一种基于荧光检测的PET水解酶活性高通量测定方法及应用

一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法及应用
技术领域
1.本发明涉及酶活性测定技术领域，具体涉及一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法及应用。


背景技术：

2.塑料制品凭借着其良好的耐酸碱等优良特性被广泛应用于制造业，但同时这使得其难以被有效降解，仅通过热机械的手段降低其机械性能并进一步焚烧填埋无法实现真正意义上的循环利用。该过程所产生的塑料废物的积累会导致环境污染并进一步威胁生态系统，据欧盟统计局统计，2019年全球塑料总产量几乎达到3.7亿吨，其中中国产量占全世界总产量的31％。虽然目前已经有通过化学和物理技术处理塑料废物的方法，但是通过这些方法加工产生的副产品同样会对环境造成污染。所以，利用微生物降解塑料已成为当前的研究热点。对苯二甲酸乙二醇酯(pet)作为市场广泛应用的塑料材质之一，作为一种聚酯型塑料，其降解的关键一步是pet水解酶催化的酯键水解。鉴于pet水解酶重要的研究和应用价值，近年来有关该酶的人工改造成为一个热点。目前的pet水解酶改造主要是基于酶的结构对目标蛋白进行单点或多点氨基酸突变，将所有突变的目标蛋白分别纯化，进行酶反应后通过hplc检测产物的生成量，这种方法不仅工作量大而且通量较低，能够检测和筛选的突变体数量有限，在理性设计pet水解酶突变时因为需向检测通量妥协而舍弃大量突变选择。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种高通量筛选方法，该方法能够基于荧光检测对pet水解酶进行高通量的活性定量检测，可广泛应用于pet水解酶突变体库及环境中pet塑料水解酶的筛选鉴定。
4.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，包括：
5.(1)将pet水解酶与荧光蛋白融合表达，在反应前测定细胞裂解液中荧光值，以确定酶的浓度；
6.(2)制备pet-fdl膜，所述pet-fdl膜为包埋了荧光素二月桂酸酯的pet膜；
7.(3)将细胞裂解液与pet-fdl膜在甘氨酸缓冲液中于反应；反应结束后，测定产物中荧光值，以确定产物浓度；
8.(4)计算产物中的荧光值与反应前细胞裂解液中荧光值的比值，即为pet水解酶的比酶活。
9.作为本发明的一种优选方式，所述步骤(1)中，荧光蛋白的荧光最大发射波长应与荧光素最大发射波长相差大于100nm。
10.进一步地，所述步骤(2)中，pet-fdl膜的制备方法是：将fdl与pet塑料按照质量配比0.25～1μg/mg，一起溶解到六氟异丙醇后取40μl加入到96孔板里，在30℃至50℃下挥发
后形成膜。
11.进一步地，荧光蛋白的激发波长范围为485nm～670nm，最大激发波长为603nm，发射波长范围为610nm～805nm，最大发射波长为675nm。
12.进一步地，荧光素的激发波长范围为420nm～530nm，最大激发波长为494nm，发射波长范围为485nm～615nm，最大发射波长为525nm。
13.本发明还提供一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法的应用，该方法可应用于pet水解酶突变体的筛选。
14.本发明提供的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法及其应用，对pet水解酶具有很好的活性筛选效果。利用本发明的方法对包埋荧光素的pet薄膜进行降解，能够对突变体库进行高通量的筛选，得到活性高的突变体。本发明提供的高通量筛选方法，通量较高，成本低廉，操作方便，为筛选高效的塑料降解酶提供了新方法，具有广阔的应用前景。
附图说明
15.图1为融合蛋白浓度与红色荧光值关系图；
16.图2为30℃挥发制成的不同比例的pet-fdl膜反应过程中荧光的释放；
17.图3为40℃挥发制成的不同比例的pet-fdl膜反应过程中荧光的释放；
18.图4为50℃挥发制成的不同比例的pet-fdl膜反应过程中荧光的释放；
19.图5为50℃挥发制成的fdl/pet为1μg/mg的自制膜反应后荧光值与产物产量的相关性；
20.图6为50℃挥发制成的fdl/pet为0.5μg/mg的自制膜反应后荧光值与产物产量的相关性；
21.图7为50℃挥发制成的fdl/pet为0.33μg/mg的自制膜反应后荧光值与产物产量的相关性；
22.图8为50℃挥发制成的fdl/pet为0.25μg/mg的自制膜反应后荧光值与产物产量的相关性；
23.图9本发明实施例中不同条件下高通量筛选实验稳定性参数z factor的评估。
具体实施方式
24.为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
25.本发明实施例中用到的原料和试剂如无特殊说明，均为市售商品。采用的实验方法、仪器设备均为实验室常规技术。本发明的分别引入了绿色荧光素和红色荧光蛋白对pet产物产量和酶量进行定量，随着酶解反应的进行，底物被分解，底物中的绿色荧光素被逐渐释放，此时，绿色荧光值与红色荧光值的比值即可代表酶的相对活性。以酶活为筛选条件，可以实现pet水解酶突变体高通量筛选。
26.实施例1本实施例提供一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，该方法包括以下详细步骤：
27.一、红色荧光值对酶量的定量
28.为了对突变菌株中目标蛋白的表达量进行定量，本发明将红色荧光蛋白mcarmine(fabritius,a.；ng,d.；kist,a.m.；erdogan,m.；portugues,r.；griesbeck,o.imaging-based screening platform assists protein engineering.cell chemical biology 2018,25,1554-1561.e8.)与pet降解酶融合表达得到融合蛋白。首先，为了证明该红色荧光值能够一定程度的反映该融合蛋白参与酶反应的酶量，本实施例将融合蛋白的浓度梯度稀释为2μm、4μm、6μm、8μm、10μm，并测试其不同浓度下红色荧光值与蛋白浓度的关系。结果如图1所示，表明两者的相关性r2大于0.99，说明红色荧光值能够精确的反映酶的浓度。
29.二、绿色荧光素对产物的定量
30.(1)绿色荧光素与pet融合的制膜条件
31.酶活的测定涉及到酶的定量和产物的定量。为了对pet分解后产物的生成量进行定量，本实施例向底物pet中引入了绿色荧光素二月桂酯(fluorescein dilaurate，fdl)。
32.将二月桂酯fdl 5μg/ml，按不同质量配比：1μg/mg、0.5μg/mg、0.33μg/mg、0.25μg/mg，分别加入到5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml的pet中，一起溶解到六氟异丙醇后取40μl加入到96孔板里，并在30℃、40℃和50℃三个温度下分别制膜。
33.将制得的膜，与pet降解酶反应48h后，利用酶标仪测定绿色荧光的释放量，并利用hplc检测酶反应过程中产物的生成量，如图2-4。由此得出，30℃、40℃、50℃下按照上述不同比例制得的pet-fdl与pet水解酶反应，产物的荧光值随时间而增强。其中，最佳制膜温度为50℃。
34.(2)绿色荧光值与产物产量的相关性
35.对上述酶反应后的反应液进行hplc检测，测得相关产物浓度，如图5-8，通过计算得出r2均大于0.96，四种质量配比的pet-fdl膜释放的绿色荧光与产物浓度均呈线性，说明绿色荧光值的大小能精确的反映pet分解后产物的生成量。
36.三、pet降解酶活性的测定
37.(1)在反应前检测细胞裂解液中红色荧光值，通过mcarmine的红色荧光值对细胞裂解液中的酶(融合蛋白)浓度进行定量。
38.(2)融合蛋白与pet-fdl膜进行水解反应。
39.将细胞裂解液与pet-fdl膜在50mm甘氨酸缓冲液中于40℃条件下反应24h，进行水解反应。
40.fdl会随着pet的水解而释放，并立刻被pet水解酶水解为绿色荧光素fluorescein。
41.(3)测定反应后产物中绿色荧光值
42.荧光素的释放与pet水解产物呈正比，可通过绿色荧光定量检测pet的水解产物。
43.(4)通过测得的绿色荧光值与红色荧光值的比值，可确定pet水解酶的活性。
44.以上检测方法可在酶标仪上快速实现，其中红色荧光蛋白mcarmine的激发波长范围为485nm～670nm，最大激发波长为603nm，发射波长范围为610nm～805nm，最大发射波长为675nm；绿色荧光素的激发波长范围为420nm～530nm，最大激发波长为494nm，发射波长范围为485nm～615nm，最大发射波长为525nm。
45.实施例2利用实施例1的方法进行pet降解酶高通量筛选的评估
46.z值(z factor)是目前高通量筛选实验评估和验证中应用广泛的参数，其方法为在96孔板中分别检测样品组和对照组，分别计算样品组的平均值和标准差(sd)。z值的计算公式及应用方法如下：
[0047][0048]
当0.5≤z《1时，该检测系统中样品信号分布与对照信号分布的分离程度良好，这表明该分析方法非常好；当0《z《0.5时表示中等程度的分布分离，表明可进行分析；当z《0时，说明该系统基本上不可能用于筛选。
[0049]
本实施例测试了不同细胞破碎液的量在三个时间下酶反应得到的绿色荧光值和红色荧光值比值的z值，如图9。
[0050]
实验选取的细胞破碎液的量为2μl、10μl、15μl，酶反应时间为17h、24h和62h，根据z值大小可以得出细胞破碎液的最佳用量为10μl时，z值在不同反应时间下变化最稳定，且均大于0.5，说明该条件下的高通量筛选被验证为有效的。
[0051]
最后应说明的是：以上仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制。尽管参照前述各步骤对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换，而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。