一种靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器、制备方法及其应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及纳米递释系统，具体地说是一种靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器、制备方法及其应用。


背景技术：

2.一氧化氮(no)是人体内重要的气体信号分子之一，它在体内具有多种重要生理作用和潜在药理活性，在血管平滑肌舒张、血小板黏附、炎症和免疫反应，神经传递等多种生命活动中发挥着重要作用。近来研究表明，no在肿瘤治疗中也表现出潜在的应用前景。研究表明no能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性(约1000倍)，同时no联合放疗、化疗、及光动力疗法也表现出良好的增敏作用，可以逆转肿瘤对多种药物的耐药性。另外，no分子能够抑制耐药型癌细胞的p型糖蛋白表达，从而有效提高细胞内化疗药物的富集，增强杀伤效果；no还能够促进肿瘤血管正常化，促进肿瘤相关巨噬细胞、t细胞的瘤内渗透压，抑制肿瘤细胞表面pd-l1的表达。
3.目前在基础及临床前研究中no递送方式主要分为四种：一、直接吸入no气体；二、no供体小分子(如偶氮二醇烯类nonoates、亚硝基硫醇类rsno、硝基苯类phno2、金属亚硝酰化合物m-no、有机硝酸酯和有机亚硝酸酯)；三、纳米载体递送no(包括脂质体、二氧化硅纳米颗粒、量子点、二氧化钛、碳材料)；四、光催化产生内源性no。其中直接吸入低浓度的no面临着剂量控制差、靶向性低且由于患者个体no耐受程度不同，易导致no中毒等问题，另外no气体不稳定，极易氧化成毒性较强的二氧化氮，限制了其临床转化。no供体小分子虽然能够直接作用于组织释放no，其浓度控制相对容易，但是常见的no供体小分子通常缺乏肿瘤组织靶向性，易导致严重的毒副作用，很大程度上限制其临床使用效果。纳米递释系统可以有效调控药物的体内过程，提高药物在肿瘤组织的分布与富集，改善药物的细胞摄取与释放行为，实现减毒增效，利用纳米递释系统可以实现高效的no体内递送。一系列通过表面键合no供体的纳米载体(如脂质体、二氧化硅纳米颗粒、量子点、二氧化钛、碳材料、牛血清白蛋白纳米颗粒、金属-有机框架、普鲁士蓝颗粒等)已经被设计用于体内no的递送，显著提高了no在瘤内的富集。尽管no递送平台相比于no供体小分子在生物医学上具有更广的应用前景，但是每个no递送体系都具有自身的优点和缺陷。例如：no递送平台在输送no过程中未达到病灶部位就开始释放no。与之相似的是，负载no供体的no递送平台由于载体的不稳定性也会导致no的不可控释放。而且这些纳米载体材料仍依赖于no本身的释放效率。此外，相关体系主要涉及的无机材料其体内安全性也是未来临床转化不可忽略的重要问题。
4.紫外-可见光(uv-vis)触发no释放的策略，存在潜在的no中毒及光毒性，且紫外光组织穿透能力差，这些问题局限了大多数no供体的在体内的进一步应用。因此，开发出更可控、高效、催化no原位产生的纳米递释系统是no递送领域面临的重大挑战。


技术实现要素：

5.本发明的目的，旨在提供一种靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器，通过基质金属蛋白酶(mmp)响应性靶向肿瘤组织，有效地实现肿瘤治疗，同时降低全身毒性的效果。
6.本发明的另一个目的，旨在提供一种上述靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器的制备方法。
7.本发明还有一个目的，旨在提供一种上述靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器的应用。
8.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
9.一种靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器，所述一氧化氮纳米产生器为核壳结构。
10.作为一种限定，所述核壳结构，外壳为功能单体、交联剂和引发剂发生原位自由基聚合形成的凝胶层，内核为丙烯基化聚乙二醇修饰的上转换发光稀土材料；
11.所述内核尺寸为20～60nm，外壳尺寸10～20nm。
12.作为进一步限定，所述功能单体，包括2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、丙烯酰化的一氧化氮供体和丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇；
13.所述交联剂为n,n-亚甲基双丙烯酰胺；
14.所述引发剂为过硫酸铵；
15.所述丙烯基化聚乙二醇修饰的上转换发光稀土材料为ucnp@peg。
16.作为更进一步限定，所述丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇中，多肽的氨基酸序列为gplgvrgdg、cpenffgrgdsg、vplgvrgdk、pvgligrgdk、ggplgvrgdk或gpqgiwggcrgdk；
17.所述丙烯酰化的一氧化氮供体为丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物antp，结构式为：
[0018][0019]
作为进一步限定，所述2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、丙烯酰化的一氧化氮供体、丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇和n,n-亚甲基双丙烯酰胺摩尔比为5：5：0.2：1。
[0020]
作为另一种限定，所述聚乙二醇的分子量为500～5000。
[0021]
本发明还提供了上述靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器的一种制备方法，该方法包括依次进行的以下步骤：
[0022]
s1.通过溶剂热法合成疏水性油酸修饰的ucnp；
[0023]
s2.上述制备油酸修饰的ucnp，利用配体交换法用羧基-peg-丙烯酰胺交换油酸修饰的ucnp表面的油酸配体，得到了表面为peg修饰的亲水性ucnp@peg；
[0024]
s3.将所述亲水性ucnp@peg重悬，加入功能单体、交联剂和引发剂发生原位自由基聚合，在内核表面形成的mmp响应性的凝胶层为外壳，即得所述靶向肿瘤的近红外光响应的
一氧化氮纳米产生器。
[0025]
作为一种限定，所述的peg修饰的亲水性ucnp(ucnp@peg)，是利用配体交换法用异双官能团羧基-peg-丙烯酰胺交换油酸修饰的ucnp表面的油酸配体得到的。
[0026]
作为另一种限定，所述步骤s2中，ucnp与羧基-peg-丙烯酰胺的质量比为5:2。
[0027]
作为第三种限定，所述丙烯酰化的一氧化氮供体的制备方法为:
[0028]
s1.取5-氯-2-硝基三氟甲苯与1,6-己二胺，发生卤代反应，得到4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物；
[0029]
s2.4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物的氨基与丙烯酰氯反应，得丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物，即为所述丙烯酰化的一氧化氮供体。
[0030]
作为第四种限定，所述基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇的制备方法为:
[0031]
s1.取叠氮基聚乙二醇与炔基化基质金属蛋白酶响应肽在cubr催化下，发生键合，得到氨基化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇peg-gplgvrgdg-nh2、peg-cpenffgrgdsg-nh2、peg-vplgvrtgdk-nh2、peg-pvgligrgdk-nh2、peg-ggplgvrgdk-nh2或peg-gpqgiwggcrgdk-nh2；
[0032]
s2.氨基化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇与丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯在硼酸钠缓冲溶液中反应，即得所述丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇peg-gplgvrgdg-alkene、peg-cpenffgrgdsg-alkene、peg-vplgvrtgdk-alkene、peg-pvgligrgdk-alkene、peg-ggplgvrgdk-alkene或peg-gpqgiwggcrgdk-alkene。
[0033]
作为进一步限定，所述步骤s1中，键合是通过点击化学进行的；
[0034]
所述硼酸钠缓冲溶液浓度为15～25mm，ph值为8.0～8.5。
[0035]
本发明还提供了上述靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器的一种应用，所述靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器用于制备治疗肿瘤和抗菌药物。
[0036]
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
[0037]
①
本发明使用的丙烯酰化的一氧化氮供体，在紫外光作用下(365nm)能够高效的释放一氧化氮气体；
[0038]
②
本发明使用的上转换发光稀土材料(ucnp)，是一种能将低能量的光子转换成高能量光子的反斯托克发光的功能材料，材料所吸收的光子能量低于发射的光子能量，受到980nm近红外光激发，可以发射出365nm和475nm的紫外光；
[0039]
③
本发明使用的丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇中的gplgvrgdg、cpenffgrgdsg、vplgvrgdk、pvgligrgdk、ggplgvrgdk或gpqgiwggcrgdk，会在基质金属蛋白酶作用下会响应性地断裂，实现凝胶层的破坏及降解，暴露出rgd肿瘤靶向肽片段，实现肿瘤部位的高效富集；
[0040]
④
本发明提供的一氧化氮纳米产生器，可以通过mmp响应性靶向mmp高表达地原发性肿瘤或肿瘤转移灶，并在近红外光照射下进行上转换发光过程，激发antp产生一氧化氮，实现一氧化氮精准、可控地在体内递送，具有靶向肿瘤微环境和在近红外光照射下可有效地实现即时、定点、可控释放合适浓度一氧化氮的功能，有效的治疗肿瘤的同时降低全身毒性；
[0041]
⑤
本发明提供的一氧化氮纳米产生器，纳米粒径很小，容易通过肿瘤部位异常的血管渗漏到肿瘤部位，从而实现瘤内富集。
[0042]
⑥
本发明提供的一氧化氮纳米产生器的制备方法，通过本发明特定地反应条件，以表面带peg的亲水性ucnp@peg为内核，功能化单体丙烯酰胺化基质金属蛋白酶响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇、丙烯酰化的一氧化氮供体(antp)、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱、交联剂n,n'-甲烯基双丙烯酰胺及引发剂过硫酸铵发生原位自由基聚合，在内核表面形成的mmp响应性的凝胶层为外壳，共同构成一氧化氮纳米产生器，本发明提供的方法简单可控，能够进一步地应用到各类核壳结构纳米材料地制备中。
[0043]
本发明适用于制备靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器，所制备的靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器适用于治疗肿瘤和抗菌药物。
附图说明
[0044]
下面结合附图及具体实施例对本发明作更进一步详细说明；
[0045]
图1为本发明实施例提供的靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器及其制备方法示意图；
[0046]
图2为实施例1中4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(ntp)的1hnmr表征图；
[0047]
图3为实施例2中丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物antp的1hnmr表征图；
[0048]
图4为实施例3中ntp及antp紫外特征吸收图谱；
[0049]
图5为实施例4中ntp经365nm的紫外光光照后的紫外吸收图变化曲线；
[0050]
图6为实施例4中antp经365nm的紫外光光照后的紫外吸收图变化曲线及一氧化氮释放曲线；
[0051]
图7为实施例7中ucnp@peg颗粒的电镜表征图；
[0052]
图8为实施例7中ucnp@peg的上转换发射光谱；
[0053]
图9为实施例8和实施例9中凝胶包覆的ucnp@n-pno和ucnp@s-pno的电镜表征图；
[0054]
图10为实施例10中ucnp@peg、ucnp@s-pno及ucnp@n-pno的尺寸大小分布；
[0055]
图11为实施例10中ucnp@peg、ucnp@s-pno及ucnp@n-pno的表面电势情况；
[0056]
图12为实施例11中ucnp@s-pno在近红外光照射下一氧化氮释放曲线；
[0057]
图13为实施例12中利用mtt比色法检测实施例1中ucnp@s-pno纳米颗粒在非光照下的细胞毒性；
[0058]
图14为实施例13中利用mtt比色法检测实施例1中ucnp@s-pno纳米颗粒在近红外光照射下的细胞毒性。
具体实施方式：
[0059]
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，而非限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，通常按照常规条件或按照所用检测材料、试剂制造厂商所建议
的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060]
本发明提供了一种靶向肿瘤的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器。所述一氧化氮纳米产生器的制备流程及响应性崩解过程如图1所示：
[0061]
由图1可见，所述一氧化氮纳米产生器，以上转换发光稀土材料ucnp为内核；用丙烯基化peg进行两亲化修饰后，再在表面包覆上在紫外光条件激发下释放一氧化氮的单体antp和基质金属蛋白酶(mmp)响应性靶向肽，通过聚合形成凝胶层外壳。
[0062]
该一氧化氮纳米产生器可以通过mmp响应性靶向肽特异性地靶向原发性肿瘤或肿瘤转移灶，并在近红外光照射下进行上转换发光过程，激发antp产生一氧化氮，从而达到特异性产生一氧化氮的目的。
[0063]
综上，所述含有基质金属蛋白酶响应性的近红外光响应一氧化氮纳米产生器为核壳结构，包括丙烯基化peg修饰的上转换发光稀土材料ucnp的内核、2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱及mmp响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇、n,n'-甲烯基双丙烯酰胺为交联剂及过硫酸铵为引发剂发生原位自由基聚合形成的凝胶层为外壳。
[0064]
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的近红外光响应的一氧化氮纳米产生器、其制备方法和应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
[0065]
实施例1 4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(ntp)单体的合成
[0066]
本实施例为4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(ntp)单体的合成方法，具体步骤为：
[0067]
将2.43g(20mmol)的1,6-己二胺和2.15g(20mmol)的na2co3加入盛有50ml乙醇的烧瓶中，于80℃条件下回流15分钟，取出烧瓶降温后，加入60μl(4mmol)的5-氯-2-硝基三氟甲苯进行搅拌，反应3天(用薄层层析硅胶板监测反应进程)，后用柱层析法纯化，旋蒸除去有机溶剂后，得黄色固体，其表征数据如图2所示：1hnmr(400mhz,meod)δ8.02(d,1h),6.98(d,1h),6.76(dd,j＝9.2,1h),3.21(t,2h),2.80-2.71(m,2h),1.74-1.62(m,2h),1.61-1.51(m,2h),1.50-1.37(m,4h)。
[0068]
由图2可知，所述黄色固体产物，即为4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(ntp)单体，通过计算，得出其产率为50％。
[0069]
具体的反应过程为：
[0070][0071]
实施例2丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(antp)单体的制备
[0072]
本实施例为丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(antp)单体的制备方法，具体步骤为：
[0073]
s1.将400mg的ntp溶解于5ml二氯甲烷中，加入152mg三乙胺，冷却至0℃，得溶液x；
[0074]
s2.将118mg丙烯酰氯溶于5ml二氯甲烷中，得溶液y,将溶液y逐滴加入至溶液x中，
反应10小时(用薄层层析硅胶板监测反应进程)，反应结束后抽滤除去不溶性沉淀，得溶液z；
[0075]
s3.溶液z浓缩后用乙酸乙酯进行稀释，加入饱和氯化钠溶液洗涤3次，后用柱层析法进行纯化，旋蒸除去有机溶剂后，得黄色固体antp，其表征数据如图3所示：1hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.03(d,1h),6.91(d,1h),6.66(dd,1h),6.30(dd,1h),6.08(dd,1h),5.66(dd,2h),3.37(dd,2h),3.22(t,2h),1.62(ddd,2h),1.44(ddd,2h),1.25(s,4h)。
[0076]
由图3可知，所述黄色固体产物，即为丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(antp)单体，通过计算，得出其产率为65％。
[0077]
具体的反应过程为：
[0078][0079]
综合实施例1和实施例2可知，合成antp的具体流程为：
[0080][0081]
实施例3ntp及antp紫外吸收曲线表征
[0082]
本实施例为ntp及antp紫外吸收测定实验，具体步骤为：
[0083]
按实施例1与实施例2中方法制备化合物后，分别配置浓度为0.5mg/ml的ntp及antp的乙醇溶液，用紫外分光光度计分别测定ntp及antp这两种化合物的紫外吸收，结果如图4所示。
[0084]
由图4可知，ntp的最高吸收峰出现在404nm，而antp的最高吸收峰出现红移，为408nm；由此可知，ntp成功实现了丙烯酰化修饰得到antp。
[0085]
实施例4紫外光触发ntp及antp释放一氧化氮
[0086]
(1)ntp经紫外光光照后的紫外吸收变化检测：
[0087]
使用紫外分光光度计对实施例1中制备的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(ntp)单体的紫外吸收峰进行检测。ntp经紫外光照射后，发生硝基到亚硝酸盐的光重排，随后o-n键断裂产生苯氧基自由基和一氧化氮，紫外吸收会发生明显变化，基于此原理，通过紫外光光照前后ntp单体紫外吸收峰的变化，计算其一氧化氮释放量。具体实验步骤为：
[0088]
s1.用乙醇测量基线；
[0089]
s2.将ntp单体分散在浓度为0.5mg/ml的乙醇中，检测未经紫外光照射时的紫外吸收峰；
[0090]
s3.用365nm激光器，在光照功率为1.5w/cm2条件下对s2中的ntp乙醇溶液进行光照，每光照1min停1min，累计计算光照时间，依次测定0min，2min，4min，6min，11min，26min，36min，46min，56min，71min，90min时ntp的紫外吸收图谱，结果如图5所示；
[0091]
由图5可知，404nm处紫外吸收值随着光照时间的延长逐渐降低，说明ntp的结构发生变化，由此可知ntp在紫外光照后可释放一氧化氮。
[0092]
(2)antp经紫外光光照后的紫外吸收变化检测：
[0093]
使用紫外分光光度计对实施例2中制备的丙烯酰胺修饰的4-硝基-3-三氟甲基卤代苯衍生物(antp)单体的紫外吸收峰进行检测。antp经紫外光照射后，发生硝基到亚硝酸盐的光重排，随后o-n键断裂产生苯氧基自由基和一氧化氮，紫外吸收会发生明显变化。基于此原理，通过紫外光光照前后antp单体紫外吸收峰的变化，计算其一氧化氮释放量。具体实验步骤为：
[0094]
s1.用乙醇测量基线；
[0095]
s2.将antp单体分散在浓度为0.5mg/ml的乙醇中，先检测未经紫外光照射时antp的紫外吸收峰；
[0096]
s3.用365nm激光器，在光照功率为1.5w/cm2条件下对s2中的antp乙醇溶液进行光照，每光照1min停1min，累计计算光照时间，依次测定0min，2min，4min，6min，11min，26min，36min，46min，56min，71min，90min时antp的紫外吸收图谱，结果如图6所示；
[0097]
由图6可知，404nm处紫外吸收值随着光照时间的延长逐渐降低，而538nm处的紫外吸收值逐渐升高，由此可知antp在紫外光照后可释放一氧化氮。
[0098]
综上所述，可知antp可实现一氧化氮的光控释放。
[0099]
实施例5丙烯酰胺化mmp响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇
[0100]
本实施例为以分子量2000的聚乙二醇制备丙烯酰胺化mmp响应性的rgd靶向肽(以gplgvrgdg序列为例)键合的聚乙二醇的方法，包括依次进行的以下步骤：
[0101]
s1.将0.3g(0.06mmol)的叠氮化聚乙二醇(peg
2000-n3)，62mg(0.072mmol)的炔基化mmp肽(序列：alkynyl-gplgvrgddg)，31mg(0.18mmol)的n,n,n',n",n"-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)溶解在3ml无水n,n-二甲基甲酰胺中，得溶液α；
[0102]
s2.将溶液α在液氮中冷冻成固体，抽真空后氮气填充并且反复3次，在氮气氛保护下，加入26mg(0.18mmol)的催化剂cubr，得反应体系β；
[0103]
s3.反应体系β经过两次冻-泵-解冻循环再脱气、在真空条件下密封后，于40℃条件下反应24小时，得反应体系γ；
[0104]
s4.将反应体系γ沉淀到冷的乙醚中，于12000r/min条件下离心20min，收集沉淀物，在真空下干燥过夜，得固体δ；
[0105]
s5.固体δ溶于水，装入透析袋(mwco：3500da)，在超纯水中透析3天，冻干后得到白色粉末，即为mmp响应性的多肽peg-gplgvrgdg-nh2，通过计算，得出其产率为55.8％；
[0106]
s6.取55.4mg的mmp响应性的多肽peg-gplgvrgdg-nh2，溶解在1ml硼酸钠缓冲溶液(20mm，ph8.0-8.5)中，反应溶液在剧烈搅拌下，缓慢加入7.2mg丙烯酸-n-琥珀酰亚胺酯，于
4℃下反应8小时，得固体ε；
[0107]
s7.固体ε在浓度为20mm的pbs磷酸盐缓冲液(ph＝7.4)中透析24小时后冻干，得到白色粉末，即为所述丙烯酰胺化mmp响应性的rgd靶向肽键合的聚乙二醇(peg-gplgvrgdg-alkene)，通过计算，得出其产率为52.6％。
[0108]
实施例6上转换荧光纳米颗粒ucnp的制备与表征
[0109]
本实施例为上转换荧光纳米颗粒ucnp的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
[0110]
s1.取2ml含有钇(iii)醋酸水合物y(ch3co2)3、醋酸镱(iii)水合物yb(ch3co2)3和醋酸铥水合物tm(ch3cooh)3的水溶液[n(y
3
):n(yb
3
):n(tm
3
)＝79:20:1]，与90％的油酸(oa)混合，于150℃下反应30分钟；
[0111]
本实施例中y(ch3co2)3的浓度为0.395mol/l，yb(ch3co2)3的浓度为0.1mol/l，tm(ch3cooh)3的浓度为0.005mol/l；
[0112]
s2.将90％的1-十八碳烯(ode)加入到上述溶液中继续反应30分钟，后冷却至50℃后，加入浓度为0.17m的氢氧化钠-甲醇和浓度为0.27m的氟化铵(nh4f)-甲醇混合液，升温至100℃后，在真空下保持30分钟，得反应体系ζ；
[0113]
s3.将应体系ζ升温至290℃，在氮气流下反应2小时，冷却至室温后用乙醇洗涤，得上转换荧光纳米颗粒ucnp。
[0114]
实施例7丙烯酰胺化聚乙二醇修饰的ucnp(ucnp@peg)的制备
[0115]
本实施例为丙烯酰胺化聚乙二醇修饰的ucnp(ucnp@peg)的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
[0116]
s1.环己烷分散的ucnp通过混合乙醇和离心得到ucnp沉淀；
[0117]
s2.ucnp沉淀收集后加入乙醇和hcl(0.2m)混合物，后以16000rpm离心25min两次，得固体η；
[0118]
s3.固体η用乙醇洗涤并分散在超纯水，稀释ucnp至ph值为8的硼酸钠溶液中，加入0.2mg羧基-peg-丙烯酰胺，并反应过夜后，用去离子水洗涤5次，最后分散在1ml去离子水中，得到丙烯酰胺化聚乙二醇修饰的ucnp(ucnp@peg)；
[0119]
s4.将ucnp@peg分散在4ml水中，进行电子显微镜表征，如图7所示，可知，ucnp@peg的形貌呈现均一的椭圆形，粒径为20nm左右；
[0120]
ucnp@peg的上转换发射光谱显示如图8所示，可知：ucnp@peg的激发波长为980nm，发射波峰为365nm及475nm，说明在激发光980nm照射下，ucnp@peg能够发射出365nm及475nm的紫外光。
[0121]
实施例8ucnp@n-pno体系的制备
[0122]
本实施例为ucnp@n-pno体系的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
[0123]
s1.将antp(10mg)、peg
2000-alkene(3.34mg)、n,n-亚甲基双丙烯酰胺(0.86mg)和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(4.29mg)溶解在0.5ml超纯水中，得溶液ⅰ；
[0124]
s2.将500μl浓度为2mg/ml的ucnp@peg稀释于5ml乙醇中，加入15μl浓度为133.3mg/ml的过硫酸铵和4μl的n,n,n
′
,n
′‑
四甲基乙二胺，得溶液ⅱ；
[0125]
s3.将溶液ⅱ逐滴添加到溶液ⅰ中，在氮气氛下培养2小时，于12000rpm离心15min，用超纯水清洗3遍，得所述ucnp@n-pno体系。
[0126]
其中，s1中antp、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、peg
2000-alkene及n,n-亚甲基
双丙烯酰胺的摩尔比＝5:5:0.2:1；
[0127]
ucnp@n-pno体系的电镜数据如图9所示：非mmp响应性的ucnp@n-pno形貌显示ucnp表面有一层均匀的凝胶层存在，粒径在40nm左右。
[0128]
实施例9ucnp@s-pno体系的制备
[0129]
本实施例为ucnp@s-pno体系的制备方法，包括依次进行的以下步骤：
[0130]
s1.将antp(10mg)、peg
2000-gplgvrgdg-alkene(3.34mg)、n,n-亚甲基双丙烯酰胺(0.86mg)和2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(4.29mg)溶解在0.5ml超纯水中，得溶液ⅰ'；
[0131]
s2.将500μl浓度为2mg/ml的ucnp@peg稀释于5ml乙醇中，加入15μl浓度为133.3mg/ml的过硫酸铵和4μl的n,n,n
′
,n
′‑
四甲基乙二胺，得溶液ⅱ'；
[0132]
s3.将溶液ⅱ'逐滴添加到溶液ⅰ'中，在氮气氛下培养2小时，于12000rpm离心15min，用超纯水清洗3遍，得所述ucnp@s-pno体系。
[0133]
其中，s1中antp、2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱、n,n-亚甲基双丙烯酰胺及peg
2000-gplgvrgdg-alkene的摩尔比＝5:5:1:0.2。
[0134]
使用透射电子显微镜对本实施例中的mmp响应性的近红外光响应一氧化氮纳米产生器凝胶的形貌进行观测，具体步骤为：
[0135]
吸取s3中制备的ucnp@s-pno体系10μl，置于透射电镜制样铜网上，在室温下静置于超净工作台中晾干，使用常温透射电子显微镜在200kv条件下观测样品形貌，如图9所示；
[0136]
由图9可知：ucnp@s-pno凝胶颗粒中衬度高的ucnp内核表面有一层衬度较低的有机物包覆层，因此结果显示成功制备得到了以ucnp为内核，表面包覆有机凝胶层的ucnp@s-pno凝胶颗粒。
[0137]
实施例10ucnp@s-pno体系颗粒粒径电势性质表征
[0138]
使用malvernzetasizer动态光散射纳米粒度仪对实施例8和9中的mmp响应性的近红外光响应一氧化氮纳米产生器凝胶的粒径和电势性质进行检测，将按实施例8和9制备的样品分别分散在超纯水中，分别吸取300μl加入纳米粒度检测样品池和电势检测样品池中，在检测温度25℃、平衡时间120s、检测介质为水的条件下检测纳米凝胶的粒径和电势性质。
[0139]
如图10和图11，分别为实施例8和9的mmp响应性的近红外光响应一氧化氮纳米产生器ucnp@s-pno凝胶颗粒的纳米粒径分布图像和表面电势图像。由图像可知，ucnp@s-pno凝胶颗粒粒径均匀，约50nm，表面电势为-25mv，电负性较强。
[0140]
实施例11近红外光触发ucnp@s-pno释放一氧化氮的动力学曲线
[0141]
使用紫外分光光度计对实施例9中制备的基质金属蛋白酶响应性的近红外光响应一氧化氮纳米产生器凝胶ucnp@s-pno的紫外吸收峰进行检测，通过近红外光光照前后ucnp@s-pno纳米凝胶紫外吸收峰的变化，计算其一氧化氮释放量。具体实验步骤为：
[0142]
s1.用超纯水测量基线；
[0143]
s2.将纳米凝胶ucnp@s-pno分散在超纯水中，先检测未经近红外光照射的紫外吸收峰；
[0144]
s3.用980nm激光器，在冰浴、光照功率为1.5w/cm2条件下进行光照，每光照1min，停1min，累计计算光照时间，每累计光照5min检测一次ucnp@s-pno纳米凝胶的紫外吸收图谱；
[0145]
s4.根据385nm处紫外吸收峰降低程度进行统计，得到ucnp@s-pno释放一氧化氮动
力学图谱。
[0146]
ucnp@s-pno释放一氧化氮动力学图谱结果如图12所示。由图像可知，ucnp@s-pno凝胶颗粒在光照前20min快速释放一氧化氮，之后释放速度减慢，约50min时到达平台期，表明按照实施例9制备的ucnp@s-pno凝胶颗粒确实能够在近红外光(980nm激光)下可控地响应性地释放一氧化氮。
[0147]
实施例12ucnp@s-pno细胞毒性检测
[0148]
本实施例为ucnp@s-pno细胞毒性检测实验，具体包括依次进行的以下步骤：
[0149]
s1.将鼠源乳腺癌4t1细胞在含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基中培养，按每孔5
×
103细胞每100μl的密度接种于96孔培养板，在37℃，5％co2条件下培养24小时，此时细胞密度达到70％左右；
[0150]
s2.将实施例9制备的ucnp@s-pno凝胶颗粒和用于对照的ucnp@n-pno凝胶颗粒以0.5mg/ml浓度分散在含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基中，配置成原液，用该培养基1/2稀释该原液，共稀释成9个浓度；
[0151]
s3.吸出s1中原有的培养基，加入稀释好的各浓度的稀释液继续培养48小时后，吸出含有凝胶颗粒的稀释液，加入浓度为1mg/ml的mtt稀释液(用含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基稀释)于37℃条件下孵育4小时，形成蓝黑色的甲瓒；
[0152]
s4.小心吸出上清液，每孔加入100μldmso，于37℃条件下孵育15min后，用多功能酶标仪id5测定570nm处的吸光度，用该吸光度计算细胞存活率；
[0153]
其计算公式为：细胞存活率(％)＝(od
sample-od
blank
/od
pbs-od
blank
)
×
100％
[0154]
其中，od
sample
为实验组吸光度；od
blank
为未加入细胞的空白组吸光度；od
pbs
为加入细胞但未加入凝胶颗粒的对照组吸光度。
[0155]
结果如图13所示，实施例9中制备的ucnp@s-pno凝胶颗粒浓度达到250μg/ml，细胞活性仍然高达90％以上，表明ucnp@s-pno具有良好的生物相容性。
[0156]
实施例13近红外光联合ucnp@s-pno处理后细胞毒性检测
[0157]
本实施例为近红外光联合ucnp@s-pno处理后细胞毒性检测实验，具体包括依次进行的以下步骤：
[0158]
s1.将鼠源乳腺癌4t1细胞在含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基中培养，按每孔5
×
103细胞每100μl的密度接种于96孔培养板，在37℃，5％co2条件下培养24小时，此时细胞密度达到70％左右；
[0159]
s2.将实施例9制备的ucnp@s-pno凝胶颗粒和用于对照的ucnp@n-pno凝胶颗粒以0.5mg/ml浓度分散在含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基中，配置成原液。并用该培养基1/2稀释该原液，共稀释成9个浓度；
[0160]
s3.吸出s1中原有的培养基，加入稀释好的各浓度的稀释液继续培养48小时后，用980nm激光器，在光照功率为1.5w/cm2条件下进行光照，每光照1min，停1min，累计光照时间10min；
[0161]
s4.光照结束后，吸出含有凝胶颗粒的稀释液，加入浓度为1mg/ml的mtt稀释液(用含有10％的胎牛血清和1％双抗的dmem完全培养基稀释)，于37℃条件下孵育4h，形成蓝黑色的甲瓒；
[0162]
s5.小心吸出上清液，每孔加入100μldmso，于37℃条件下孵育15min，用多功能酶
标仪id5测定570nm处的吸光度，用该吸光度计算细胞存活率；
[0163]
其计算公式为：细胞存活率(％)＝(od
sample-od
blank
/od
pbs-od
blank
)
×
100％
[0164]
其中，od
sample
为实验组吸光度；od
blank
为未加入细胞的空白组吸光度；od
pbs
为加入细胞但未加入凝胶颗粒的对照组吸光度。
[0165]
实施例9的ucnp@s-pno凝胶颗粒确实能够在近红外光(980nm激光)照射下，显示出明显的细胞毒性结果如图14所示，由图14可知，ucnp@s-pno凝胶颗粒产生的no能够引起细胞毒性。