一种基于荧光检测的PET水解酶活性高通量测定方法及应用

技术特征：
1.一种基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，其特征在于，包括：（1）将pet水解酶与荧光蛋白融合表达，在反应前测定细胞裂解液中荧光值，以确定酶的浓度；（2）制备pet-fdl膜，所述pet-fdl膜为包埋了荧光素二月桂酸酯的pet 膜；（3）将细胞裂解液与pet-fdl膜在甘氨酸缓冲液中于反应；反应结束后，测定产物中荧光值，以确定产物浓度；（4）计算产物中的荧光值与反应前细胞裂解液中荧光值的比值，即为pet水解酶的比酶活。2.根据权利要求1所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，其特征在于，所述步骤（1）中，荧光蛋白的荧光最大发射波长应与荧光素最大发射波长相差大于100 nm。3.根据权利要求1所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，其特征在于，所述步骤（2）中，pet-fdl膜的制备方法是：将fdl与pet塑料按照质量配比0.25~1 μg/mg，一起溶解到六氟异丙醇后取40 μl加入到96孔板里，在30℃至50℃下挥发后形成膜。4.根据权利要求1所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，其特征在于，荧光蛋白的激发波长范围为485 nm ~ 670 nm，发射波长范围为610 nm~805 nm。5.根据权利要求1所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法，其特征在于，荧光素的激发波长范围为420 nm~530 nm，发射波长范围为485 nm~615 nm，。6.一种如权利要求1-5任一项所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法的应用，其特征在于：该方法可用于pet水解酶突变体的高通量筛选。7.根据权利要求6所述的基于荧光检测的pet水解酶活性高通量测定方法的应用，其特征在于：在pet水解酶突变体的高通量筛选中，fdl∶pet的制膜比例为0.25~1 μg/mg；制膜时挥发温度为30℃~50℃；细胞破碎液用量为2-15 μl。

技术总结
本发明涉及酶活性测定技术领域，具体涉及一种基于荧光检测的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）水解酶活性高通量测定方法及其应用。一种基于荧光检测的PET水解酶活性高通量测定方法，（1）将PET水解酶与荧光蛋白融合表达，在反应前测定细胞裂解液中荧光值，以确定酶的浓度；（2）制备PET-FDL膜；（3）将细胞裂解液与PET-FDL膜在甘氨酸缓冲液中于反应；反应结束后，测定产物中荧光值，以确定产物浓度；（4）计算产物中的荧光值与反应前细胞裂解液中荧光值的比值，即为PET水解酶的比酶活。本发明提供的基于荧光检测的PET水解酶活性高通量测定方法及应用，通量高，成本低廉，操作方便，为筛选高效的PET塑料降解酶提供了新方法，具有广阔的应用前景。前景。前景。


技术研发人员：李盛英 徐子萍 刘琨 马莉 陈月星
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：2022.02.25
技术公布日：2022/6/16