阿胶强骨口服液预防和/或治疗贫血的用途的制作方法

1.阿胶强骨口服液预防和/或治疗贫血的用途，所述的贫血包括缺铁性贫血，肾性贫血，骨髓抑制贫血，属于医药技术领域。


背景技术：

2.贫血是指人体外周血红细胞容量减少，低于正常范围下限的一种常见的临床症状，可并发于很多疾病，其定义为外周血中单位体积的血红蛋白含量、红细胞计数及红细胞压积低于正常标准。据who统计，约有20亿人患有不同程度的缺铁或缺铁性贫血，占世界人口的30％左右，是世界四大营养缺乏病之一，每年我国婴幼儿及儿童贫血发病率为45.7％，大于65岁老年人贫血发病率52％，因此对贫血的防治刻不容缓。
3.按照临床发生率高低，依次可以将贫血分为缺铁性贫血、巨幼细胞性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血、失血性贫血、纯红细胞再生障碍贫血等。
4.缺铁性贫血是我国普遍存在的营养缺乏性贫血，影响人口广泛，发病率高，严重影响人们健康及生活质量。其病因多为摄入不足、吸收障碍或消耗过多导致体内储存铁耗尽，若在这一时期不加以补充，进而会发展为缺铁性贫血。铁是合成血红蛋白的基本原料之一，铁缺乏导致骨髓中血红蛋白合成受阻，引起小细胞低色素贫血。缺铁可导致人体体力下降、劳动和作业能力明显减弱、免疫力显著降低,对妇女的生育能力亦可产生严重影响。
5.缺铁性贫血是指由于体内铁缺乏和铁利用障碍导致血红蛋白(hb)合成障碍而引起的贫血。在血红蛋白合成的过程中，红细胞游离原卟啉在血红素合成酶的作用下首先与铁结合，当铁含量相对缺乏时，红细胞内游离原卟啉便以游离形式积累起来，因此红细胞内游离原卟啉(fep)含量是诊断铁缺乏的灵敏指标之一。血清铁蛋白(sf)能够反映机体内铁的储存量，是反映体内铁贮备的一项特异性指标。血清转铁蛋白(strf)受体是一种循环于血清中的转铁蛋白受体片段，能准确反映体内铁储存状态，是诊断缺铁性贫血的一项有效指标。促红细胞生成素 (epo)能够刺激红系祖细胞和前体红细胞的分裂，促使红细胞的生成。
6.铁调素(hepcidin)是由肝脏合成并分泌的激素，体内铁的稳态及骨代谢主要由铁调素调节，铁调素的主要功能是调节内源性循环铁水平。铁调素通过与铁转运蛋白1结合，达到降低血液中铁含量的目的。铁转运蛋白是铁进入细胞外液和血浆的唯一通路。铁调素的缺失将导致铁超载，铁超载又通过反馈机制上调铁调素的表达。
7.膳食中的铁主要经十二指肠上皮细胞表达的转运蛋白二价金属转运体 (dmt-1)和膜铁转运蛋白(fpn-1)吸收进入血液。dmt1在机体各组织中广泛分布，在近端小肠表达最高，主要分布于十二指肠绒毛刷状缘，将肠道非血红素铁转运入细胞。fpn1是一种跨膜的铁输出蛋白，在小肠中fpn1主要分布于十二指肠绒毛上皮细胞的基底端和基底膜，负责将肠细胞内的铁转运出细胞，进入血液。相关研究已证实铁调素是参与肠铁吸收相关蛋白表达的负调节因子。
8.肾性贫血作为一种继发性贫血，是肾功能不全发展到终末期常见的并发症，其在
患者中的发生率高达95％以上，非常具有临床代表意义。现代医学研究发现肾性贫血产生的主要原因有体内促红细胞生成素(epo)分泌相对不足、潴留的毒性物质导致的骨髓造血抑制、干扰红细胞的生成和代谢而导致红细胞生存期缩短等。贫血的程度常与肾功能减退的程度相关，主要是正色素、正细胞性贫血。目前在临床上对于的治疗主要是注射重组人epo虽然能够达到一定的治疗效果，但其价格昂贵。
9.肿瘤所致贫血属于再生障碍类贫血，严重的骨髓抑制贫血往往会引发一些严重的并发症，如感染、出血、发烧等，从而使放、化疗难以继续进行下去。因此，对因放、化疗导致的骨髓抑制的防治就尤为重要，从某种程度上说，对骨髓抑制这一副作用的控制是癌症化、放疗能否成功的关键。目前针对肿瘤贫血使用药物为一些造血生长因子，如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm-gsf)、促红细胞生成素(epo)、促血小板生成素(tpo)等，但价格昂贵。


技术实现要素：

10.缺铁性贫血是指由于体内铁缺乏和铁利用障碍导致血红蛋白(hb)合成障碍而引起的贫血。本研究结果显示，阿胶强骨口服液组可明显升高模型大鼠hgb、rbc、 hct、mch、mchc、mcv；增加大鼠血清铁含量；增加大鼠十二指肠dmt-1、fpn-1 蛋白的表达。表明阿胶强骨口服液能改善缺铁性贫血，通过上调大鼠铁吸收负反馈调节机制，促进肠道铁吸收，能改善缺铁性贫血大鼠的血象及铁代谢，能增加血红蛋白，促进机体供氧。阿胶强骨口服液中、高剂量组大鼠十二指肠dmt1和 fpn1蛋白表达均高于正常对照组、模型组。提示，阿胶强骨口服液能使肠道铁吸收负反馈调节程度增加。这一过程可能与阿胶强骨口服液能抑制肝脏铁调素水平有关。通过上调dmt1和fpn1来促进十二指肠对铁的吸收。
11.肾性贫血是指各种因素造成肾脏促红细胞生成素产生不足或尿毒症血浆中一些毒素物质干扰红细胞的生成和代谢而导致的贫血。是临床常见的一种贫血症状。本发明使用腺嘌呤连续给药建立大鼠肾性贫血模型，通过给予阿胶强骨口服液，观察阿胶强骨口服液对肾性贫血大鼠的影响。本发明通过造模药物腺嘌呤能够导致肾脏纤维性病变，导致epo分泌不足，导致红系和巨核系细胞分泌不足，获得肾衰竭性贫血。本次实验造模后，大鼠的尿素氮、肌酐、体重和红细胞数量等指标发生显著性变化，表明实验造模成功。经过6周的给药后发现阿胶强骨口服液对肾脏功能性指标尿素氮和肌酐有显著调控作用，表明具有能够恢复由腺嘌呤引起的大鼠肾脏损伤作用，对其引起的贫血性指标均具有显著恢复作用。通过试剂盒检测发现模型组肾性贫血相关指标sod、gst和epo显著降低，符合临床肾性贫血指证，而相同剂量的阿胶强骨口服液中剂量组对这些指标具有显著的提升作用，更进一步证实阿胶强骨口服液对肾性贫血具有显著恢复作用。
12.因肿瘤放、化疗导致的骨髓抑制贫血属于再生障碍类贫血。本发明通过环磷酰胺和氯霉素联合用药建立小鼠骨髓抑制模型，通过给予阿胶强骨口服液，观察阿胶强骨口服液对骨髓抑制贫血小鼠的影响。通过对比血液学指标，发现阿胶强骨口服液能够恢复模型小鼠白细胞和其中的淋巴细胞百分比，相比于阳性药物集落刺激因子，阿胶强骨口服液对淋巴细胞t,b和nk细胞的增殖作用更具有针对性；同时，实验发现，阿胶强骨口服液能够对由骨髓抑制引起的贫血现象具有显著的恢复作用，特别是针对血红蛋白含量方面，其效果高于阳性药物集落刺激因子和复方阿胶浆。结合小鼠血清中巨噬细胞集落刺激因子和白介素6及骨髓细胞计数结果表明阿胶强骨口服液能够提升免疫抑制小鼠的免疫能力其作用机
制其一在于促进髓系祖细胞向淋巴细胞分化，特别是对淋巴b细胞和巨噬细胞的增殖作用显著，同时能够提高血红蛋白的生成，提高机体能量代谢水平。
13.有益技术效果
14.阿胶强骨口服液组可明显升高红细胞计数(rbc)、血红蛋白浓度(hgb)、血细胞压积(hct)、红细胞平均血红蛋白量(mch)、红细胞平均血红蛋白浓度(mchc)、红细胞平均体积(mcv)。增加血清铁含量；增加十二指肠dmt-1、fpn-1蛋白的表达。表明阿胶强骨口服液能改善缺铁性贫血，通过上调铁吸收负反馈调节机制，促进肠道铁吸收，能改善缺铁性贫血大鼠的血象及铁代谢，能增加血红蛋白，促进机体供氧。
15.阿胶强骨口服液对肾脏功能性指标尿素氮和肌酐有显著调控作用；对肾功能损伤引起的贫血性指标具有显著恢复作用；能够提升肾性贫血sod、gst和epo 相关指标含量。说明阿胶强骨口服液具有如下作用：能恢复肾脏的损伤，对肾性贫血具有显著恢复作用，对肾性贫血大鼠免疫指标具有的调节作用。
16.阿胶强骨口服液能够恢复骨髓抑制所致贫血的白细胞和其中的淋巴细胞百分比；对由骨髓抑制引起的贫血现象具有显著的恢复作用，特别是显著提升血红蛋白含量；还能够提升血清中巨噬细胞集落刺激因子和骨髓细胞数。说明阿胶强骨口服液能够提升的免疫能力，其作用机制其一在于促进髓系祖细胞向淋巴细胞分化，特别是对淋巴b细胞和巨噬细胞的增殖作用显著；能够促进骨髓抑制小鼠血红蛋白的生成，提高机体能量代谢水平，对骨髓抑制所致贫血的恢复具有一定作用。
附图说明
17.图1-1：大鼠造模完成时血常规指标。
18.图1-2：大鼠造模前后体重变化。
19.图1-3：药物干预期间各组体重变化。
20.图1-4：阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠血常规(hgb、hct、mch、mchc、 mcv)的影响。
21.图1-5：阿胶强骨口服液对大鼠血清铁及dmt-1、fpn-1蛋白的影响。
22.图2-1：大鼠给药后体重变化图。
23.图2-2：sod标曲。
24.图2-3：sod标曲。
25.图2-4：epo标曲。
26.图3-1：mcsf标曲。
27.图3-2：il-6标曲。
具体实施方式
28.实施例1阿胶强骨口服液对缺铁性贫血的改善。
29.1材料
30.1.1药物
31.本研究所用阿胶强骨口服液均由新疆华世丹药业股份有限公司提供，是由熟地黄、阿胶、枸杞子、牡蛎、黄芪、党参等制成的现代口服液制剂(批号:2019111802)；琥珀酸亚
铁(批号：180319 190410 190610)；复方阿胶浆(批号：1806027 1904070)；低铁饲料(睿迪生物科技深圳有限公司，批号：18073112，含铁量6.7mg/kg)。
32.1.2实验动物
33.健康雄性sd大鼠(spf级90只，购自新疆医科大学实验动物研究中心，实验动物生产许可证号：scxk(新)2018-0002，实验动物饲养环境：温度24～26℃，湿度60％～70％，12h/12h间隔照明，自由进食饮水，适应性饲养1周后称重， 180～220g。
34.1.3仪器与试剂
35.fa1004分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)；5417r型台式冷冻高速离心机(德国eppendorf公司)；750型全自动血细胞分析仪(backman coulter公司)； olympus 5400全自动生化分析仪(日本olympus光学株式会社)；model 680酶标仪(美国伯乐)；小鼠二价金属转运蛋白1(dmt-1)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；小鼠膜转运蛋白(fpn-1)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。
36.2方法
37.2.1动物造模与分组
38.ida大鼠模型的复制：60只雄性sd大鼠适应性喂养5天后，用spss软件按体重随机分为正常对照组5只和造模组55只。根据文献报道的造模方法加以改进，造模组每天给予低铁饲料每只每天约20g，饮用去离子水。并且每3d于大鼠耳缘静脉放血，每次放血量为20滴。正常对照组给予正常基础饲料，饮用自来水。每周称量并记录体重，造模28d后，内眦取血，使用抗凝管进行血常规分析。结果若显示符合的特征，检测实验大鼠平均血红蛋白(hb)≤90g/l,造模成功。
39.动物分组：选取造模成功的大鼠按贫血程度用spss软件，随机抽取5只做为模型组，其余随机分为5组，每组9只。故所有大鼠被分为a正常对照组、b模型对照组、c琥珀酸亚铁组、d复方阿胶浆组、e低剂量阿胶强骨口服液组、f中剂量阿胶强骨口服液组、g高剂量阿胶强骨口服液组，共7个实验组。
40.2.2药液与给药
41.硫酸亚铁组(每天每只灌胃硫酸亚铁混悬液5ml/kg,及去离子水10ml/kg)、复方阿胶浆组(6.3ml/kg)、高剂量阿胶强骨口服液组(12.6ml/kg)、中剂量阿胶强骨口服液组(6.3ml/kg)、低剂量阿胶强骨口服液组(3.15ml/kg)给药剂量均以临床剂量折算,连续灌胃28d，并每隔3d称体重，并拍照观察状态。
42.2.3指标检测
43.2.3.1血常规检测
44.造模28天后所有大鼠眼眶取血置含抗凝剂edta-2k的ep管中，用于血常规分析。各组动物末次给药后，禁食12h。水合氯醛麻醉后行颈动脉取血，1ml置含抗凝剂edta-2k的ep管中，用于血常规分析。
45.2.3.2血生化检测
46.采集的血液注入2ml ep管中(不添加抗凝剂)，于37℃恒温培养箱1h，使其充分凝固，然后置于4℃冰箱中过夜，3000r/min离心20min，用1ml吸管小心吸取上清液，送xx医院检验科测定血清铁si。
47.2.3.3铁代谢相关蛋白检测
48.大鼠十二指肠上皮细胞转运蛋白二价金属转运体dmt-1、膜铁转运蛋白fpn-1 的检测均使用elisa法检测。取各组大鼠十二指肠同一部位，切割标本后，称取重量。加入一定量的pbs后用匀浆器将标本匀浆，充分离心20分钟左右(2000-3000 转/分)收集上清。设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。分别设空白孔、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μ l,然后再加待测样品l0μl。将样品加于酶标板孔底部,每孔加入酶标试剂100μ l,空白孔除外，用封板膜封板后置37℃温育60分钟。小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加入显色剂a50u1,再加入显色剂b50u1,轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。每孔加终止液50u1,终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(0d值)。依据标准品浓度、od值绘制标准曲线，用elisa calc回归/拟合计算程序，反算出各给药组蛋白含量。
49.2.4统计学方法
50.全部试验数据使用spss 21.0统计软件进行统计分析。
51.3.结果与分析
52.3.1大鼠造模成功后血常规检测结果
53.造模28天后血常规检测以下6个指标，分别是红细胞计数(rbc)、血红蛋白浓度(hgb)、血细胞压积(hct)、红细胞平均血红蛋白量(mch)、红细胞平均血红蛋白浓度(mchc)、红细胞平均体积(mcv)。红细胞计数，是指单位体积血液中所含的红细胞数目，对于提示累及红细胞系统的疾病有重要意义。血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。血红蛋白增高、降低的临床意义基本和红细胞计数的临床意义相似，血红蛋白能更好地反映贫血的程度。大鼠造模血常规结果如表1-1所示，模型组大鼠血红蛋白浓度(hgb) 由(179.00
±
8.60)下降到(78.29
±
8.60),p《0.001。依据临床鉴定标准，血红蛋白 (hgb)低于90g
·
l-1
,符合轻度缺铁性贫血模型评价标准。同时红细胞计数(rbc)、血细胞压积(hct)、红细胞平均血红蛋白量(mch)、红细胞平均血红蛋白浓度 (mchc)、红细胞平均体积(mcv)与空白组比较，存在极显著性差异，p《0.001。
54.表1-1大鼠造模完成时血常规指标
[0055][0056]
注：与对照组比较，*p《0.05,**p《0.001，下表附注相同。
[0057]
3.2大鼠造模前后体重变化
[0058]
缺铁性贫血模型的诱导期间，大鼠体重变化如表1-2所示，造模第二周开始大鼠体重逐步下降，饮食量减少。第三周起体重出现显著性差异，表明缺铁会引起体重下降，饮食
量减少。第四周模型组大鼠普遍表现出耳廓、眼球、足趾部发白，粪便颜色变浅，毛发凌乱无光泽，喜啃食鼠笼等现象。符合缺铁性贫血模型形态学评价标准。
[0059]
表1-2大鼠造模前后体重变化
[0060][0061]
注：与对照组比较，*p《0.05,**p《0.001
[0062]
3.3阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠体重及脏器指数的影响
[0063]
药物干预28天后大鼠体重及各脏器指数如表1-3所示，各给药组体重趋于正常组体重，各组间无显著性差异，p》0.05。表明补铁后大鼠体重回升，趋于正常体重。肝脏是机体最主要的铁储存器官，在机体内铁主要以铁蛋白和含铁血黄素形式存在于肝脏中。由表1-3可以发现补铁后各组与正常对照组有显著性差异 (p《0.05)，其原因可能是对照组大鼠体重稍重于给药组，也可能铁源对大鼠肝脏组织的生长、发育和更新有一定的作用。对于脾脏指数、心脏指数，各组间没有差异，p》0.05。
[0064]
表1-3.阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠体重及脏器指数的影响(n＝8)
[0065][0066]
注：与正常对照组a比较，#p《0.05
[0067]
3.4阿胶强骨口服液对大鼠血常规的影响
[0068]
测试各组大鼠血常规以下指标，分别是血红蛋白浓度(hgb)、血细胞压积 (hct)、红细胞平均血红蛋白量(mch)、红细胞平均血红蛋白浓度(mchc)、红细胞平均体积(mcv)。血红蛋白又称血色素，是红细胞的主要组成部分，能与氧结合，运输氧和二氧化碳。血红蛋白增高、降低的临床意义基本和红细胞计数的临床意义相似，血红蛋白能更好地反映贫血的程度。由表1-4可知，药物干预28d 后，各组血红蛋白(hgb)值均不同程度的增加，且e、f、g组(即阿胶强骨口服液低、中、高剂量组)较模型组hgb(91.0
±
6.98)分别增加到(127.8
±
7.33)、(131.0
ꢀ±
9.67)、(131.4
±
8.33)，增幅分别为40.4％、43.95％、44.4％；红细胞压积(hct) 较模型组(26.05
±
1.64)分别增加到(32.78
±
1.60)、(35.2
±
3.73)、(33.5
±
2.02)，增幅分别为25.8％、35.12％、28.6％。红细胞平均血红蛋白含量和红细胞平均体积下降表现于小细胞低色素性贫血多为正常细胞性贫血，临床上多见于缺铁性贫血。血红蛋白含量正常或偏高，提示体内铁质丰富，无需补铁。血红蛋白含量偏低，表示体内缺铁，进而影响血红蛋白的合成和携氧能力，造成贫血，阻碍身体各项生理活动的正常进行。由表1-4可知，在给药期内所有实验组大鼠的mch值和mcv 值均明显大于模型组b组,且e、f、g组均趋近于正常组a。综上所述，阿胶强骨口服液对血常规6个指标有显著的促进作用，经过28d的给药处理，有逐渐趋近于正常大鼠的指标的趋势。
[0069]
表1-4.阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠血常规(rbc,hgb、hct、mch、mchc、mcv) 的影响(n＝8)
[0070][0071]
(1)注：#与正常对照组比较，p《0.05；*与模型组比较，p《0.05,下表附注相同
[0072]
3.5阿胶强骨口服液对大鼠血清铁及dmt-1、fpn-1蛋白的影响
[0073]
人体当中的铁其中三分之二存在于红细胞的血红蛋白当中，其余三分之一储备在肝、脾和骨髓中。血清铁离子全部与转铁蛋白结合，是铁离子的运输形式。本次实验各组血清铁含量如表1-5所示，灌胃28d阿胶强骨组e、f、g组较模型组b 显著增加血清铁含量，p《0.05；并且与给药剂量呈线性递增关系；且与正常组a比较，f、g组存在显著性差异，p《0.05,提示阿胶强骨口服液能增加正常大鼠血清铁含量。膳食中的铁主要经十二指肠上皮细胞表达的dmt1和fpn1吸收进入血液。 dmt1在机体各组织中广泛分布，在近端小肠表达最高，主要分布于十二指肠绒毛刷状缘，将肠道非血红素铁转运入细胞。fpn1是一种跨膜的铁输出蛋白，在小肠中fpn1主要分布于十二指肠绒毛上皮细胞的基底端和基底膜，负责将肠细胞内的铁转运出细胞，进入血液。本次实验研究对大鼠十二指肠dmt1、fpn1蛋白含量测定结果如表1-5所示。dmt1蛋白测定中f、g组较正常组a、模型组b存在极显著性差异，p《0.001；提示阿胶强骨口服液中、高剂量极显著增加缺铁性贫血大鼠十二指肠dmt1蛋白的表达。fpn1蛋白测定中g组与空白组a比较存在差异，p《0.05；与模型组b比较存在极显著性差异，p《0.001。提示阿胶强骨高剂量组能显著增加缺铁性贫血大鼠十二指肠fpn1蛋白的表达。
[0074]
表1-5.阿胶强骨口服液对缺铁性贫血大鼠血清铁的影响
[0075][0076]
注：#与空白对照组比较，p《0.05；*与模型组比较，p《0.05。
[0077]
4.结论
[0078]
本研究结果显示，阿胶强骨口服液中、高剂量组大鼠十二指肠dmt1和fpn1 蛋白表达均高于正常对照组、模型组。提示，阿胶强骨口服液能使肠道铁吸收负反馈调节程度增加。这一过程可能与阿胶强骨口服液能抑制肝脏铁调素水平有关。通过上调dmt1和fpn1来促进十二指肠对铁的吸收。
[0079]
综上所述：给药28天后，阿胶强骨口服液组可明显升高模型大鼠hgb、rbc、 hct、rdw、mch、mchc、mcv；增加大鼠血清铁含量；增加大鼠十二指肠dmt-1、 fpn-1蛋白的表达。表明阿胶强骨口服液能改善缺铁性贫血，通过上调大鼠铁吸收负反馈调节机制，促进肠道铁吸收，能改善缺铁性贫血大鼠的血象及铁代谢，能增加血红蛋白，促进机体供氧。
[0080]
实施例2阿胶强骨口服液对肾性贫血贫血的改善。
[0081]
1.材料
[0082]
1.1动物
[0083]
洁净级sd大鼠，体重约为180-200g，雌雄各半，100只。新疆医科大学动物实验中心提供,许可证号：scxk(新)2018-0001。
[0084]
1.2试剂
[0085]
腺嘌呤(江西阿尔法高科药业有限公司，20200501，1kg/袋)；
[0086]
重组人促红细胞生成素epo注射液(baxter oncology gmbh，9j341a，规格1万 u/支)；
[0087]
阿胶强骨口服液(华世丹制药股份有限公司，19021201，规格10ml/支)；
[0088]
小鼠sod酶联免疫吸附试剂盒，货号jl22893,上海将来实业股份有限公司；
[0089]
小鼠gst酶联免疫吸附试剂盒，货号jl11340,上海将来实业股份有限公司；
[0090]
小鼠epo酶联免疫吸附试剂盒，货号jl11719,上海将来实业股份有限公司。
[0091]
1.3仪器
[0092]
一次性注射器、灌胃针、电子天平(万分之一，fa1004，上海恒平科学仪器有限公司)，电子天平(百分之一，dt500常熟市金羊砝码仪器有限公司)；酶标仪：bio-rad 680,美国百奥公司。
[0093]
2.方法
[0094]
2.1造模方法
[0095]
80只大鼠(雌雄各半)适应环境3d后，按体重随机分为正常对照组20只和造模组60只(雌雄各半)。造模组按照20mg/ml，250mg/kg.d剂量灌胃给予腺嘌呤水溶液，正常对照组
灌胃给予相同体积的纯化水每天1次，共连续造模27d。每周称量并记录体重。造模后随机取20只(正常组10只，对照组10只)大鼠动物内眦取血，进行血常规分析和肾脏功能指标血清肌酐、血尿素氮的测定。结果显示符合的特征，造模成功条件：模型组大鼠血常规指标rbc计数、hb和hct与正常对照组显著降低(p＜0.05)，肾功能指标bun和scr含量显著升高(p＜0.05)。
[0096]
2.2实验方法
[0097]
2.2.1动物分组
[0098]
选取造模成功的50只大鼠，随机分为5组，分别为：模型对照组(同体积纯化水)、epo组(200u/kg每3天注射1次)、阿胶强骨口服液低剂量组、阿胶强骨口服液中剂量组、阿胶强骨口服液高剂量组。连续给药21d，每周称量并记录体重，观察动物一般体征。动物处理和样本采集。具体分组见表2-1.
[0099]
表2-1阿胶强骨口服液对balb/c小鼠的处理方式及分组
[0100][0101]
所有小鼠共分为6组：空白对照组、模型对照组、epo组(200u/kg,)、高剂量阿胶强骨口服液组(12.8ml/kg)、中剂量阿胶强骨口服液组(6.4ml/kg)、低剂量阿胶强骨口服液组(3.2ml/kg)，分组后连续给药21d，每天称量并记录体重，观察动物一般体征。
[0102]
2.2.2动物处理和样本采集
[0103]
各组动物灌胃给药41d结束后，禁食12h，称量并记录体重。采用眼眶内眦取血的方式，取血液1ml置于含有抗凝剂的管中，将抗凝血用于血常规分析。取血液约2ml置于干净的ep管中，于37度水浴中保温1h后，3500r/min，20min离心吸取血清用于其它指标检测。
[0104]
脱颈处死动物后，快速剥离出两侧的肾脏，除去其筋膜，在生理盐水中冲洗2 遍。一个肾脏保存在4％甲醛溶液中固定，用于制作病理切片并进行后续的染色；另一个肾脏在液氮中速冻后冻存于冰箱中，用于进行后续检测。
[0105]
骨髓有核细胞样本采集：无菌取大鼠左股骨用于制备骨髓象图片，于玻片的一端滴15ul血，左手持载玻片，右手取推片长边与载玻片上面接触并从血滴的前方向后拉，使血滴形成一条线，然后以45度的夹角平稳地推动推片，推成血膜。血涂片制成后在风扇边吹干，使血膜迅速干燥，以免血细胞皱缩。干燥后将在血膜上加2-3滴瑞氏染液，覆盖整个血膜，1分钟后在染液上加等量纯化水，混染5-10 分钟。最后洗去染液，干燥，镜检。
[0106]
2.3指标检测
[0107]
肾功能指标：血尿素氮(bun)、血肌酐(scr)含量；血清中促红细胞生成素 (epo)、
超氧化歧化酶(sod)、谷胱甘肽转移酶(gsh)含量。
[0108]
贫血指标：血红蛋白(hb)含量、外周红细胞(rbc)、血小板数(plt)、平均红细胞体积(mcv)、平均红细胞血红蛋白含量(mch)、骨髓有核细胞计数。
[0109]
免疫指标：白细胞数量(wbc)、中性粒细胞(neut)、淋巴细胞数量(ly)、单核细胞计数(mono)及它们的总占比。
[0110]
3.实验结果
[0111]
3.1造模情况
[0112]
造模后，造模组动物毛色晦暗，体重相比与正常组显著降低(p＜0.01)，中间出现少数动物死亡，造模大鼠60只，死亡8只，造模27天后，随机选取正常组大鼠10只，造模组大鼠10只，进行检测，结果显示，造模组动物血液中的血红蛋白，红细胞显著下降，尿素氮和肌酐检测值显著升高。说明造模成功。成模52 只，死亡率13.3％。具体见体重变化表2-2、表2-3。
[0113]
表2-2造模动物体重变化(n＝10)
[0114][0115]
注：“**”与正常组相比p＜0.01
[0116]
表2-3造模对动物血液指标的影响(n＝10)
[0117][0118]
注：“**”与正常组相比p＜0.01。
[0119]
3.2给药后动物体重变化
[0120]
给药30天后，模型组动物体重显著低于正常组，说明模型动物体重没有恢复。各药物组体重显著低于正常组，说明动物体重没有恢复，但是与模型组相比，体重略有增加，说明对模型动物体重有一定恢复作用。具体见表2-4及附图2-1。
[0121]
表2-4给药后动物体重变化表(x
±
sd)
[0122]
[0123]
注：“*”与正常组相比p＜0.5，“**”与正常组相比p＜0.01；“#”与模型组相比p ＜0.5，“##”与模型组相比p＜0.01。
[0124]
3.3对肾功能的影响
[0125]
3.3.1对血清尿素氮和肌酐的影响
[0126]
实验结果表明，药物作用41d后模型组大鼠的尿素氮和肌酐与正常组比较仍然显著性升高(p＜0.01)，表明其肾脏损伤为不可逆性损伤；而与模型组相比，阿胶强骨高剂量组大鼠尿素氮和肌酐含量显著降低，表明其对肾脏损伤具有恢复作用。具体数据见表2-5。
[0127]
表2-5对尿素氮和肌酐的影响
[0128][0129]
‘
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0130]
3.3.2对超氧化岐化酶sod和谷胱甘肽转移酶gst的影响
[0131]
超氧化物岐化酶sod和谷胱甘肽转移酶gst的消耗程度与肾损伤程度有直接关联性，临床表现为肾急性损伤时其会急剧降低。sod检测结果显示模型组较正常组其sod值显著降低，表明动物模型肾损伤严重，而阿胶强骨口服液中剂量和优化组能够极显著提升大鼠sod值；gst检测结果显示模型组较正常组其gst 值显著降低，表明动物模型肾损伤严重，而阿胶强骨口服液中剂量和优化组能够极显著提升大鼠gst值。结果表明，阿胶强骨口服液对肾损伤造成的超氧化物岐化酶sod和谷胱甘肽转移酶gst降低有明显的恢复作用，说明具有较好的肾损伤恢复作用。详见表2-6、表2-7、图2-2、图2-3。
[0132]
表2-6对大鼠血清超氧化物岐化酶sod的影响(n＝5)
[0133][0134]
‘
注：“*”与正常组比较p《0.05，“#”与模型组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01。
[0135]
表2-7对大鼠血清谷胱甘肽转移酶gst的影响(n＝5)
[0136][0137]
‘
注：“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01。
[0138]
3.3.3对促红细胞生成素epo的影响
[0139]
促红细胞生成素epo是由肾脏和肝脏分泌的一种激素样物质，能够促进红细胞生成。服用红细胞生成素可以使患肾病贫血的病人增加血流比溶度(即增加血液中红细胞百分比)。用于贫血、组织断离、早产儿，用在癌学和血液学方面。本实验结果表明，模型组较正常组其epo值显著降低，表明动物模型肾损伤严重并发生了肾性贫血，而阿胶强骨口服液组能够极显著提升大鼠epo值，表明阿胶强骨口服液对肾损伤贫血有一定的恢复作用。详见图2-4、表2-8。
[0140]
表2-8对大鼠血清促红细胞生成素epo的影响(n＝5)
[0141][0142]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0143]
3.3.4对大鼠肾脏系数的影响
[0144]
解剖观察，模型组及给药组大鼠的肾脏与正常组相比，明显体积增大，存在大面积坏死出血白斑现象。模型组大鼠的肾脏系数与正常组比较显著性提高(p＜ 0.01)。阿胶强骨优化组和epo组的肾脏系数与模型组比较有显著性降低。形态学结果图片结果显示阿胶强骨口服液高剂量组肾脏形态有恢复现象，白斑大量消失。结果表明，阿胶强骨口服液对肾损伤具有明显的恢复作用。具体数据见表2-9。
[0145]
表2-9对大鼠肾脏系数的影响
[0146]
[0147]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0148]
3.4对肾型贫血大鼠贫血指标的影响
[0149]
实验结果表明，阿胶强骨口服液高剂量能明显恢复肾损伤大鼠红细胞数量、血红蛋白含量，能够明显提高骨髓细胞数量。说明阿胶强骨口服液对肾损伤造成的贫血具有一定的恢复作用。具体数据见表2-10。
[0150]
表2-10对大鼠贫血指标的影响
[0151][0152]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0153]
3.5对肾性贫血大鼠免疫指标的影响
[0154]
实验结果表明，阿胶强骨口服液能够升高大鼠白细胞，高剂量组能够升高淋巴细胞数量。说明阿胶强骨口服液对肾性贫血大鼠免疫指标具有一定的调节作用。具体数据见表2-11。
[0155]
表2-11对大鼠免疫指标的影响
[0156][0157][0158]
‘
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较p《
0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0159]
4总结
[0160]
造模药物腺嘌呤能够导致肾脏纤维性病变，导致epo分泌不足，导致红系和巨核系细胞分泌不足，获得肾衰竭性贫血。本次实验造模后，大鼠的尿素氮、肌酐、体重和红细胞数量等指标发生显著性变化，表明实验造模成功。经过6周的给药后发现阿胶强骨口服液对肾脏功能性指标尿素氮和肌酐有显著调控作用，表明具有能够恢复由腺嘌呤引起的大鼠肾脏损伤作用，对其引起的贫血性指标均具有显著恢复作用。通过试剂盒检测发现模型组肾性贫血相关指标sod、gst和epo 显著降低，符合临床肾性贫血指证，而相同剂量的阿胶强骨口服液中剂量组对这些指标具有显著的提升作用，更进一步证实阿胶强骨口服液对肾性贫血具有显著恢复作用。
[0161]
实施例3阿胶强骨口服液对骨髓抑制贫血的改善。
[0162]
1.材料
[0163]
1.1动物
[0164]
balb/c小鼠，体重约为18-20g，雌雄各半，100只。新疆医科大学动物实验中心提供，许可证号：scxk(新)2018-0001。
[0165]
1.2试剂
[0166]
氯霉素片(重庆迪康长江制药有限公司，200202，0.25g/片)
[0167]
注射用环磷酰胺(baxter oncology gmbh，9j341a，规格0.25g/支)
[0168]
重组人集落刺激因子注射液(双鹭药业，20191010，规格150ug/支)
[0169]
阿胶强骨口服液(华世丹制药股份有限公司，19021201，规格10ml/支)
[0170]
复方阿胶浆组(东阿阿胶，1905026，10ml/支)
[0171]
小鼠白细胞介素6酶联免疫吸附试剂盒，货号jl20268,上海将来实业股份有限公司；
[0172]
小鼠巨噬细胞集落刺激因子酶联免疫吸附试剂盒，货号jl11340,上海将来实业股份有限公司；
[0173]
1.3仪器
[0174]
一次性注射器、灌胃针、电子天平(万分之一，fa1004，上海恒平科学仪器有限公司)，电子天平(百分之一，dt500常熟市金羊砝码仪器有限公司)；酶标仪：bio-rad 680,美国百奥公司。
[0175]
2.方法
[0176]
2.1溶液配制
[0177]
氯霉素片：将氯霉素片用丙二醇稀释成终浓度为8mg/ml的溶液，经0.22um 滤膜过滤除菌后保存，备用。
[0178]
环磷酰胺注射液：将环憐酰胺用注射用生理盐水溶解成终浓度为10mg/ml的溶液，备用。
[0179]
2.2模型造模
[0180]
100只正常小鼠(雌雄各半)适应环境3d后，按体重随机分为空白对照组14 只和造模组76只(雌雄各半)。造模组小鼠隔天腹腔注射环磷酰胺50mg/kg.d、氯霉素400mg/kg.d，注射4次。
[0181]
2.3动物分组及给药
[0182]
选取造模成功的60只小鼠随机分为6组，每组10只。具体分组见表3-1。
[0183]
表3-1阿胶强骨口服液对balb/c小鼠的处理方式及分组
[0184][0185]
所有小鼠共分为7组：空白对照组、模型对照组、重组人集落刺激因子组(0.125ml/kg,)、高剂量阿胶强骨口服液组(16ml/kg)、中剂量阿胶强骨口服液组 (8ml/kg)、低剂量阿胶强骨口服液组(4ml/kg)，复方阿胶浆组(9ml/kg)，分组后连续给药10d，每天称量并记录体重，观察动物一般体征。
[0186]
2.4动物处理和样本采集
[0187]
各组动物灌胃给药10d后，禁食2h，称量并记录体重。采用内眦取血的方式，取血液0.5ml置于含有抗凝剂的管中，将抗凝血用于血常规分析。每组2只取血液约1.5ml置于干净的ep管中，于4度冰箱过夜，3500r/min,15min离心吸取血清。采用elisa方法对血清进行gm-gsf、il-6的测定。
[0188]
(1)内脏
[0189]
脱颈处死小鼠后，快速剥离其胸腺和脾脏，用生理盐水冲洗，滤纸吸干水分后称重并记录。
[0190]
(2)骨髓细胞制备
[0191]
处死动物后，快速分离左侧股骨，在无菌超净台中用剪刀剪断其两端，用pbs 液冲出骨髓细胞并反复吹打，根据小鼠淋巴细胞分离液说明书进行操作提取骨髓有核细胞，用于骨髓有核细胞计数。
[0192]
(3)指标检测
[0193]
血常规指标；胸腺和脾脏系数；骨髓有核细胞计数；血清中与造血相关的细胞因子gm-gsf、il-6的水平。
[0194]
3实验结果
[0195]
3.1造模结果
[0196]
本次实验选取90只正常小鼠，空白对照组14只和造模组76只(雌雄各半)。经4次腹腔注射环磷酰胺50mg/kg.d和氯霉素40mg/kg.d造模，结果，成模率 82.89％，期间死亡小鼠13只，死亡率17.1％。
[0197]
3.2对体重影响
[0198]
造模后，造模小鼠出现明显体重减少，毛色粗糙，活动减少。给药后，体重缓慢增
加。具体见体重变化表3-2。造模后8天后模型组小鼠显著降低，表明造模成功，给药10天后阿胶强骨口服液低剂量组体重恢复程度最高。
[0199]
表3-2对小鼠体重的影响(x
±
sd)
[0200][0201]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较 p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0202]
3.3对小鼠脏器系数的影响
[0203]
给药10天后阳性药物集落刺激因子g-csf相比于模型组脾脏系数显著提高，相比模型组，阿胶强骨优化组和复方阿胶浆组胸腺系数提高显著。数据见表3-3.
[0204]
表3-3对小鼠脏器系数的影响
[0205][0206]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较 p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0207]
3.4对小鼠血液学的影响
[0208]
结果表明，模型组白细胞相较于正常组降低，而阳性药物和阿胶强骨组均有显著的提升白细胞数量作用，阳性药物集落刺激因子升白效果最强；在淋巴细胞百分比方面，阳性药物集落刺激因子组淋巴细胞百分比显著降低，表明其作用主要提升白细胞类中中性粒细胞、嗜酸和嗜碱等细胞，并不对淋巴b,t和nk细胞具有提升作用，造成淋巴细胞百分比降低，而阿胶强骨口服液组相较于集落刺激因子具有提升淋巴细胞百分比作用，其作用对象为b,t和nk细胞；在红细胞、血红蛋白和平均血红蛋白含量方面阿胶强骨口服液组对由骨髓抑制引起的贫血反应具有显著的恢复作用，特别是针对血红蛋白含量方面，其效果高于阳性药物集落刺激因子和复方阿胶浆，具体数据见表3-4。
[0209]
表3-4对小鼠血液学的影响
[0210][0211]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较 p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0212]
3.5对巨噬细胞集落刺激因子(m-csf)的影响
[0213]
集落刺激因子主要选择性作用于粒系造血祖细胞，促进其增殖、分化，并可增加粒系终末分化细胞的功能，使粒细胞增多。实验结果表明阿胶强骨口服液高剂量组具有显著的提升巨噬细胞集落刺激因子作用，表明其能够促进小鼠体内巨噬细胞生成。
[0214]
表3-5对骨髓抑制小鼠模型m-csf的影响
[0215]
组别m-csf含量(pg/ml)正常组195.92
±
12.34
模型组194.75
±
9.03阳性对照组210.35
±
10.19阿胶强骨低剂量组207.49
±
15.32阿胶强骨中剂量组211.64
±
7.62阿胶强骨高剂量组217.12
±
10.76*#复方阿胶浆组208.92
±
19.09
[0216]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较 p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0217]
3.6对白细胞介素6(il-6)的影响
[0218]
白细胞介素6是一种细胞因子是免疫细胞作用于其它细胞所产生的蛋白质，有助于调节和促进免疫反应。实验结果表明阿胶强骨口服液高剂量组和复方阿胶浆组具有促进il-6分泌作用，但是作用效果并不显著。
[0219]
表3-6对骨髓抑制小鼠模型il-6的影响
[0220]
组别il-6含量(mg/ml)正常组18.34
±
3.42模型组15.53
±
2.03阳性对照组16.66
±
1.19阿胶强骨低剂量组15.83
±
1.31阿胶强骨中剂量组16.72
±
0.96阿胶强骨高剂量组17.02
±
1.37复方阿胶浆组16.21
±
1.93
[0221]
3.7对小鼠骨髓细胞数量的影响
[0222]
结果显示，阿胶强骨口服液中、高剂量组能够显著增加骨髓抑制小鼠股骨骨髓有核细胞数量，说明阿胶强骨口服液具有促进贫血恢复的作用。
[0223]
表3-7对骨髓抑制小鼠模型骨髓有核细胞计数的影响
[0224]
组别骨髓有核细胞数量(106)正常组3.18
±
1.30模型组3.14
±
1.49阳性对照组3.60
±
1.08阿胶强骨低剂量组5.57
±
5.41阿胶强骨中剂量组4.15
±
1.92阿胶强骨高剂量组7.53
±
4.17*复方阿胶浆组8.38
±
7.79**
[0225]
注：“**”与正常组比较p《0.01，“*”与正常组比较p《0.05，“##”与模型组比较 p《0.01，“#”与模型组比较p《0.05。
[0226]
4.结论
[0227]
免疫抑制小鼠模型是由环磷酰胺和氯霉素的骨髓抑制作用而形成的，该种动物模型制作简单，但也有药物抑制作用恢复快的缺点。本实验造模后模型组动物体重显著降低，出现死亡，精神萎靡等症状表明造模成功，而经过10天的给药后，模型组小鼠体重和状态有
所恢复，但是其恢复程度低于药物组。通过对比血液学指标，发现阿胶强骨口服液能够恢复模型小鼠白细胞和其中的淋巴细胞百分比，相比于阳性药物集落刺激因子，阿胶强骨口服液对淋巴细胞t,b和nk细胞的增殖作用更具有针对性；同时，实验发现，阿胶强骨口服液能够对由骨髓抑制引起的贫血现象具有显著的恢复作用，特别是针对血红蛋白含量方面，其效果高于阳性药物集落刺激因子和复方阿胶浆。结合小鼠血清中巨噬细胞集落刺激因子和白介素6及骨髓细胞计数结果表明阿胶强骨口服液能够提升免疫抑制小鼠的免疫能力其作用机制其一在于促进髓系祖细胞向淋巴细胞分化，特别是对淋巴b细胞和巨噬细胞的增殖作用显著，同时能够提高血红蛋白的生生成，提高机体能量代谢水平。