪中于35℃下，用50μl含0.1％甲酸的甲醇溶液超声10min。
[0064]
本实施例中志愿者二的额头采样检测结果如下：
[0065][0066]
该志愿者相关指标的浓度检测结果均在正常范围，其中尿酸稍高，酪氨酸和硫胺素稍低；ph偏弱酸性，属正常范围。根据以上指标表明，该志愿者身体代谢能力稍弱，但在正常范围，身体的各生理指标代谢能力和营养状况均正常，没有出现因尿酸过高产生的痛风症状。与志愿者自身描述的身体状况对应，实现了对汗液中相关指标反应人体健康状况的准确表达。
[0067]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或
变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。