一种组织工程骨及其制备方法

1.本发明涉及一种组织工程骨，具体涉及一种组织工程骨及其制备方法。


背景技术：

2.目前，由于外伤、感染以及肿瘤导致的大节段骨缺损在临床上十分常见且是最为棘手的一大难题，获得足量具有成骨活性的骨移植体对于成功的骨缺损再生修复至关重要。组织工程骨作为治疗骨缺损的重要方案被广泛用于临床或基础研究。骨组织工程策略通常是集合种子细胞、生物支架、及/或活性因子三大要素，在体内或体外构建具有细胞活性与成骨分化能力的骨组织修复体。研究证实组织工程骨在一定程度上能够有效起到促进骨再生和修复的作用，因此，构建具有高生物活性的组织工程骨一直是骨再生修复研究领域的热点和焦点问题。
3.组织工程骨目前亟待解决的问题之一是其再生功能活性难以与天然骨修复体相匹配，因此植入后骨缺损再生修复效果不佳。究其原因，除了因为支架材料生物活性不足不能为种子细胞提供良好的成骨微环境以外，还由于植入后大量种子细胞因不耐受力学刺激及缺氧缺血环境而发生凋亡，导致细胞数量不足，细胞活性、增殖及分化能力下降，导致组织工程骨移植物的骨再生能力严重丧失。
4.现有的组织工程骨构建技术主要是通过外源性添加活性因子或设计优化材料性能来提高细胞的生存活性或促进组织工程骨的成骨分化，但上述手段只能单一促进种子细胞增殖或诱导种子细胞成骨分化，很难达到细胞增殖活性与成骨分化及骨再生能力时序性精确调控的效果。此外，外源性活性物质的引入也给移植物的生物安全性带来了不确定因素。因此，从提高组织工程骨种子细胞的生存活性、增殖能力，及成骨分化能力的角度开发新型构建技术为解决以上问题提供了另一种可行的思路。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种组织工程骨及其制备方法，提高了组织工程骨构建体种子细胞的生存活性、增殖能力，及成骨分化能力，并进一步的解决了现有方法组织工程骨构建体上种子细胞增殖和分化行为相互矛盾的问题，通过对驱动产生机械刺激的电信号波形参数进行时序性调控，从而达到种子细胞增殖行为与分化行为的精确时序性调控目的。
6.为了达到上述目的，本发明提供了一种组织工程骨的制备方法，该方法包含：将骨髓间充质干细胞接种于支架载体上使其粘附生长，得到组织工程骨初胚；通过依次采用方波和三角波电信号驱动的力学刺激加载于所述组织工程骨初胚，从而获得细胞增殖活性与成骨分化及新骨再生能力增强的组织工程骨。
7.优选地，所述电信号驱动的力学刺激为微振动力学刺激，电信号刺激参数：频率为40hz、振幅≤50μm、强度小于0.3g，驱动力学刺激产生的电信号的波形为方波或三角波。
8.优选地，所述波形电信号为：方波驱动的力学刺激培养1～6天，三角波驱动的力学刺激培养6～1天，方波和三角波驱动总时长为7天。
9.更优选地，所述波形电信号为：方波电信号驱动力学刺激培养1天，三角波电信号驱动力学刺激培养6天；或，方波电信号驱动力学刺激培养3天，三角波电信号驱动力学刺激培养4天；或，方波电信号驱动力学刺激培养6天，三角波电信号驱动力学刺激培养1天。
10.优选地，所述组织工程骨初胚在37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养，添加成骨培养基，给予电信号驱动的力学刺激。
11.优选地，所述电信号驱动的力学刺激的周期为30分钟/天。
12.优选地，所述支架载体选用磷酸钙陶瓷支架。
13.优选地，所述磷酸钙陶瓷支架的孔隙率为85％以上。
14.优选地，所述骨髓间充质干细胞是通过以下方法获得的：将骨髓来源间充质干细胞悬液于培养基i中，在37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养，至细胞融合率达到80％以上，进行传代培养，将正常细胞传代三代至7代的细胞作为种子细胞；其中，所述培养基i选用α-mem基础培养基添加10％胎牛血清与1％青霉素和链霉素。
15.优选地，每个bcp支架与1ml的1
×
106个/ml的骨髓间充质干细胞悬液进行粘附接种，然后静置于37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养，得到组织工程骨初胚。
16.本发明的另一目的是提供一种所述的制备方法获得的组织工程骨。
17.本发明的组织工程骨及其制备方法，解决了现有方法组织工程骨构建体上种子细胞增殖和分化行为相互矛盾的问题，增强了现有方法组织工程骨构建体的骨缺损再生修复功能，具有以下优点：
18.本发明的组织工程骨的制备方法，采用不同的电信号波形驱动的力学刺激调控细胞的增殖活性或成骨分化能力，通过双波形阶段式驱动的动态功能化培养，即先采取方波驱动的力学刺激提高组织工程骨的细胞活性，再利用三角波驱动的力学刺激提高其成骨能力，在非侵入式操作及不添加任何外源性生物物质的情况下，从而达到种子细胞增殖行为与分化行为的精确时序性调控，构建获得增殖活性与成骨分化及骨再生能力兼具的组织工程骨。
19.本发明通过独特的双波形驱动组合优化培养能够提高组织工程骨体的细胞活性，相较于现有的培养方式(静态培养、旋转或者传统力学加载等)对细胞的活性调控，本发明能够优化组织工程骨的细胞活性，并选用最佳的双波形电信号组合驱动力学刺激培养方式达到最佳的细胞活性提升，有效改善组织工程骨植入后因为力学、缺氧缺血等问题导致的细胞数量和活性不足而引起的植入后修复失败。通过将静态和动态培养的组织工程骨植入裸鼠皮下后发现，静态的组织工程骨在植入后会随着植入时间的延长发生不同程度的细胞凋亡，而动态培养的组织工程骨在植入后能够增强细胞的活性并延长其存活周期。
20.本发明的具有高成骨分化能力与骨修复能力的组织工程骨，相较于现有的以生物材料为基体构建的组织工程骨，能够通过双波形电信号组合驱动力学刺激培养的方式仿生优化改建组织工程骨的发育，提升组织工程骨的成骨潜能与骨修复能力，对加速骨缺损部位的修复具有重要意义。
附图说明
21.图1为本发明实施例1-3采用双波形电信号培养下组织工程骨的细胞活性以及未刺激组(ss)组的细胞活性。
22.图2为本发明实施例1-3采用双波形电信号组合培养下组织工程骨的成骨蛋白(alp)的表达。
23.图3为本发明采用单一波形(f波和s波)以及未刺激条件下培养组织工程骨的细胞活性。
24.图4为本发明采用单一波形(f波和s波)以及未刺激条件下培养组织工程骨的成骨蛋白(alp)表达量。
具体实施方式
25.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1
27.一种组织工程骨，其制备方法包含：
28.(1)bcp陶瓷支架载体的制备
29.通过表面反应制备bcp陶瓷支架(磷酸钙陶瓷支架)：将合适尺寸的聚氨酯泡沫置于15％的naoh溶液中加热60℃进行亲水化处理，将聚氨酯泡沫用含15％v/v甲醇、5％m/v聚乙烯吡咯烷酮和11.1％m/v氯化钙的混合溶液充分渗透，然后放入含碳酸铵的干燥塔中进行钙化，混合每3天更换一次溶液，使聚氨酯泡沫均匀钙化。将钙化柱置于反应容器中，在高压反应釜中加入浓度为2mol/l的磷酸二氢钾混合溶液，先在80℃下进行反应4h，然后是120℃反应5h。反应结束后，用去离子水洗涤柱子，然后在120℃下干燥，并在900℃下烧结得到磷酸钙陶瓷支架。
30.该磷酸钙陶瓷支架的孔隙率为90％以上，高度为5mm，直径为3mm，180℃干热灭菌30min，作为组织工程骨基体备用。
31.(2)种子细胞的获取
32.从股骨获得骨髓并用注射器反复吹打成细胞悬液，添加培养基i(培养基i选用α-mem基础培养基添加10％胎牛血清与1％青霉素和链霉素)在37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养24h后，弃去培养液，磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗两次，加入新的培养基i。以后每3天更换一次培养基，待细胞融合率达到80％以上，进行传代培养，取第三代(p3)细胞用作种子细胞。
33.(3)组织工程骨初胚的制备
34.取步骤(2)培养的p3骨髓间充质干细胞，使用培养基i制备成1
×
106个/ml的骨髓间充质干细胞悬液。将骨髓间充质干细胞悬液以每个bcp支架1ml的细胞悬液进行高密度粘附接种，静置于37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养24h，得到组织工程骨初胚。
35.(4)电信号驱动力学刺激加载培养组织工程骨
36.将步骤(3)得到的组织工程骨初胚置于微振动培养装置内，统一的刺激参数：频率为40hz、振幅≤50μm、强度为0.3g，设置不同的双波形电信号组合培养。具体地，将组织工程骨初胚在37
±
1℃、4.5～5.5％co2、饱和湿度的条件下培养并添加培养基i，给予不同组合
的双波形电信号驱动培养，周期为30分钟/天，每3天更换一次培养基，7天后得到的组织工程骨。电信号波形驱动组合为：方波刺激培养1天 三角波刺激培养6天(命名为f-1 s-6)。
37.实施例2
38.一种组织工程骨，其制备方法与实施例1的基本相同，区别在于：
39.电信号波形驱动组合为：方波刺激培养3天 三角波刺激培养4天(命名为：f-3 s-4)。
40.实施例3
41.一种组织工程骨，其制备方法与实施例1的基本相同，区别在于：
42.电信号波形驱动组合为：方波刺激培养6天 三角波刺激培养1天(命名为：f-6 s-1)。
43.对比例1
44.与实施例1的基本相同，区别在于：未加载任何刺激，作为未刺激组(ss)。
45.对比例2
46.与实施例1的基本相同，区别在于：采用单一波形，电信号的波形为方波，作为方波刺激培养组(f)。
47.对比例3
48.与实施例1的基本相同，区别在于：采用单一波形，电信号的波形为三角波，作为三角波刺激培养组(s)。
49.实验例体外细胞活性和成骨分化能力的验证
50.对本发明的得到的具有不同细胞存活率和成骨活性的组织工程骨进行体外细胞活性和成骨分化能力的验证，具体如下：
51.在上述各实施例及对比例中培养第1(d1)、3(d3)和7(d7)天，配制10％alarmarblue溶液，加入不同组别的培养孔中孵育2h，取出孵育液在570nm和600nm的波长下读取光密度值，计算出各个组的细胞活力值。
52.对于验证成骨分化能力，检测每个组样品表达碱性磷酸酶蛋白(alp)的合成量，在第3、7天取每组的样品分别用ripa裂解液充分裂解后，高速离心取上清液用于检测，使用碱性磷酸酯酶检测试剂盒与bca定量试剂盒分别检测上清液中的dea酶活力单位与蛋白含量，最后分别用dea酶活力单位/蛋白含量得到alp表达结果值，最结果如下：
53.如图1所示，为本发明实施例1采用三种双波形电信号培养下组织工程骨的细胞活性，从图中可以看出，与未刺激组的组织工程骨(ss组)相比，在第1和3天，三种双波形电信号培养的组织工程骨表现出了显著提高的细胞活性，在培养第7天，f-1 s-6组和ss组的细胞活性没有表现出显著性差异，而f-3 s-4组与f-6 s-1组的细胞活性显著高于f-1 s-6组和ss组。
54.如图2所示，为本发明实施例1采用三种双波形电信号组合培养下组织工程骨的成骨蛋白的表达，从图中可以看出，在培养第三天，三种双波形电信号培养下组织工程骨的成骨标志物-碱性磷酸酶(alp)的表达量显著提高，当培养到第7天后f-6 s-1组和ss组的alp表达没有显著性差异，而f-3 s-4组表现出最高的alp表达，且显著高于f-1 s-6组和ss组的alp表达。
55.如图3所示，为单一波形(f波和s波)以及未刺激条件下培养组织工程骨的细胞活
性，可以看出，采用单一方形波或三角波刺激，同样能够使得细胞活性提高，且单一方形波刺激的细胞活性高于三角波刺激的细胞活性。但是，如图4所示，为单一波形(f波和s波)以及未刺激条件下培养组织工程骨的成骨蛋白(alp)表达量，可以看出，采用单一的方形波刺激和ss组的alp表达没有显著性差异。
56.综合组织工程骨的细胞活性和碱性磷酸酶的检测数据，为了同时提高组织工程骨的细胞活性与成骨分化能力，采用不同时间组合的双波形刺激培养，其中f-3 s-4组的成骨标志物的表达最高，且细胞活性优于其他两组，和最高组无显著性差异，因此，f-3 s-4组培育的组织工程骨在提高成骨潜能的同时改善了细胞的生物活性。
57.尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。