一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素A的方法

一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素a的方法
技术领域
1.本发明涉及新型纳米材料制备与生物传感检测技术领域，一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素a的方法。


背景技术：

2.赭曲霉毒素a(ota)是一种霉菌毒素，属于曲霉素和青霉素的其次代谢产物。ota不但具有强烈的肾毒性、致畸性和致癌性，而且具有较高的化学稳定性，在食品加工过程中不易水解和热处理。产生ota的霉菌广泛分布于自然界，当霉菌毒素污染饲料和食品后，不仅使农业生产遭受重大损失，而且还会引发严重的食品安全问题，威胁人类身体健康和生命安全。因此，急需开发灵敏度高、选择性好、操作简单的ota快速检测技术。
3.纸芯片自2007年被whitesides课题组首次提出以来，已经引起科学研究者的强烈关注。纸芯片具有稳定性好、批量生产、节能环保和成本低廉等优点。通过结合电化学、比色和光电化学方法设计的纸基传感器件，避免了常规分析技术中存在样品预处理复杂，检测成本高，便携性差和需要专业人员操作等问题，已广泛应用于环境监测、疾病诊断和食品安全分析等领域。然而，由于ota在实际样品中的含量极低，所以结合电化学方法高灵敏、分析速度快和生物识别技术高选择性的优势，构建一种简单灵敏的电化学纸芯片实现ota的现场快速检测具有重要意义。
4.为了提高ota检测的灵敏度，引入了一种基于适配体门控效应的信号放大策略。首先电化学沉积法在纸芯片的工作电极表面修饰金纳米粒子，提高传感界面的电子传递速率；然后采用适配体将hemin封装在多孔zif-8@au，合成apta-hemin-zif-8@au复合材料并将其修饰在工作电极表面。当ota存在时，ota与适配体特异性结合形成复合物，导致适配体在zif-8@au表面脱离“biogate”打开，hemin从孔中释放，能有效地催化过氧化氢导致电流信号的增强，从而起到信号放大的作用。本发明所构建的一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片，能够实现ota的高灵敏检测，并且具有选择性好，操作简单、微型化等优点，在食品安全现场分析中具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的目的是设计apta-hemin-zif-8@au复合材料作为一种基于适配体门控效应的信号放大策略，同时结合生物识别技术和电化学检测方法构建的用于检测赭曲霉毒素a的电化学纸芯片。
6.本发明的技术方案，包括以下步骤：
7.一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片的制备方法，包括以下步骤：
8.(1)制备具有亲水区域和疏水区域的蜡印纸芯片；
9.(2)将碳工作电极印刷在步骤(1)中制作的纸芯片的一面，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到纸芯片的另一面；
10.(3)利用电化学沉积法在碳工作电极区域生长金纳米粒子。
11.所述方法优选将蜡印完成的纸芯片置于200℃的烘箱中加热180s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域，没有蜡印的部分为亲水区域，所得到的纸器件的总尺寸为30mm
×
30mm，由疏水蜡包围的圆形亲水区域直径为8mm，碳工作电极和碳对电极分别为直径6mm和4mm的圆，ag/agcl参比电极为直径7mm的半圆环。
12.本发明还提供上述制备方法得到的基于适配体门控效应的电化学纸芯片。
13.本发明还提供采用适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素a的方法：
14.先将含不同浓度赭曲霉毒素a的溶液与apta-hemin-zif-8@au溶液于在室温下培育40～60min，得待测混合溶液；
15.再对纸芯片进行简单折叠，将工作电极、参比电极和对电极重叠，用夹子固定后与电化学工作站连接；
16.再将得到的混合溶液用含有过氧化氢、磷酸缓冲溶液稀释，然后滴加到纸芯片的碳工作电极的表面，通过循环伏安曲线进行电化学信号检测，绘制电流强度与赭曲霉毒素a浓度的标准曲线。
17.本发明还提供apta-hemin-zif-8@au的制备方法，包括以下步骤：
18.第一步zif-8的制备
19.将硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于50ml的甲醇溶液中，超声处理10min；然后将两种溶液混合，置于室温下搅拌24h；得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；70℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8粉末；
20.可选地，在第一步中，所述硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为1.01～2.02：0.65～1.30；
21.第二步zif-8@au的制备
22.将第一步中得到的zif-8溶于50ml的甲醇溶液中；然后加入1～2ml的氯金酸溶液，搅拌2h；80℃油浴加热，加入谷胱甘肽，反应24～48h；冷却至室温，得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；60℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8@au；
23.可选地，在第二步中，所述zif-8、氯金酸和谷胱甘肽的质量比为100：10～20：20；
24.第三步apta-hemin-zif-8@au的制备
25.将制备的zif-8@au粉末溶于5mlhemin溶液中，室温下搅拌24h，使得hemin分子吸附在zif-8@au的孔隙中；然后加入100μl的赭曲霉毒素a的适配体溶液于室温下振荡60min，通过离心和洗涤除去未结合的适配体；最后将获得的apta-hemin-zif-8@au分散在5ml的ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存备用；
26.可选地，在第三步中，所述zif-8@au、hemin和赭曲霉毒素a适配体的质量比为10～15：50～100：0.01。
27.本技术中，“赭曲霉毒素a适配体”为本领域公知的适配体(biosensors and bioelectronics 2020 168 112503)。“apta”表示赭曲霉毒素a适配体。
28.适配体序列为：
29.5-sh-(ch2)
6-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggaca-3'。
30.本发明的有益成果
31.(1)利用电化学沉积法将au纳米粒子固定在工作电极表面，提高了传感界面的导
电性，加快电极界面的电子转移。
32.(2)apta-hemin-zif-8@au作为具有适配体门控效应的信号放大材料。当ota存在时，ota与适配体特异性结合形成复合物，导致适配体在zif-8@au表面脱离“biogate”打开，hemin从孔中释放，能有效地催化过氧化氢导致电流信号的增强，有效实现了信号放大。
33.(3)相比于传统的玻碳电极，基于丝网印刷工艺制备的纸芯片微型化、成本低廉，可批量生产，并且后处理简单，不会对环境造成污染。
34.(4)一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片实现了对赭曲霉毒素a的检测，其线性范围50pg/ml～100ng/ml，检测限最低为16.7pg/ml，具有重现性、选择性和稳定性好等优点，可以实现准确和灵敏检测的目的。
附图说明
35.图1为本发明所采用的纸芯片的尺寸；
36.图2为本发明所述方法的实验原理图；
37.图3为实施例1中不同浓度赭曲霉毒素a所对应传感器的标准曲线。
具体实施方式
38.为了更好的理解本发明，下面结合附图和具体实施方案作进一步详细说明，但不限于此。
39.一种基于适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素a的方法，步骤如下：
40.(1)首先利用adobe illustrator cs4软件设计纸芯片的打印图案，利用蜡印机将其批量打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸置于烘箱中，在200℃加热180s，形成亲水区域和疏水区域；
41.(2)采用丝网印刷技术将碳工作电极印刷在步骤(1)中制作的纸芯片a区域，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到b区域；通过丝网印刷技术在纸芯片上集成三电极系统。
42.(3)利用电化学沉积法在碳工作电极区域生长金纳米粒子，其具体步骤为：将100μl、质量分数为0.8～1％的haucl4溶液滴加在碳工作电极区域，采用i-t法，在-0.2v下，运行60s，用超纯水仔细清洗工作电极表面，最后于室温下干燥；
43.(4)将20μl含不同浓度赭曲霉毒素a的溶液与20μl的apta-hemin-zif-8@au溶液于在室温下培育40～60min；
44.(5)对纸芯片进行简单折叠，将工作电极、参比电极和对电极重叠，用夹子固定后与电化学工作站连接；
45.(6)将步骤(4)中得到的混合溶液用含有3～5mm过氧化氢、ph为7.0的磷酸缓冲溶液稀释至200μl，然后滴加到纸芯片的电化学工作区域，通过循环伏安曲线进行电化学信号检测，绘制电流强度与赭曲霉毒素a浓度的标准曲线，实现对赭曲霉毒素a的检测。
46.所述apta-hemin-zif-8@au的制备，其特征在于，步骤如下：
47.(1)zif-8的制备
48.将硝酸锌和2-甲基咪唑分别溶于50ml的甲醇溶液中，超声处理10min；然后将两种溶液混合，置于室温下搅拌24h；得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；70℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8粉末；
49.可选地，在步骤(1)中，所述硝酸锌和2-甲基咪唑的质量比为1.01～2.02：0.65～1.30；
50.(2)zif-8@au的制备
51.将步骤(1)中得到的zif-8溶于50ml的甲醇溶液中；然后加入1～2ml的氯金酸溶液，搅拌2h；80℃油浴加热，加入20mg谷胱甘肽，反应24～48h；冷却至室温，得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；60℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8@au；
52.可选地，在步骤(2)中，所述zif-8、氯金酸和谷胱甘肽的质量比为100：10～20：20；
53.(3)apta-hemin-zif-8@au的制备
54.将制备的zif-8@au粉末溶于5ml的hemin溶液中，室温下搅拌24h，使得hemin分子吸附在zif-8@au的孔隙中；然后加入100μl的赭曲霉毒素a的适配体溶液于室温下振荡60min，通过离心和洗涤除去未结合的适配体；最后将获得的apta-hemin-zif-8@au分散在5ml的ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存备用；
55.可选地，在步骤(3)中，所述zif-8@au、hemin和赭曲霉毒素a适配体的质量比为10～15：50～100：0.01。
56.电化学纸芯片的制备，步骤如下：将蜡印完成的纸芯片置于200℃的烘箱中加热180s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域，没有蜡印的部分为亲水区域，所得到的纸器件的总尺寸为30mm
×
30mm，由疏水蜡包围的圆形亲水区域直径为8mm，碳工作电极和碳对电极分别为直径6mm和4mm的圆，ag/agcl参比电极为直径7mm的半圆环。
57.本发明首先采用电化学沉积法将au纳米粒子生长在碳工作电极表面用来提高传感界面的导电性，然后利用适配体将hemin封装在多孔zif-8@au中，合成apta-hemin-zif-8@au复合材料作为纳米反应器，靶标与适配体特异性结合形成复合物，适配体在zif-8@au表面脱离“biogate”打开，hemin从孔中释放，能有效地促进过氧化氢到电极界面的电子转移，导致电流信号的增强。此方法构建的电化学适配体传感器对于赭曲霉毒素a检测表现出较宽的检测范围和低的检测限，在食品安全快速检测方面具有广阔的应用前景。
58.实施例1
59.1.基于适配体门控效应的电化学纸芯片检测赭曲霉毒素a的方法，步骤如下：
60.(1)首先利用adobe illustrator cs4软件设计纸芯片的打印图案，利用蜡印机将其批量打印在色谱纸上，然后将打印过的色谱纸置于烘箱中，在200℃加热180s，形成亲水区域和疏水区域；
61.(2)采用丝网印刷技术将碳工作电极印刷在步骤(1)中制作的纸芯片a区域，ag/agcl参比电极和碳对电极印刷到b区域；
62.(3)利用电化学沉积法在碳工作电极区域生长金纳米粒子，其具体步骤为：将100μl、质量分数为1％的haucl4溶液滴加在碳工作电极区域，采用i-t法，在-0.2v下，运行60s，用超纯水仔细清洗工作电极表面，最后于室温下干燥；
63.(4)将20μl含不同浓度赭曲霉毒素a的溶液与20μl的apta-hemin-zif-8@au溶液于在室温下培育40min；
64.(5)对纸芯片进行简单折叠，将工作电极、参比电极和对电极重叠，用夹子固定后与电化学工作站连接；
65.(6)将步骤(4)中得到的混合溶液用含有5mm过氧化氢、ph为7.0的磷酸缓冲溶液稀
释至200μl，然后滴加到纸芯片的电化学工作区域，以印制的ag/agcl电极作为参比电极，印制的碳电极作为对电极，利用三电极系统，采用循环伏安法对样品进行测试，测试条件为电势范围-0.6
–
0v，扫描速率50mv/s，绘制电流强度与赭曲霉毒素a浓度的标准曲线，实现对赭曲霉毒素a的检测。
66.2.apta-hemin-zif-8@au的制备，步骤如下：
67.(1)zif-8的制备
68.将1.01g硝酸锌和0.65g 2-甲基咪唑分别溶于50ml的甲醇溶液中，超声处理10min；然后将两种溶液混合，置于室温下搅拌24h；得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；70℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8粉末；
69.(2)zif-8@au的制备
70.将步骤(1)中得到的100mg zif-8溶于50ml的甲醇溶液中；然后加入1ml、质量分数为1％的氯金酸溶液，搅拌2h；80℃油浴加热，加入20mg谷胱甘肽，反应24h；冷却至室温，得到的产物通过离心收集，并用甲醇洗涤三次；60℃真空干燥箱中干燥24h，制得zif-8@au；
71.(3)apta-hemin-zif-8@au的制备
72.将10mg制备的zif-8@au粉末溶于5ml、质量分数为1％的hemin溶液中，室温下搅拌24h，使得hemin分子吸附在zif-8@au的孔隙中；然后加入100μl、100μg/ml的赭曲霉毒素a的适配体溶液于室温下振荡60min，通过离心和洗涤除去未结合的适配体；最后将获得的apta-hemin-zif-8@au分散在5ml的ph为7.0的磷酸盐缓冲溶液中，4℃下保存备用。
73.3.电化学纸芯片的制备，步骤如下：将蜡印完成的纸芯片置于200℃的烘箱中加热180s，使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水区域，没有蜡印的部分为亲水区域，所得到的纸器件的总尺寸为30mm
×
30mm，由疏水蜡包围的圆形亲水区域直径为8mm，碳工作电极和碳对电极分别为直径6mm和4mm的圆，ag/agcl参比电极为直径7mm的半圆环。