基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片及高通量细胞内电信号连续监测系统

1.本发明涉及生物传感器的微加工技术，尤其涉及一种基于纳米多孔膜电穿孔的高通量细胞电信号连续监测系统。


背景技术：

2.人体有两个至关重要的器官，一是大脑，二是心脏。前者是人体的控制中心，几乎所有的正常生理活动都由大脑直接或者间接控制；后者为血液流动提供动力，将血液运输到身体的各处，维持人体的正常生理活动。然而，目前心血管疾病成为了现代人类健康的头号杀手。
3.心力衰竭、高血压、冠心病以及心律失常等心血管疾病，大部分都与心脏的生理活动如机械性搏动有关，心脏的机械性搏动等生理行为又与细胞的电生理活动密切相关。为了预防和治疗心血管疾病，研究人员对心脏工作机理以及细胞电生理活动展开了长足的研究。心脏电生理机理的研究建立的模型主要分在体动物模型和离体动物模型，其中离体动物模型是在单细胞或细胞网络水平上监测和分析心肌细胞或神经元的电生理特性。目前监测单细胞电生理活动主要有两种方法：膜片钳记录技术以及微电极阵列技术。
4.膜片钳技术是一种精准测量跨膜离子电流的方法。细胞内和细胞之间的信号过细胞膜上的离子通道传输，离子通道由细胞产生的一些特殊蛋白质组成，聚集镶嵌在细胞膜上，这些离子通道存在选择性和开关性，通过对特定离子的浓度调控实现信号传递。在体内，不同种类的离子穿过离子通道产生电流，刺激神经元以及肌肉细胞；在感觉器官中，通道将物理或者化学刺激转为神经系统的电信号。即使与中枢神经系统无关的细胞，如血液中的血细胞、免疫系统的白细胞、肝脏或者其他器官的细胞，也会使用离子通道进行信号传递。
5.目前膜片钳技术是检测细胞电信号的“金标准”，它是一种通过记录膜上离子通道的电流变化来反映膜上各种离子转运活动的技术，实验人员把一个玻璃微电极吸附在一片面积只有几平方微米的细胞膜表面上，微电极与细胞膜表面紧密相连，导致当膜上的单个离子通道打开时，所有移动的离子都流入到玻璃微电极中，从而产生电流，再通过电流放大器放大便可记录到电流的变化。早期，制约该技术的精度主要是吸附膜的面积以及电极与膜吸附的紧密程度，虽然可以检测到电流的变化，但是噪声较大。后来随着研究人员对技术的不断改进完善，他们发现通过对玻璃微电极的表面进行清洁以及对玻璃微电极增加一个负压后，可以大大减少微电极与膜的接触面积以及使微电极与膜的吸附更加紧密，使微电极的尖端与吸附的膜表面形成gω级的封闭电阻，大大降低了背景噪声，提高了信噪比，形成机械隔离与电隔离。
6.膜片钳检测技术作为最早发展的电生理研究技术，一般通过电压或者电路钳制来检测细胞膜上离子通道的变化情况，信号检测的时空分辨率高、信噪比高，一直被研究人员作为细胞电信号检测的“金标准”，但是该技术的操作难度大，需要经验丰富的实验人员才
能完成；而且膜片钳技术一般是针对单个细胞进行电信号记录，效率低下；更为关键的是，膜片钳检测技术是一种侵入式的检测方法，对细胞会造成一定的损伤导致无法长时间检测细胞的电生理活动，大大限制了该技术的应用场合。随着微电子技术的迅速发展，基于微电极阵列的细胞电信号检测技术以其非侵入式、长时间信号记录以及通量高等优势引起了研究人员的注意。
7.微电极阵列(microelectrode arrays)是指那些通过微纳加工工艺将细胞尺寸大小的电极图案加工在某些生物相容性好的基底上形成的芯片，将此用于高通量同步检测细胞电信号。微电极阵列技术至今已经发展了50余年，它的源头可以追溯到1972年，thomas小组首次结合微电子技术开发了微电极阵列并成功记录到体外培养的鸡胚胎的电信号。之后，gross小组利用薄膜光刻和电镀工艺以及紫外激光微束方法制备了高密度的微电极阵列成功检测到蜗牛的脑神经元细胞的电生理活动。pine小组采用微电极阵列技术检测胞外电信号的同时也用膜片钳技术同时检测胞内电信号，证实了膜片钳检测到的细胞内动作电位与微电极检测到的胞外电信号存在联系。此后，微电极阵列技术被广泛应用在检测心肌细胞与神经元细胞的电生理活动。在心肌细胞的相关研究上，meas以其操作简单、高通量长时间检测细胞电信号等优势在心脏研究、心脏相关药物筛选等研究领域起着越来越重要的作用；在神经元细胞的相关研究上，meas以其高通量多通道的特性，常被用于研究神经电生理，包括药物作用下神经细胞电生理活动的变化、视网膜神经以及嗅觉神经受到刺激后的电生理活动变化等。
8.在对细胞电生理的研究中，研究人员总是对细胞内的电信号更感兴趣。在检测单细胞电生理活动的两种方法中，前者膜片钳记录技术虽然能够实现对细胞电生理信号高精度、低噪声的记录，但是其操作复杂、难度系数大、通量低、对细胞损伤不可逆一直是一个不可忽视的缺点；后者微电极阵列技术可以实现非侵入式的长时间高通量的记录细胞外电信号，在某些应用场合下如观察是否出现心律失常以及心肌细胞的搏动频率，这些细胞外电信号足以说明问题，但是这个电信号与天然的跨膜电位相比，还是会缺少一些关键特征，阻碍我们研究心肌细胞的电生理活动。
9.近些年，利用微电极阵列结合电穿孔的技术，在多通路记录心肌细胞内电信号方面取得了乐观的进展。通过在微电极阵列施加低电压(～2v)的电脉冲，可以有效地将细胞膜穿孔，从而实现微电极接触到细胞内环境。因此，微电极可以记录到细胞内的动作电位发放。另一方面，由于微电极阵列具有多通路记录的性能，因此微电极电穿孔的技术，能够实现多个心肌细胞的胞内电信号进行同步记录。但是，微电极阵列是基于实心衬底和实心固态电极结构，不具有多通路微流器件集成往细胞递送药物的性能。因此，对于常规的微电极阵列芯片，药物只能往细胞培养液中直接添加，不具有空间分辨性能。虽然微电极具有多个通路，但所记录的细胞电信号是类同的，在单个微电极阵列芯片上不具有高通量测试多种药物的性能。
10.因此如何设计出一种非侵入式高通量、更长时间(例如半时以上)稳定监测心肌细胞内电信号的系统，从而帮助研究人员更好的研究心肌细胞电生理特性，是本领域技术人员亟需解决的问题。


技术实现要素：

11.本发明的目的是针对现有技术无法实现非侵入式的高通量、长时间稳定监测心肌细胞胞内电信号的问题，开发了基于纳米多孔膜电穿孔的微电极微流芯片及高通量细胞内电信号连续监测系统，实现高通量、长时间(》半小时)稳定测量心肌细胞电信号记录。通过将具有纳米小孔(直径400-1000nm)的多孔膜作为芯片衬底，在其表面微加工制备金属微电极阵列，并利用光刻胶将非电极部位进行绝缘。进而利用光刻技术结合二甲基硅氧烷(pdms)倒模制备多微流道器件。纳米多孔膜微电极可以集成于微流道器件上方。通过纳米多孔膜微电极底部的微流道施加药物测试溶液，药物测试溶液可以沿着纳米多孔膜的纳米孔扩散到微电极上方的细胞。而心肌细胞培养于纳米多孔膜微电极表面，受到纳米孔底部的微流道递送的药物溶液的影响，改变其动作电位信号。另一方面，纳米多孔膜微电极能记录到培养于其表面的心肌细胞的细胞外动作电位信号。而通过微电极施加电脉冲，细胞膜能够被瞬间击穿，使得微电极记录到细胞内的动作电位。由于纳米多孔膜表面的微纳拓扑结构与细胞具有较好的耦合效应，电穿孔后细胞膜破裂时长能被有效的延长，从实验结果细胞内的电信号记录能维持半小时以上。
12.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
13.一种基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片，包括：纳米多孔膜(nanoporous membrane)基底和附着在纳米多孔膜基底上的微电极阵列。
14.进一步地，所述纳米多孔膜基底的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯。
15.进一步地，还包括：集成于所述纳米多孔膜基底底部的微流道器件。
16.进一步地，所述微流道器件为具有多通道(4-10个通道)的二甲基硅氧烷(pdms)微流道芯片。
17.一种基于纳米多孔膜电穿孔的高通量细胞电信号监测系统，包括：
18.纳米多孔膜微电极阵列传感器，包括前述基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片以及固定在微电极阵列芯片上方的细胞培养腔，所述纳米多孔膜微电极阵列传感器主要用于检测细胞电信号。
19.传感器电信号调理模块，主要用于对纳米多孔膜微电极阵列传感器检测到的细胞电信号进行滤波以及放大。
20.电穿孔电路模块，与纳米多孔膜微电极阵列传感器上的电极连接，主要用于控制电穿孔信号的开启与关闭。
21.信号采集模块，所述信号采集模块与传感器电信号调理模块连接，用于接收并记录传感器检测到的细胞电信号；所述信号采集模块与电穿孔电路模块连接，作为脉冲源，产生不同条件下的脉冲，而电穿孔电路模块作为采集卡与电极之间的开关，达到在任意时间内对电极施加不同电穿孔信号的目的。
22.上位机模块，与信号采集模块连接，用于显示检测到的细胞电信号和/或控制产生不同的脉冲信号。
23.电源模块，主要为传感器电信号调理模块、电穿孔电路模块以及信号采集模块供电。
24.进一步地，所述传感器电信号调理模块由依次连接的一级放大器模块、高通滤波器模块、低通滤波器模块以及二级放大器模块组成。
25.进一步地，所述信号采集模块为信号采集卡。
26.进一步地，纳米多孔膜微电极阵列传感器上设置有排针，传感器电信号调理电路板上设有相应的插孔，每个排针与每个工作电极相连，同时电路板上的插孔与传感器电信号调理模块连接；同时数据采集模块的输入端与传感器电信号调理模块的输出端相接，数据采集模块的模拟输出端与电穿孔电路模块的输出线连接，数据采集模块的输出端与上位机的输入端连接。
27.进一步地，所述纳米多孔膜微电极阵列传感器由以下步骤制备：
28.(1)选用基底厚度为0.5mm的多孔膜，在上面旋涂一层rzj-390pg-50正性光刻胶，并在120℃的热板上加热2分钟。
29.(2)在多孔膜上覆盖金属掩模版并进行曝光，再用rzx3038显影液显影35s去除多余的光刻胶。
30.(3)接着在基底上磁控溅射10nm后的ti，再溅射100nm厚的au，然后用丙酮剥离光刻胶以及多余的金属，形成电极以及导线。
31.(4)然后为传感器覆盖绝缘层，先用su-82002光刻胶旋涂，厚度2μm，在95℃的热板上加热1分钟，利用金属掩模版曝光后在95℃下加热1分钟，再用丙二醇甲醚醋酸酯(pgmea)显影1分钟，最后用异丙醇清洗，用氮气枪干燥并在150℃下坚膜一小时。
32.进一步地，多通道微流道器件的制备如下：将聚二甲基硅氧烷(pdms)和固化剂以10： 1的比例均匀混合，倒在准备好的微流道模具上，并在90℃下固化一个半小时。微流体通道长度10mm，宽度200μm，厚度100μm.
33.进一步地，传感器芯片制备完成后，需要对其进行封装，封装的主要流程如下：
34.首先准备聚二甲基硅氧烷(pdms)和固化剂，pdms与固化剂比例为10：1，然后在特定的pcb基板上涂抹一层pdms固化剂，再将芯片粘贴固定在pcb基板上，让芯片的电极与pcb基板的金属接口对齐，在接口与电极之间用导电银胶连接导通，然后放到80℃的烘箱中加热8分钟左右，完成固化；接着在芯片上用pdms固化剂固定玻璃培养腔，同样放在烘箱中加热固化；最后在pcb基板上焊接排针。接着在微电极芯片的底部贴上多通道微流道，并利用导管与外部输送溶液的泵相连接。
35.进一步地，本系统还加了一个金属屏蔽箱，用于屏蔽工频噪声及高频噪声。
36.与现有的技术相比，本发明的优点如下：
37.1.以多孔膜为基底制备微电极阵列传感器，利用多孔膜的多孔特性，生成凹凸不平的三维电极结构，通过增大电极与细胞之间的接触面积来加强耦合，从而能够获得更高质量的电信号记录。
38.2.将纳米多孔膜微电极阵列传感器集成在微流道器件上方，利用微流道多通道的特性，在不同通道的微流道施加药物测试溶液，可以进行高通量药物实验测试，实现高通量筛选药物。
附图说明
39.图1是微电极阵列芯片结构示意图；
40.图2是多孔膜微电极阵列芯片加工过程示意图；
41.图3是包含基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片的微电极阵列传感器与微流道器件
结构示意图；
42.图4是高通量心肌细胞电信号记录系统的系统框图；
43.图5是微电极阵列传感器电信号调理模块示意图；
44.图6是细胞电信号调理电路原理图；
45.图7是电穿孔电路模块示意图；
46.图8是电穿孔电路原理图；
47.图9是系统记录到的胞外电信号图；
48.图10是系统记录到的胞内电信号图；
49.图中，排针1、细胞培养玻璃腔2、参考铂丝电极3、pcb基板4、纳米多孔膜基底5、微电极阵列6、多孔膜基底的微电极阵列传感器7、细胞电信号调理电路8、供微电极阵列传感器芯片连接的排针插孔9、电信号调理电路pcb基板10、电信号调理电路输出端子11、数据采集卡输入端12、电信号调理电路模块电源输入端13、供电穿孔电路模块连接的排针插孔 14、电穿孔电路模块排针15、电穿孔电路输出端子16、数据采集卡输出端17、电穿孔电路模块电源输入端18、电穿孔电路pcb基板19、电穿孔电路20、一级放大器21、高通滤波器 22、低通滤波器23、二级放大器24、一段胞外电信号25、一个胞外电信号26、一段胞内电信号27、一个胞内电信号28、微流道器件29。
具体实施方式
50.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明。
51.一种基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片，如图1所示，包括：纳米多孔膜基底5和附着在纳米多孔膜基底5上的微电极阵列6。
52.所述基于多孔膜的微电极阵列芯片由于多孔膜表面的微纳拓扑结构与细胞具有较好的耦合效应，电穿孔后细胞膜破裂时长能被有效的延长，从实验结果细胞内的电信号记录能维持半小时以上。作为优选方案，所述纳米多孔膜基底的材料为聚对苯二甲酸乙二醇酯(pet)，示例性地，基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片可以采用如下方法进行制备，制备流程如图2 所示：
53.(1)选用基底厚度为0.5mm的纳米多孔膜，在上面旋涂一层rzj-390pg-50正性光刻胶，并在120℃的热板上加热2分钟。
54.(2)在纳米多孔膜上覆盖具有微电极阵列图案的金属掩模版并进行曝光，再用 rzx3038显影液显影35s去除多余的光刻胶。
55.(3)接着在纳米多孔膜基底上磁控溅射10nm后的ti，再溅射100nm厚的au，然后用丙酮剥离光刻胶以及多余的金属，形成电极以及导线。
56.(4)然后在表面覆盖绝缘层，先用su-82002光刻胶旋涂，厚度2μm，在95℃的热板上加热1分钟，利用金属掩模版曝光后在95℃下加热1分钟，再用丙二醇甲醚醋酸酯(pgmea)显影1分钟，最后用异丙醇清洗，用氮气枪干燥并在150℃下坚膜一小时后即获得基于多孔膜的微电极阵列芯片。
57.所述微电极阵列6主要是作为工作电极，为了尽量降低电极之间的串扰，微电极阵列6的电极之间需要具有一定间距。
58.为了便于电路连接，作为一优选实施方案，还设置有pcb基板，将微电极阵列芯片
固定于pcb 基板上，并将微电极阵列6的电极与pcb基板上的金属接口对齐并连接导通。
59.进一步地，所述微电极阵列芯片还包括：集成于所述纳米多孔膜基底的微流道器件29，微流道器件29优选为二甲基硅氧烷微流道芯片。微流道器件29的制备如下：将聚二甲基硅氧烷 (pdms)和固化剂以10：1的比例均匀混合，倒在准备好的微流道模具上，并在90℃下固化一个半小时。微流体通道长度10mm，宽度200μm，厚度100μm。
60.通过纳米多孔膜微电极底部的微流道施加药物测试溶液，药物测试溶液可以沿着纳米多孔膜基底5的纳米孔扩散到微电极上方的细胞。而心肌细胞培养于纳米多孔膜微电极表面，受到纳米孔底部的微流道递送的药物溶液的影响，改变其动作电位信号，实现多种药物测试的性能。
61.与前述微电极阵列芯片相对应的，本发明还提供了一种纳米多孔膜微电极阵列传感器，图3 是包含前述基于纳米多孔膜的微电极阵列芯片的微电极阵列传感器与微流道器件结构示意图，如图3所示，基于纳米多孔膜的微电极阵列传感器主要由作为工作电极的微电极阵列6、参考铂丝电极3、细胞玻璃培养腔2、纳米多孔膜基底5以及pcb基板4组成。微电极阵列6的尺寸为20mm
×
20mm，共32个工作电极，每个工作电极的直径为10μm，工作电极的最小间距设置为150μm，工作电极通过导电银胶与pcb基板4连接。细胞玻璃培养腔2用pdms 固化剂固定在纳米多孔膜基底5上，参考铂丝电极3一端与地连接，一端置于细胞玻璃培养腔2内。
62.pcb基板4上分布4组排针1，通过排针1与供微电极阵列传感器芯片连接的排针插孔9 连接。
63.与前述纳米多孔膜微电极阵列传感器相对应的，本发明还提供了一种高通量细胞内电信号连续监测系统，图4是高通量细胞内电信号连续监测系统结构示意图，如图4所示，包括：
64.纳米多孔膜微电极阵列传感器7，主要用于检测细胞电信号。
65.传感器电信号调理模块，主要用于对纳米多孔膜微电极阵列传感器7检测到的细胞电信号进行滤波以及放大。
66.电穿孔电路模块，主要用于控制电穿孔信号的开启与关闭。
67.信号采集模块，用于接收并记录传感器检测到的细胞电信号和产生不同条件下的脉冲电穿孔信号，一般可以采用数据采集卡。
68.上位机模块，用于显示检测到的细胞电信号和/或控制产生不同的脉冲信号。
69.电源模块，主要为传感器电信号调理模块、电穿孔电路模块以及信号采集模块供电。
70.具体地，如图5所示，所述传感器电信号调理模块由细胞电信号调理电路8、供微电极阵列传感器芯片连接的排针插孔9、电信号调理电路pcb基板10、电信号调理电路输出端子 11、电信号调理电路电源输入端13、供电穿孔电路模块连接的排针插孔14组成。纳米多孔膜微电极阵列传感器7通过排针1插在排针插孔9上，实现工作电极与细胞电信号调理电路 8的对应连接，将检测的细胞电信号输入至细胞电信号调理电路8进行滤波以及放大处理。细胞电信号调理电路8主要由一级放大器21、高通滤波器22、低通滤波器23、二级放大器 24组成，图6所示为一示例性电信号调理电路图，具体参数如图6所示，每个细胞电信号调理电路8都是双通道，与32个工作电极相对应的，整个传感器电信号调理模块共有16个同样的
电路，共32通道，每个通道的输出汇集到电信号调理电路输出端子11，同时电信号调理电路输出端子11与数据采集卡的输入端12连接，电信号调理电路模块电源输入端13外接
±
5v电源供电。此外，供电穿孔电路模块连接的排针插孔14与电穿孔电路模块连接。
71.进一步地，图7所示为一电穿孔电路模块结构示意图，电穿孔电路模块由电穿孔电路模块排针15、电穿孔电路输出端子16、电穿孔电路模块电源输入端18、电穿孔电路pcb基板 19、电穿孔电路20组成。电穿孔电路模块通过排针15插在排针插孔14上，从而与纳米多孔膜微电极阵列传感器7的工作电极连接。电穿孔电路20的原理图如图8所示，通过开关控制 pmos管工作，当开关控制输入低电平0v，此时q2开启，电压跟随器u2工作，同步输出脉冲信号。图8所示原理图中的运放是单运放，控制单个工作电极的电穿孔，与32个工作电极相对应的，需要32个相同的电路；优选地，电穿孔电路20可以采用四运放，控制四个通道的电穿孔，则与32个工作电极相对应的，只需要8个同样的电路。每个通道的输出汇集到电穿孔电路输出端子16上，同时电穿孔电路输出端子16与数据采集模块的输入端17相连，电穿孔的脉冲信号由数据采集模块提供。
72.进一步地，本发明的细胞电信号采集工作过程如下：在细胞玻璃培养腔中培养小鼠的心肌细胞，开启电源，系统开始工作，纳米多孔膜微电极阵列传感器7的工作电极采集获得心肌细胞的胞外电信号，传输至传感器电信号调理模块进行滤波以及放大后经信号采集装置采集传输至上位机进行保存和/或显示；当采集胞内信号时，上位机控制数据采集卡发出电穿孔脉冲信号，通过电穿孔电路模块控制传输至纳米多孔膜微电极阵列传感器7的工作电极上并施加于其上的心肌细胞，工作电极采集获得心肌细胞的胞内电信号，传输至传感器电信号调理模块进行滤波以及放大后经信号采集装置采集传输至上位机进行保存和/或显示。图9-10 所示为本发明系统采集的信号结果图，其中图9是电穿孔之前记录到的电信号，即细胞外电信号，包括一段胞外电信号25、和一个放大的胞外电信号26；其中图10是电穿孔之后记录到的电信号，包括一段胞内电信号27、和一个放大的胞内电信号28。
73.经实验表面皿细胞内电信号维持的时长部分可以长达1小时以上，其中12个通路的细胞内电信号维持时长》半小时。
74.进一步地，准备六种不同的测试溶液，包括钠离子溶液、钾离子溶液、钙离子溶液、胺碘酮溶液、氟卡尼溶液、地尔硫卓溶液。其中钠离子溶液、钾离子溶液、钙离子溶液在网上购买标准溶液，钠离子溶液为1mg/ml，钾离子溶液为0.1mg/ml，钙离子溶液为1mg/ml。胺碘酮溶液、氟卡尼溶液、地尔硫卓溶液用磷酸缓冲盐溶液(pbs)进行稀释，其中胺碘酮溶液配置为40μg/ml，氟卡尼溶液配置为0.1μg/ml，地尔硫卓溶液配置为10ng/ml。然后将这六种溶液通过导管注入到对应的微流道中。在对应的微流道上面的微电极能记录到心肌细胞的细胞外电信号变化。通过微电极施加电穿孔，微电极所记录到的细胞电信号，由细胞外电信号转变为细胞内电信号。利用微流道多通道的特性，在不同通道的微流道施加药物测试溶液，利用本发明系统进行高通量药物实验测试，实现高通量筛选药物。
75.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法把所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围。