适合腺病毒载体增殖的MDCK-KOslc35b2细胞系及其应用

技术特征：
1.一种适合腺病毒载体增殖的mdck-koslc35b2细胞系，其特征在于：所述细胞系的全基因组中slc35b2基因位于第12号染色体，所述细胞系的全基因组中，第12号的一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少七个碱基tctgact，所述七个碱基tctgact位于slc35b2基因序列上的12857085-12857093的位点间；第12号的另一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少十七个碱基ggtccctctgacttcgc，所述十七个碱基ggtccctctgacttcgc位于slc35b2基因序列上的12857081-12857099的位点间。2.一种权利要求1所述适合腺病毒载体增殖的mdck-koslc35b2细胞系的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：1)稳定表达cas9蛋白的mdck细胞系的构建；2)靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiguide-sgrna slc35b2的构建；3)靶向slc35b2的lentiguide-sgrna slc35b2慢病毒生产；4)包含slc35b2基因突变的混合细胞的构建；5)slc35b2功能失活的mdck-koslc35b2细胞系的筛选。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤1)中，稳定表达cas9蛋白的mdck细胞系的构建方法如下：a.将293ft细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pmd2.g、pspax2、lenticas9-blast共转染293ft细胞，转染后收集细胞培养，离心，取上清即为含有慢病毒粒子的溶液；b.将mdck细胞铺至12孔板中，加入不同浓度的blasticidin抗生素，筛选出在3天时间内能够杀死全部细胞的最低浓度，并将此浓度定为后期筛选mdck细胞的敏感浓度；c.将mdck铺至6孔板中，待其贴壁，以培养基和慢病毒悬液体积比1：1加入6孔板中，细胞培养，定期换新鲜完全培养基，并按照mdck细胞的敏感浓度，加入blasticidin抗生素筛选阳性细胞，按照1细胞/孔，铺入96孔板，选择在blasticidin抗生素敏感浓度下生长快速的细胞进行扩大，即为稳定表达cas9的mdck细胞系。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)中，靶向slc35b2第二外显子的突变质粒lentiguide-sgrnaslc35b2的构建方法如下：a.根据位于犬第12号染色体上的序列，设计了靶向突变的sgrna序列，为gctcagaccgcgaagtcaga；b.在靶向突变的sgrna序列的两端补充bsmbi酶切后的粘性末端，合成序列如下：d-slc35b2-sgrna-f:5
’‑
caccgctcagaccgcgaagtcaga-3’，d-slc35b2-sgrna-r:5
’‑
aaactctgacttcgcggtctgagc-3’；c.将序列d-slc35b2-sgrna-f和d-slc35b2-sgrna-r进行磷酸化退火形成双链，即为含bsmbi酶切位点的靶向slc35b2第二外显子的slc35b2-sgrna双链；d.使用bsmbi双酶切lentiguide-puro质粒载体，回收得到lentiguide-puro片段；并将靶向slc35b2第二外显子的slc35b2-sgrna双链与回收的lentiguide-puro片段进行连接，得到连接产物；e.连接产物转化大肠杆菌感受态细胞后，得到突变质粒lentiguide-sgrna slc35b2。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：所述步骤2)第c小步中，磷酸化退火反应体系为：
在37℃反应30min，95℃反应5min，95℃-25℃梯度降温磷酸化退火。6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中，靶向slc35b2的lentiguide-sgrna slc35b2慢病毒生产方法如下：将293ft细胞铺至6孔板中，将慢病毒包装的质粒pmd2.g、pspax2、lentiguide-sgrna slc35b2共转染细胞；转染后收集细胞培养，离心，再次得到上清即为含有慢病毒粒子lentiguide-sgrna slc35b2的悬液。7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤4)中，slc35b2突变mdck细胞的筛选方法如下a.将步骤1)得到的mdck细胞传代入6孔板中，以完全培养基和包含慢病毒粒子lentiguide-sgrna slc35b2的细胞悬液体积比为1：1加入6孔板中，细胞培养24h后，定期换新鲜完全培养基，根据mdck细胞对puromycin抗生素敏感浓度，加入puromycin抗生素筛选阳性细胞，即为包含slc35b2基因突变的混合细胞。8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中，slc35b2功能失活的mdck-ko slc35b2细胞系的筛选和鉴定的方法如下：将包含slc35b2基因突变的混合细胞按照1个细胞/孔铺入96孔板中，利用有限稀释法进行单克隆细胞筛选，选择单细胞克隆的孔进行扩大培养；并将增殖出的单克隆细胞；即为mdck-细胞系。9.一种权利要求1所述适合腺病毒载体增殖的mdck-koslc35b2细胞系在制备腺病毒载体疫苗中的应用。

技术总结
本发明公开了一种适合腺病毒载体增殖的MDCK-KOslc35b2细胞系及其应用，所述细胞系的全基因组中，第12号的一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少七个碱基TCTGACT；第12号的另一个染色体上的slc35b2基因的第二段外显子基因序列上连续缺少十七个碱基GGTCCCTCTGACTTCGC。本发明在犬肾上皮细胞系MDCK中完全缺失SLC35B2的表达，缺失后影响细胞内相关蛋白酪氨酸的硫酸化，扰乱细胞内环境对DNA损伤修复及线粒体内稳态的调节。有利于腺病毒在细胞核内大量增殖，提高病毒的产量，降低临床中腺病毒载体疫苗的生产成本，利于重组腺病毒载体疫苗的研制。利于重组腺病毒载体疫苗的研制。利于重组腺病毒载体疫苗的研制。


技术研发人员：韩丽 王晓萍 张安定 叶贵珊
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.02.25
技术公布日：2022/6/10