一种星油藤脱毒苗的培养方法

1.本发明涉及植物组织培养领域，具体地说，公开了一种星油藤脱毒苗的培养方法。


背景技术：

2.星油藤(plukenetia volubilis l.)又称为南美油藤、印加果和印加花生等，从星油藤种子榨取的油脂富含含α-亚麻酸、α-亚油酸和油酸等多元不饱和脂肪，药品和化妆品等领。星油藤于2006年被引进中国科学院西双版纳热带植物园培育种植并获得成功，目前云南、贵州等省市大力发展星油藤产业。星油藤为多年生藤本植物，一次种植后可连续收果多年，但由于星油藤幼苗自身携带病毒，后期植株病害严重，导致落果，产果量下降。因此，建立一种有效的百香果脱毒苗培养方法对于星油藤产业的发展具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种星油藤脱毒苗的培养方法，本发明以星油藤植株茎尖为外植体，经过不定芽诱导、脱毒处理、增殖培养、生根培养和炼苗移栽等过程获得大批量的星油藤脱毒苗，有效降低了大田种植后期的发病率，提高了星油藤产果量，从而实现了本发明的目的。
4.本发明的一种星油藤脱毒苗的培养方法，包括以下的工艺步骤：
5.(1)不定芽诱导：选取星油藤植株6～8cm茎尖为外植体，经75％乙醇消毒10s，用无菌水洗涤5次后，置于0.1％升汞溶液中浸泡6min，再用无菌水洗涤6次，经无菌滤纸吸干水珠后切成2～3cm的带节茎段，接种到不定芽诱导培养中，于25℃条件下黑暗培养至形成不定芽，所述的不定芽诱导培养基为ms 0.1～0.5mg/l tdz 1.0～2.0mg/l 6-ba 0.1～0.5mg/l naa 15～30g/l蔗糖 3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
6.(2)脱毒处理：在无菌条件下，用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸10～20min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将步骤(1)获得的不定芽紧贴滤纸上，置于40～45℃条件下黑暗培养3～5d，剥取新生不定芽0.5cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照12～15h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养20～30d形成新的不定芽。再用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸10～20min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将新形成的不定芽紧贴滤纸上，置于40～45℃条件下黑暗培养3～5d，剥取新生不定芽0.2cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照12～15h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养20～30d形成新的不定芽。
7.(3)增殖培养：将步骤(2)获得的不定芽从基部切下并接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照12～15h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养，每20～30d转接一次。所述的增殖培养基为ms 1.0～2.0mg/l 6-ba 0.1～0.5mg/l naa 15～30g/l蔗糖 3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
8.(4)生根培养：将步骤(3)获得的长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25℃条件下黑暗培养3～5d，然后置于每天光照12～15h，光照强
度为2000～3000lx，培养温度为25℃条件下培养至生根。所述的生根培养基为1/2ms 0.1～0.5mg/l iba 1.0～2.0mg/l ggr 15～30g/l蔗糖 3.5～6.0g/l琼脂，ph为5.4～5.8；
9.(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根幼苗在混合基质中栽培成苗即得星油藤脱毒苗。所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质。
10.本发明具有成本低、效果好、操作性强等特点，可工业化大批量生产星油藤脱毒苗，同时脱毒苗种植后可有效降低星油藤的病害率，提高结果率，提高了星油藤的经济效益。
具体实施方式
11.以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
12.实施例一
13.(1)不定芽诱导：选取星油藤植株6～8cm茎尖为外植体，经75％乙醇消毒10s，用无菌水洗涤5次后，置于0.1％升汞溶液中浸泡6min，再用无菌水洗涤6次，经无菌滤纸吸干水珠后切成2～3cm的带节茎段，接种到不定芽诱导培养中，于25℃条件下黑暗培养20d即可形成不定芽，污染率低于5％，不定芽诱导率可达94.8％。所述的不定芽诱导培养基为ms 0.1mg/l tdz 1.0mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 15g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.4；
14.(2)脱毒处理：在无菌条件下，用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸10min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将步骤(1)获得的不定芽紧贴滤纸上，置于40℃条件下黑暗培养3d，剥取新生不定芽0.5cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照12h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养20d形成新的不定芽，不定芽诱导率为75.3％。再用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸10min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将新形成的不定芽紧贴滤纸上，置于40℃条件下黑暗培养3d，剥取新生不定芽0.2cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照12h，光照强度为1500lx，培养温度为25℃条件下培养20d形成新的不定芽,不定芽诱导率为51.8％。
15.(3)增殖培养：将步骤(2)获得的不定芽从基部切下并接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照12h，光照强度为1500lx，培养温度为25℃条件下培养，每20d转接一次，增殖系数为8.09。所述的增殖培养基为ms 1.0mg/l 6-ba 0.1mg/l naa 15g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.4；
16.(4)生根培养：将步骤(3)获得的长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25℃条件下黑暗培养3d，然后置于每天光照12h，光照强度为2000lx，培养温度为25℃条件下培养10d即开始生根，生根率达到95.2％。所述的生根培养基为1/2ms 0.1mg/l iba 1.0mg/l ggr 15g/l蔗糖 3.5g/l琼脂，ph为5.4；
17.(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根幼苗在混合基质中栽培成苗即得星油藤脱毒苗，移栽成活率达到97.6％。所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质。移栽大田种植后，第3年发病率低于2.3％。
18.实施例二
19.(1)不定芽诱导：选取星油藤植株6～8cm茎尖为外植体，经75％乙醇消毒10s，用无菌水洗涤5次后，置于0.1％升汞溶液中浸泡6min，再用无菌水洗涤6次，经无菌滤纸吸干水珠后切成2～3cm的带节茎段，接种到不定芽诱导培养中，于25℃条件下黑暗培养18d即可形
成不定芽，污染率低于4％，不定芽诱导率可达96.1％。所述的不定芽诱导培养基为ms 0.mg/l tdz 1.5mg/l 6-ba 0.3mg/l naa 17g/l蔗糖 4.5g/l琼脂，ph为5.6；
20.(2)脱毒处理：在无菌条件下，用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸15min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将步骤(1)获得的不定芽紧贴滤纸上，置于43℃条件下黑暗培养4d，剥取新生不定芽0.5cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照14h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养25d形成新的不定芽，不定芽诱导率为73.8％。再用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸15min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将新形成的不定芽紧贴滤纸上，置于43℃条件下黑暗培养4d，剥取新生不定芽0.2cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照14h，光照强度为1700lx，培养温度为25℃条件下培养25d形成新的不定芽，不定芽诱导率为54.6％。。
21.(3)增殖培养：将步骤(2)获得的不定芽从基部切下并接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照13h，光照强度为1700lx，培养温度为25℃条件下培养，每25d转接一次，增殖系数为8.27。所述的增殖培养基为ms 1.5mg/l 6-ba 0.3mg/l naa 17g/l蔗糖 4.5g/l琼脂，ph为5.6；
22.(4)生根培养：将步骤(3)获得的长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25℃条件下黑暗培养3～5d，然后置于每天光照14h，光照强度为2500lx，培养温度为25℃条件下培养10d即开始生根，生根率达到100％。所述的生根培养基为1/2ms 0.3mg/l iba 1.5mg/l ggr 18g/l蔗糖 4.0g/l琼脂，ph为5.6；
23.(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根幼苗在混合基质中栽培成苗即得星油藤脱毒苗，移栽成活率达到99.5％，所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质。移栽大田种植后，第3年发病率低于2.5％。
24.实施例四
25.(1)不定芽诱导：选取星油藤植株6～8cm茎尖为外植体，经75％乙醇消毒10s，用无菌水洗涤5次后，置于0.1％升汞溶液中浸泡6min，再用无菌水洗涤6次，经无菌滤纸吸干水珠后切成2～3cm的带节茎段，接种到不定芽诱导培养中，于25℃条件下黑暗培养19d即可形成不定芽，污染率低于3％，不定芽诱导率可达97.8％，所述的不定芽诱导培养基为ms 0.5mg/l tdz 2.0mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 6.0g/l琼脂，ph为5.8；
26.(2)脱毒处理：在无菌条件下，用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸20min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将步骤(1)获得的不定芽紧贴滤纸上，置于45℃条件下黑暗培养3～5d，剥取新生不定芽0.5cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照15h，光照强度为2000lx，培养温度为25℃条件下培养30d形成新的不定芽，定芽诱导率为80.4％。。再用灭菌的不含琼脂的不定芽诱导培养基中浸泡无菌滤纸20min，并将其平铺于无菌培养瓶中，再将新形成的不定芽紧贴滤纸上，置于45℃条件下黑暗培养5d，剥取新生不定芽0.2cm的茎尖，并接种于不定芽诱导培养基中，于每天光照15h，光照强度为2000lx，培养温度为25℃条件下培养30d形成新的不定芽，定芽诱导率为62.8％。。
27.(3)增殖培养：将步骤(2)获得的不定芽从基部切下并接种到增殖培养基上进行增殖培养，接种后置于每天光照15h，光照强度为1500～2000lx，培养温度为25℃条件下培养，每30d转接一次，增殖系数达到7.8。所述的增殖培养基为ms 2.0mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 30g/l蔗糖 6.0g/l琼脂，ph为5.8；
28.(4)生根培养：将步骤(3)获得的长至2～4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25℃条件下黑暗培养5d，然后置于每天光照15h，光照强度为3000lx，培养温度为25℃条件下培养9d即开始生根，生根率达到100％。所述的生根培养基为1/2ms 0.5mg/l iba 2.0mg/l ggr 30g/l蔗糖 6.0g/l琼脂，ph为5.8；
29.(5)炼苗移栽：将步骤(4)获得的生根幼苗在混合基质中栽培成苗即得星油藤脱毒苗，移栽成活率达到98％。所述混合基质为由比例8:1:1的泥炭土、农家肥、河沙混合而成的基质，移栽大田种植后，第3年发病率低于2.0％。