一种饲用狗牙根遗传转化的方法

技术特征：
1.一种饲用狗牙根遗传转化的方法，所述饲用狗牙根为
‘
wrangler’，所述方法包括：1)以所述饲用狗牙根的种子为外植体，将所述外植体利用次氯酸钠溶液和/或双氧水水溶液和/或乙醇水溶液进行灭菌，得到灭菌狗牙根种子；2)将所述灭菌狗牙根种子于狗牙根愈伤诱导培养基上进行愈伤组织的诱导，得到黄色或淡黄色、形态为硬质颗粒状、致密又健康的饲用狗牙根胚性愈伤组织；所述狗牙根愈伤诱导培养基为向ms培养基中添加2,4-d、蔗糖得到的培养基，其中，2,4-d、蔗糖的添加量分别为3mg/l、30g/l，ph为5.8；3)按照农杆菌介导的遗传转化方法利用含有目的基因的重组农杆菌侵染所述饲用狗牙根胚性愈伤组织，而后依次进行共培养、筛选、分化和生根，实现饲用狗牙根的遗传转化。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侵染依次按照如下a)-c)进行：a)摇床中28℃摇床晃动培养20min；b)真空浓缩仪(300r/min,30℃)抽真空10min；c)超声仪(28℃)超声15min。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述愈伤组织的诱导在25℃下进行；和/或，所述愈伤组织的诱导在黑暗下进行。4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于：所述次氯酸钠溶液为将有效氯浓度为5.6％的次氯酸钠水溶液与水按照3:97的体积比混合得到的溶液；所述双氧水水溶液中双氧水的体积百分比为1.5％；所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分比为70％；和/或，所述次氯酸钠溶液处理的时间为2-4小时；所述双氧水水溶液处理的时间为12小时；所述乙醇水溶液处理的时间为1分钟。5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述侵染采用农杆菌悬浮液进行，所述农杆菌悬浮液为将所述重组农杆菌悬浮与乙酰丁香酮加至侵染液中得到的液体，乙酰丁香酮在所述农杆菌悬浮液中的浓度为100μm，所述侵染液为向ms培养基中添加2,4-d和蔗糖得到的液体，其中2,4-d和蔗糖的添加量分别为3mg/l和30g/l，ph＝5.2；和/或，所述共培养在共培养培养基中进行，所述共培养培养基为向ms培养基中添加2,4-d、蔗糖和乙酰丁香酮得到的培养基，其中，2,4-d、蔗糖和乙酰丁香酮的添加量分别为3mg/l、30g/l和100μm，ph＝5.2；和/或，所述筛选在筛选培养基中进行，所述筛选培养基为向ms培养基中添加2,4-d、蔗糖、潮霉素b、特美汀得到的培养基，其中，2,4-d、蔗糖、潮霉素b、特美汀的添加量分别为3mg/l、30g/l、30mg/l、300mg/l，ph＝5.8；和/或，所述分化在分化培养基a中进行，所述分化培养基a为向ms培养基中添加6-ba、kt、脯氨酸、酶水解干酪素、蔗糖、潮霉素b、特美汀得到的培养基，其中，6-ba、kt、脯氨酸、酶水解干酪素、蔗糖、潮霉素b、特美汀的添加量分别为0.5mg/l、2mg/l、0.5g/l、0.5g/l、30g/l、30mg/l、300mg/l，ph＝5.8；和/或，所述生根在生根培养基中进行，所述生根培养基为向1/2ms培养基中添加naa、蔗糖、潮霉素b、特美汀得到的培养基，其中，naa、蔗糖、潮霉素b、特美汀的添加量分别为0.2mg/l、8g/l、5mg/l、200mg/l，ph＝5.8。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述侵染在28℃下进行；和/或，所述共培养、所述筛选、所述分化和所述生根均在25℃下进行。7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对饲用狗牙根胚性愈伤组织进行继代培养，所述继代培养在狗牙根愈伤继代培养基中进行，所述狗牙根愈伤继代培养基为向ms培养基中添加2,4-d、6-ba、蔗糖得到的培养基，其中，2,4-d、6-ba、蔗糖的添加量分别为3mg/l、0.15mg/l、30g/l，ph为5.8。8.权利要求1-7中任一所述方法在狗牙根育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种饲用狗牙根遗传转化的方法。本发明公开的一种饲用狗牙根遗传转化的方法包括：以饲用狗牙根的种子为外植体，灭菌后进行愈伤组织的诱导，得到黄色或淡黄色、形态为硬质颗粒状、致密又健康的饲用狗牙根胚性愈伤组织；而后按照农杆菌介导的遗传转化方法利用含有目的基因的重组农杆菌侵染所得饲用狗牙根胚性愈伤组织，而后依次进行共培养、筛选、分化和生根，实现饲用狗牙根的遗传转化。实验证明，利用本发明的方法可成功实现饲用狗牙根的遗传转化。根的遗传转化。


技术研发人员：付金民 徐筱
受保护的技术使用者：鲁东大学
技术研发日：2020.12.04
技术公布日：2022/6/10