变体fc结构域及其用途
背景技术：
1.许多治疗剂(诸如小分子治疗剂和生物制剂，诸如肽、多肽和多核苷酸)的实用性受到血清半衰期不足的影响。这需要以高频率和/或更高剂量施用此类治疗剂，或使用缓释制剂，以保持治疗效果所需的血清水平。频繁地全身性施用药物与相当大的负面副作用相关联。例如，频繁的全身注射对受试者来说代表相当大的不适，造成施用相关感染的高风险，并且可能需要住院或频繁去医院就诊，特别是当治疗剂要静脉内施用时。此外，在长期治疗中，每日静脉注射也会导致由反复穿刺血管引起的组织疤痕和血管病变的相当大的副作用。类似的问题对于治疗剂的所有频繁的全身性施用是已知的。所有这些因素都会导致患者的顺从性下降和卫生系统成本增加。
2.需要新的更有效的增加治疗半衰期和功效的方式。
技术实现要素：
3.本公开提供了fc结构域单体、包括fc结构域单体的缀合物和包括fc结构域单体的融合蛋白，其中fc结构域单体是亲本fc多肽(例如，igg1或igg2多肽)的突变变体。fc结构域单体可包括有助于增加半衰期和/或功效的一种或多种突变。所述一种或多种突变还可使制造期间的聚集最小化，从而增加产量并降低成本。fc结构域单体还可针对尺寸(例如，如通过kda或氨基酸残基测量)进行优化，以便使组织分布到组织或感兴趣的部位最大化和/或使肾清除最小化。
4.在一个方面，本公开提供了一种变体fc结构域单体(例如，亲本fc多肽的变体)。变体fc结构域单体可包括位于位置220处的氨基酸取代。变体fc结构域单体可包括位于位置220和位置252、254和256处的氨基酸取代。变体fc结构域单体可包括位于位置309、311和434处的氨基酸取代。在一些实施方案中，位于位置220处的取代是丝氨酸，位于位置252处的取代是酪氨酸，位于位置254处的取代是苏氨酸，位于位置256处的取代是谷氨酸，位于位置309处的取代是天冬氨酸，位于位置311处的取代是组氨酸，且/或位于位置434处的取代是丝氨酸。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括位于位置220、252、254和256处的取代，其中编号是根据如kabat中的eu索引，并且其中位于位置220处的取代是丝氨酸，位于位置252处的取代是酪氨酸，位于位置254处的取代是苏氨酸，并且位于位置256处的取代是谷氨酸。在一些实施方案中，位于位置220处的取代是半胱氨酸至丝氨酸的取代(c220s)。在一些实施方案中，位于位置252处的取代是甲硫氨酸至酪氨酸的取代(m252y)。在一些实施方案中，位于位置254处的取代是丝氨酸至苏氨酸的取代(s254t)。在一些实施方案中，位于位置252处的取代是苏氨酸至谷氨酸酯(glutamate)的取代(t256e)。在一些实施方案中，位于位置309处的取代是缬氨酸至天冬氨酸的取代(v309d)。在一些实施方案中，位于位置311处的取代是谷氨酰胺至组氨酸的取代(q311h)。在一些实施方案中，位于位置434处的取代是天冬酰胺至丝氨酸的取代(n434s)。如上文和整个公开所指示的变体fc单体的氨基酸编号是根据如kabat中的eu索引。氨基酸取代是相对于野生型fc单体氨基酸序列，例如野生型人igg1或igg2而言的。
5.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括少于约300个氨基酸残基(例如，少于约300个、少于约295个、少于约290个、少于约285个、少于约280个、少于约275个、少于约270个、少于约265个、少于约260个、少于约255个、少于约250个、少于约245个、少于约240个、少于约235个、少于约230个、少于约225个，或少于约220个氨基酸残基)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体小于约40kda(例如，小于约35kda、小于约30kda、小于约25kda)。
6.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括至少200个氨基酸残基(例如，至少210个、至少220个、至少230个、至少240个、至少250个、至少260个、至少270个、至少280个、至少290个或至少300个氨基残基)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体为至少20kda(例如，至少25kda、至少30kda或至少35kda)。
7.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括200至400个氨基酸残基(例如，200至250个、250至300个、300至350个、350至400个、200至300个、250至350个或300至400个氨基酸残基)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的长度介于200个和300个氨基酸残基之间(例如，介于210个和300个、介于230个和300个、介于250个和300个、介于270个和300个、介于290个和300个、介于210个和290个、介于220个和280个、介于230个和270个、介于240个和260个或介于245个和255个氨基酸残基之间)。在特定实施方案中，变体fc结构域单体的长度介于240个和255个氨基酸残基之间(例如，241个氨基酸残基、242个氨基酸残基、243个氨基酸残基、244个氨基酸残基、245个氨基酸残基、246个氨基酸残基、247个氨基酸残基、248个氨基酸残基、249个氨基酸残基、250个氨基酸残基、251个氨基酸残基、252个氨基酸残基、253个氨基酸残基或254个氨基酸残基)。在甚至更特定的实施方案中，变体fc结构域单体的长度为246个氨基酸残基。在一些实施方案中，变体fc结构域单体为20至40kda(例如，20至25kda、25至30kda、35至40kda、20至30kda、25至35kda或30至40kda)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的质量介于约20kda和约40kda之间(例如，20kda至25kda、25kda至30kda、30kda至35kda、35kda至40kda)。
8.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:1至52或56至58中的任一个的序列至少90％同一(例如，至少95％、至少98％同一)的氨基酸序列或其区域。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括seq id no:1至52或56至58中的任一个的氨基酸序列，或其区域。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:1至19中的任一个的序列至少90％同一(例如，至少95％、至少98％同一)的氨基酸序列或其区域。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括seq id no:1至19中的任一个的氨基酸序列或其区域。
9.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括seq id no:1至19、23至29或31中的任一个的区域，其中该区域包括220、252、254和256位置。在一些实施方案中，该区域包括至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少110个氨基酸残基、至少120个氨基酸残基、至少130个氨基酸残基、至少140个氨基酸残基、至少150个氨基酸残基、至少160个氨基酸残基、至少170个氨基酸残基、至少180个氨基酸残基、至少190个氨基酸残基或至少200个氨基酸残基。
10.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括seq id no:31至52中的任一个的区域，其中该区域包括220、309、311和434位置。在一些实施方案中，该区域包括至少215个氨基酸残基、至少220个氨基酸残基、至少225个氨基酸残基、至少230个氨基酸残基、至少235
个氨基酸残基、至少240个氨基酸残基或至少245个氨基酸残基。
11.在另一方面，本公开提供了一种包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸的变体fc结构域单体，其中氨基酸编号是根据如kabat中的eu索引，并且其中所述变体fc结构域单体的长度介于200个和300个氨基酸残基之间(例如，介于210个和300个氨基酸残基之间、介于230个和300个氨基酸残基之间、介于250个和300个氨基酸残基之间、介于270个和300个氨基酸残基之间、介于290个和300个氨基酸残基之间、介于210个和290个氨基酸残基之间、介于220个和280个氨基酸残基之间、介于230个和270个氨基酸残基之间、介于240个和260个氨基酸残基之间或介于245个和255个氨基酸残基之间)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸、位于位置252处的酪氨酸、位于位置254处的苏氨酸和/或位于位置256处的谷氨酸。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸、位于位置309处的天冬氨酸、位于位置311处的组氨酸和/或位于位置434处的丝氨酸。在一些实施方案中，相对于对应的人野生型fc序列，变体fc结构域单体进一步包括一个或多个(一个、二个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)另外的突变(例如氨基酸缺失、添加和/或取代)。
12.在另一方面，本公开提供了一种包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸的变体fc结构域单体，其中氨基酸编号是根据如kabat中的eu索引，并且其中所述变体fc结构域单体的质量介于约20kda和约40kda之间(例如，20kda至25kda、25kda至30kda、30kda至35kda、35kda至40kda)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸、位于位置252处的酪氨酸、位于位置254处的苏氨酸和/或位于位置256处的谷氨酸。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括位于氨基酸位置220处的丝氨酸、位于位置309处的天冬氨酸、位于位置311处的组氨酸和/或位于位置434处的丝氨酸。
13.在一些实施方案中，变体fc结构域单体是人igg1或人igg2的变体。在一些实施方案中，变体fc结构域单体是人igg1的变体。
14.在一些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端包括fab结构域的10个至20个的残基(例如，11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基)。在某些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基198至205中的任一个。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基201(例如，asn201)。在某些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基202(例如，val202)。在其他实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基437至447中的任一个。在另一个实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基446(例如，gly446)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基447(例如，lys447)。
15.在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:1至29、31至52以及56至58(例如，seq id no:1至19、seq id no:20至29、seq id no:31至52以及56至58)的序列至少90％同一(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或100％同一)的氨基酸序列或其区域。
16.在另一方面，本发明提供了一种包括变体fc结构域单体的二聚体的变体fc结构域，所述变体fc结构域单体各自独立地选自本文所述的变体fc结构域单体中的任一种，其中所述变体fc结构域的质量介于约50kda和约70kda之间(例如，约51kda、约52kda、约53kda、约54kda、约55kda、约56kda、约57kda、约58kda、约59kda、约60kda、约61kda、约
62kda、约63kda、约64kda、约65kda、约66kda、约67kda、约68kda或约69kda)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体二聚化(例如，同源二聚体或异源二聚体)以形成变体fc结构域。在一些实施方案中，变体fc结构域为至少40kda(例如，至少45kda、至少50kda、至少55kda、至少60kda、至少65kda、至少70kda、至少75kda或至少80kda)。在一些实施方案中，变体fc结构域的质量介于40kda和80kda之间(例如，介于约42kda和约50kda之间、介于约48kda和约55kda之间、介于约53kda和约60kda之间、介于约58kda和约65kda之间、介于约62kda和约70kda之间、介于约68kda和约75kda之间，或介于约72kda和约80kda之间)。在特定实施方案中，变体fc结构域的质量介于55kda和62kda之间(例如，约56kda、约57kda、约58kda、约59kda、约60kda或约61kda)。在优选的实施方案中，变体fc结构域是包括两种变体fc结构域单体的同源二聚体(例如，其中每种变体fc结构域单体包括seq id no:1至52或56至58中的任一个的序列的同源二聚体)。
17.在另一方面，本公开提供了一种缀合物，其包括本文所述的变体fc结构域和至少一种治疗剂，其中变体fc结构域单体通过接头与所述至少一种治疗剂共价缀合。在一些实施方案中，所述缀合物由式(1)或由其药学上可接受的盐描述：
[0018][0019]
其中每个a独立地为治疗剂；
[0020]
每个e包括变体fc结构域单体或包括变体fc结构域单体的多肽；
[0021]
l为接头；
[0022]
n为1或2；
[0023]
t为1至20的整数；并且
[0024]
连接到e的波浪线表示每个l-a与e共价附接(例如，通过接头或键)。
[0025]
在一些实施方案中，治疗剂(a)是小分子治疗剂。在某些实施方案中，治疗剂(a)是单体(例如，单一)小分子治疗剂。在一些实施方案中，治疗剂(a)是小分子治疗剂的多聚体(例如，二聚体或更高聚体、三聚体或更高聚体、四聚体或更高聚体或五聚体或更高聚体)。在一些实施方案中，在(a)是小分子治疗剂的多聚体(例如，二聚体或更高聚体、三聚体或更高聚体、四聚体或更高聚体或五聚体或更高聚体)的情况下，每个(a)可以是相同的小分子剂或不同的小分子剂。在某些实施方案中，在治疗剂(a)是小分子剂的多聚体(例如，二聚体或更高聚体、三聚体或更高聚体、四聚体或更高聚体或五聚体或更高聚体)的情况下，每个小分子剂通过本文所述的任何接头连接。在一些实施方案中，接头具有三价结构(例如，三价接头)。三价接头具有三个臂，其中每个臂与缀合物的组分共价连接(例如，第一臂与第一治疗剂缀合，第二臂与第二治疗剂缀合，并且第三臂与融合蛋白或变体fc结构域单体缀合)。
[0026]
在一些实施方案中，每个接头包括聚乙二醇(peg)接头，该聚乙二醇(peg)接头包括介于约2个和10个之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)peg单元。在一些实施方案中，三
价接头的至少一个臂包括聚乙二醇(peg)接头，该聚乙二醇(peg)接头包括介于约2个和10个之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)peg单元。
[0027]
在一些实施方案中，治疗剂(a)是抗病毒剂、抗真菌剂或抗细菌剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是抗病毒剂。在一些实施方案中，所述治疗剂是抗真菌剂。在另外的实施方案中，所述治疗剂是抗细菌剂。
[0028]
在一些实施方案中，所述缀合物为至少40kda(例如，至少45kda、至少50kda、至少55kda、至少60kda、至少65kda、至少70kda、至少75kda或至少80kda)。在一些实施方案中，所述缀合物的质量介于约40kda和约80kda之间(例如，40kda至50kda、45kda至55kda、50kda至60kda、55kda至65kda、60kda至70kda、65kda至75kda或70kda至80kda)在特定实施方案中，所述缀合物的质量介于58kda和70kda之间(例如，约59kda、约60kda或约61kda、62kda、63kda、64kda、65kda、66kda、67kda、68kda或69kda)。
[0029]
在另一方面，本公开提供了一种融合蛋白，其包含变体fc结构域单体和至少一种多肽治疗剂，其中变体fc结构域单体与多肽治疗剂通过接头共价缀合。在一些实施方案中，融合蛋白包括下面的结构：
[0030]
(p
2-l2)
n2-b-(l
1-p1)
n1
[0031]
其中b是变体fc结构域单体、包括变体fc结构域单体的多肽，或缀合物(例如，本文所述的任何缀合物)；p1和p2各自独立地为多肽治疗剂；l1和l2各自独立地为接头；并且n1和n2各自独立地为0或1，其中n1和n2中的至少一者为1。
[0032]
在一些实施方案中，融合蛋白包括少于约500个氨基酸残基(例如，少于约495个、少于约490个、少于约485个、少于约480个、少于约475个、少于约470个、少于约465个、少于约460个、少于约455个、少于约450个、少于约445个、少于约440个、少于约435个、少于约430个、少于约425个、少于约420个、少于约415个、少于约410个、少于约405个、少于约400个、少于约395个、少于约390个、少于约385个、少于约380个、少于约375个、少于约370个、少于约365个、少于约360个、少于约355个、少于约350个、少于约345个、少于约340个、少于约335个、少于约330个、少于约325个、少于约320个、少于约315个、少于约310个、少于约305个、少于约300个、少于约295个、少于约290个、少于约285个、少于约280个、少于约275个、少于约270个、少于约265个、少于约260个或少于约255个)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体小于约50kda(例如，小于约45kda、小于约40kda、小于约35kda或小于约30kda)。
[0033]
在一些实施方案中，融合蛋白包括至少250个氨基酸残基(例如，至少约250个、至少约260个、至少约270个、至少约280个、至少约290个、至少约300个氨基酸残基、至少约310个、至少约320个、至少约330个、至少约340个、至少约350个、至少约360个、至少约370个、至少约380个、至少约390个、至少约400个、至少约410个、至少约420个、至少约430个、至少约440个、至少约450个、至少约460个、至少约470个、至少约480个或至少约490个)。在一些实施方案中，融合蛋白为至少约30kda(例如，至少至少约35kda、至少至少约40kda或至少至少约45kda)。
[0034]
在一些实施方案中，融合蛋白包括250至500个氨基酸残基(例如，250至300个、300至350个、350至400个、200至300个、250至350个、300至400个、350至450个或400至500个氨基酸残基)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体为30至50kda(例如，30至35kda、30至40kda、35至45kda或40至50kda)。
[0035]
在一些实施方案中，治疗性多肽各自独立地包括少于约200个氨基酸残基(例如，少于约195个、少于约190个、少于约185个、少于约180个、少于约175个、少于约170个、少于约165个、少于约160个、少于约155个、少于约150个、少于约145个、少于约140个、少于约135个、少于约130个、少于约125个、少于约120个、少于约115个、少于约110个、少于约105个、少于约100个、少于约95个、少于约90个、少于约85个、少于约80个、少于约75个、少于约70个、少于约65个、少于约60个、少于约55个、少于约50个、少于约45个、少于约40个、少于约35个、少于约30个、少于约25个、少于约20个或少于约15个氨基酸残基)。
[0036]
在一些实施方案中，治疗性多肽各自独立地包括至少约10个氨基酸残基(例如，至少约15个、至少约20个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个、至少约60个、至少约65个、至少约70个、至少约75个、至少约80个、至少约85个、至少约90个、至少约95个、至少约100个、至少约105个、至少约110个、至少约115个、至少约120个、至少约125个、至少约130个、至少约135个、至少约140个、至少约145个、至少约150个、至少约155个、至少约160个、至少约165个、至少约170个、至少约175个、至少约180个、至少约185个、至少约190个或至少约195个氨基酸残基)。
[0037]
在一些实施方案中，n1为1，n2为0，并且融合蛋白包括下面的结构：
[0038]
b-l
1-p1。
[0039]
在一些实施方案中，接头(l1)与fc结构域单体(b)的c末端以及与多肽治疗剂(p1)的n末端缀合。在一些实施方案中，接头(l1)与fc结构域单体(b)的n末端以及多肽治疗剂(p1)的c末端缀合。在一些实施方案中，l1是包括2至200个氨基酸的肽接头。在一些实施方案中，l1是包括5至25个氨基酸的肽接头。在一些实施方案中，l1是包括(gs)
x
、(ggs)
x
、(ggggs)
x
、(ggsg)
x
、(sggg)
x
中的任一者的氨基酸序列的肽接头，其中x为1至10的整数。在一些实施方案中，b、l1和p1表达为单一多肽链。在一些实施方案中，接头(l1)与fc结构域单体(b)的n末端以及与多肽治疗剂(p1)的n末端缀合。在一些实施方案中，接头(l1)与fc结构域单体(b)的c末端以及与多肽治疗剂(p1)的c末端缀合。在一些实施方案中，l1包括与b和p1中的每一者共价缀合的化学接头。在一些实施方案中，b和p1表达为单独的多肽链并且随后各自与l1共价缀合。
[0040]
在一些实施方案中，n1为1，n2为1，并且融合蛋白包括下面的结构：
[0041]
p
2-l
2-b-l
1-p1。
[0042]
在一些实施方案中，接头(l2)与多肽治疗剂(p2)的c末端以及与fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)与fc结构域单体(b)的c末端以及与多肽治疗剂(p1)的n末端缀合。在一些实施方案中，l1和l2各自为独立选择的包括2至200个氨基酸的肽接头。在一些实施方案中，l1和l2各自为独立选择的包括5至25个氨基酸的肽接头。在一些实施方案中，l1和l2各自为独立选择的包括(gs)
x
、(ggs)
x
、(ggggs)
x
、(ggsg)
x
、(sggg)
x
中的任一者的氨基酸序列的肽接头，其中x为1至10的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)。在一些实施方案中，p2、l2、b、l1和p1一起表达为单一多肽链。在一些实施方案中，接头(l2)与多肽治疗剂(p2)的n末端以及与fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)与多肽治疗剂(p1)的n末端以及与fc结构域单体(b)的c末端缀合。在一些实施方案中，接头(l2)与多肽治疗剂(p2)的c末端以及与fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)与多肽治疗剂(p1)的c末端以及与fc结构域单体(b)的c末端缀合。在一些实施方案中，l2包括与b和p2中的每一者共价缀合的化学接
头，并且l1包括与b和p1中的每一者共价缀合的化学接头。在一些实施方案中，p2、b和p1表达为单独的多肽链，p2和b随后各自与l2共价缀合，并且p1和b随后各自与l1共价缀合。
[0043]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体二聚化从而形成fc结构域。在一些实施方案中，fc结构域中的每种变体fc结构域单体具有相同的氨基酸序列，从而形成同源二聚体fc结构域。
[0044]
在另一方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括本文所述的任何变体fc结构域单体、本文所述的任何缀合物、本文所述的任何融合蛋白，或任何fc结构域，以及药学上可接受的载体。
[0045]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的呼吸系统病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述呼吸系统病症是感染。在一些实施方案中，所述感染是病毒感染。在一些实施方案中，所述病毒感染选自包括以下的组：rsv、流行性感冒、登革热、β冠状病毒(例如，covid-19)以及寨卡(zika)病毒。在一些实施方案中，所述感染是细菌感染。在一些实施方案中，所述呼吸系统病症选自包括以下的组：慢性阻塞性肺病(copd)、慢性支气管炎、囊性纤维化、支气管扩张以及肺炎。
[0046]
在一些实施方案中，在施用后2小时内，上皮内衬液中的fc结构域单体、缀合物、融合蛋白或fc结构域的浓度占血浆中的fc结构域单体、缀合物、融合蛋白或fc结构域的浓度的比率为至少30％。在一些实施方案中，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少45％。在一些实施方案中，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少55％。在一些实施方案中，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少60％。在上文的特定实施方案中，施用途径是通过注射，例如，通过肌肉内、皮下、腹膜内或静脉内注射。在上文的特定实施方案中，施用途径是经口施用。
[0047]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的肝病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述肝病症是感染(例如，病毒感染，诸如甲型肝炎、乙型肝炎或丙型肝炎)、真菌感染或细菌感染。在一些实施方案中，所述肝病症选自包括以下的组：原发性胆汁性胆管炎、原发性硬化性胆管炎、肝细胞癌、胆管癌、肝细胞腺瘤、非酒精性脂肪性肝病(nafld)、急性肝衰竭以及肝硬化。
[0048]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的中枢神经系统(cns)病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述cns病症病症是感染。在一些实施方案中，所述感染是病毒感染、细菌感染或真菌感染。在一些实施方案中，所述病毒感染选自包括以下的组：单纯疱疹病毒(hsv)1、hsv 2、爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein-barr virus)、水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus)、脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、西尼罗河病毒(west nile virus)、拉克罗斯病毒(lacrosse virus)、西部马脑炎(western equine encephalitis)、东部马脑炎(eastern equine encephalitis)、波瓦桑病毒(powassan virus)或狂犬病病毒(rabies virus)。在一些实施方案中，cns病症选自包括以下的组：癌症、阿尔茨海默病、帕金森病、癫痫、多发性硬化症、精神分裂症以及脑膜炎。
[0049]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的肌肉病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述肌肉病症是肌炎或癌症。在一些实施方案中，所述肌炎由损伤、感染或免疫病症引起。
[0050]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的皮肤病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述皮肤病症是感染(例如，病毒感染(hsv 1、hsv 2或水痘-带状疱疹病毒)、真菌感染或细菌感染)。在一些实施方案中，所述皮肤病症选自包括以下的组：湿疹、牛皮癣、痤疮、红斑痤疮、感冒疮、蜂窝织炎、基底细胞癌、鳞状细胞癌以及黑色素瘤。
[0051]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的眼部病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述眼部病症是感染(例如，病毒感染(hsv 1或hsv 2)、真菌感染或细菌感染)。在一些实施方案中，所述眼部病症选自年龄相关性黄斑变性、白内障以及青光眼。
[0052]
在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的血管病症的方法，该方法包括向受试者施用本文所述的任何组合物。在一些实施方案中，所述血管病症是感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染)。
[0053]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:1的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:1的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0054]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:2的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:2的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0055]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:3的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0056]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:4的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0057]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:5的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0058]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:6的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:6的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0059]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:8的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:8的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0060]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:9的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0061]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:10的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0062]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:11的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0063]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:12的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0064]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:13的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0065]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:14的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0066]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:15的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0067]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:16的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:16的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0068]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:17的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0069]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结
构域单体包括与seq id no:18的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0070]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:19的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0071]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:20的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0072]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:21的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0073]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:22的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0074]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:23的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0075]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:24的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:24的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0076]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:25的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0077]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:26的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:26的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0078]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:27的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:27的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0079]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的
每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:28的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:28的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0080]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:29的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:29的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0081]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:30的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:30的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0082]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:31的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:31的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0083]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:32的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:32的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0084]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:33的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:33的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0085]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:34的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:34的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0086]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:35的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:35的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0087]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:36的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:36的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0088]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:37的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:37的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0089]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:38的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:38的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0090]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:39的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:39的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0091]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:40的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:40的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0092]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:41的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:41的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0093]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:42的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:42的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0094]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:43的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:43的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0095]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:44的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:44的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0096]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:45的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:45的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0097]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:46的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:46的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0098]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:47的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:47的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0099]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:48的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:48的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0100]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:49的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:49的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0101]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:50的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0102]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:51的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:51的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0103]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:52的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:52的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0104]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:56的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:56的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0105]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:57的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:57的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0106]
在本文所述的任何方面的一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，fc结构域的每一种变体fc结构域单体)包括seq id no:58的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与seq id no:58的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的氨基酸序列。
[0107]
定义
[0108]
为了有助于理解本发明，在下文中定义了大量术语。本文定义的术语具有如与本发明相关的领域的普通技术人员通常理解的含义。诸如“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”的术语不意图仅指代单个实体，而是包括可使用具体实例来说明的一般类别。本文的术语用于描述本发明的具体的实施方案，但它们的使用并不限制本发明，除非如在权利要求中概述。
[0109]
如本文所用，术语“变体fc结构域单体”是指至少包括铰链结构域和第二以及第三抗体恒定结构域(ch2和ch3)或其功能片段(例如，能够(i)与另一种变体fc结构域单体二聚化从而形成变体fc结构域，并且能够(ii)结合至fc受体的片段)的多肽链。在一些实施方案中，变体fc结构域单体至少包括下面的四重突变：c220s/m252y/s254t/t256e。在一些实施方案中，变体fc结构域单体至少包括四重突变c220s/v309d/q311h/n434s。在一些实施方案中，变体fc结构域单体具有包括c220s的突变。相对于对应的人野生型fc序列(例如，野生型人igg序列)，具有任何上述氨基酸取代的变体fc结构域单体可进一步包括一个或多个(一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个)另外的突变(例如，氨基酸缺失、添加和/或取代)。变体fc结构域单体可以是igg亚型(例如，igg1、igg2a或igg2b)(例如，igg1)。变体fc结构域单体不包括免疫球蛋白的能够充当抗原识别区的任何部分，例如，可变结构域或互补决定区(cdr)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括fab区的10至20个(例如，11、12、13、14、15、16、17、18或19个)氨基酸残基。在一些实施方案中，变体fc结构域单体(例如，igg重链，诸如igg1)包含从asn201或glu216(例如，asn201、val202、asn203、his204、lys205、pro206、ser207、asn208、thr209、lys210、val211、asp212、lys213、lys214、val215或glu216)中的任一者延伸至重链羧基末端(在例如gly446或lys447处)的区域。fc区的c末端lys447可存在或可不存在，而不影响fc区的结构或稳定性。本公开具体地设想了不包括与lys447相对应的c末端lys的seq id no:1至29和31至52中的任一个。变体fc结构域单体可被表达成包含c末端lys447，其然后可在多肽表达后被蛋白水解切割(例如，使用编码包含c末端赖氨酸残基的变体fc结构域单体的核酸构建体来表达变体fc结构域单体)。变体fc结构域单体还可被表达成不包含c末端lys447。n末端asn201可在多肽表达后被脱酰氨基化。变体fc结构域单体的n末端asn201可存在或可不存在。n末端asn201和/或c末端lys447的存在或不存在不影响变体fc结构域单体的结构或稳定性。本公开具体地设想了不包含n末端asn201残基的seq id no:1至29、31至52和56至58中的任一个。除非本文另外规定，否则变体fc结构域单体中的氨基酸残基的编号是根据用于抗体的eu编号系统，也称为kabat eu索引，如例如kabat等人，sequences of proteins of immunological interest,5th ed.public health service,national institutes of health,bethesda,md,1991中所述。
[0110]
如本文所用，术语“变体fc结构域”是指两种变体fc结构域单体(例如，能够结合fc受体的变体fc结构域单体)的二聚体。在野生型fc结构域中，两个fc结构域单体通过两个ch3抗体恒定结构域之间的相互作用而二聚化，在一些实施方案中，一个或多个二硫键在两个二聚化fc结构域单体的铰链结构域之间形成。
[0111]
如本文中可互换使用的术语“fab”或“抗原结合片段”是指抗体上与抗原结合的区域。fab是专门术语并且其含义是本领域的技术人员已知的。fab区由重链和轻链中的每一者的一个恒定结构域和一个可变结构域构成。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区可由三个结构域，即ch1、ch2和/或ch3组成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。vh区和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其中散布着更保守的区域，称为框架区(fr)。在抗体中，重链(例如，vh和ch区)通过铰链与fc结构域单体连接。本文所述的变体fc结构域单体可包括fab结构域和铰链区的10至20个残基(例如，11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基)。在某些实施方案中，变体fc结
构域单体的n末端是氨基酸残基198至205(与fab结构域的残基相对应)中的任一个。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基201(例如，asn201)。在某些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基202(例如，val202)。
[0112]
术语“共价附接”是指缀合物的两个部分通过在缀合物的两个部分中的两个原子之间形成的共价键彼此连接。
[0113]
如本文所用，“暴露于表面的氨基酸”或“暴露于溶剂的氨基酸”，诸如暴露于表面的半胱氨酸或暴露于表面的赖氨酸是指蛋白质周围的溶剂能够接近的氨基酸。暴露于表面的氨基酸可以是蛋白质的天然存的变体或工程改造的变体(例如，取代或插入)。在一些实施方案中，暴露于表面的氨基酸是在被取代时基本上不改变蛋白质的三维结构的氨基酸。
[0114]
如本文所用，术语“任选取代的”是指具有0个、1个或更多个取代基，诸如0至25个、0至20个、0至10个或0至5个取代基。取代基包括但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、烷芳基、酰基、杂芳基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂烷芳基、卤素、氧代基、氰基、硝基、氨基、烷氨基、羟基、烷氧基、烷酰基、羰基、氨基甲酰基、胍基、脲基、脒基、任何上述基团或部分，以及任何上述基团或部分的杂化形式(hetero version)。取代基包括但不限于f、cl、甲基、苯基、苄基、or、nr2、sr、sor、so2r、ocor、nrcor、nrconr2、nrcoor、oconr2、rco、coor、alkyl-oocr、so3r、conr2、so2nr2、nrso2nr2、cn、cf3、ocf3、sir3和no2，其中每个r独立地为h、烷基、烯基、芳基、杂烷基、杂烯基或杂芳基，并且其中相同或相邻原子上的两个任选取代基可以接合形成稠合的、任选取代的含有3至8个成员的芳族或非芳族、饱和或不饱和的环，或者相同原子上的两个任选取代基可以接合形成任选取代的含有3至8个成员的芳族或非芳族、饱和或不饱和的环。
[0115]
如本文所用的术语“氨基酸”意指天然存在的氨基酸和非天然存在的氨基酸。
[0116]
如本文所用的术语“天然存在的氨基酸”意指包括以下的氨基酸：ala、arg、asn、asp、cys、gln、glu、gly、his、ile、leu、lys、met、phe、pro、ser、thr、trp、tyr和val。
[0117]
如本文所用的术语“非天然存在的氨基酸”意指不天然产生或不存在于哺乳动物中的α氨基酸。非天然存在的氨基酸的实例包括d-氨基酸；具有与半胱氨酸(cysteine)的硫原子附接的乙酰氨基甲基的氨基酸；聚乙二醇化的氨基酸；式nh2(ch2)ncooh的ω氨基酸(其中n为2至6)；中性非极性氨基酸，诸如肌氨酸、叔丁基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、n-甲基异亮氨酸以及正亮氨酸；氧甲硫氨酸(oxymethionine)；苯甘氨酸；瓜氨酸；甲硫氨酸亚砜；半胱氨酸(cysteic acid)；鸟氨酸；二氨基丁酸；3-氨基丙氨酸；3-羟基-d-脯氨酸；2,4-二氨基丁酸；2-氨基戊酸；2-氨基辛酸，2-羧基哌嗪；哌嗪-2-羧酸，2-氨基-4-苯基丁酸；3-(2-萘基)丙氨酸以及羟脯氨酸。其他的氨基酸为：α-氨基丁酸、α-氨基-α-甲基丁酸酯(α-amino-α-methylbutyrate)、氨基环丙烷羧酸酯、氨基异丁酸、氨基降冰片基羧酸酯、l-环己基丙氨酸、环戊基丙氨酸、l-n-甲基亮氨酸、l-n-甲基甲硫氨酸、l-n-甲基正缬氨酸、l-n-甲基苯丙氨酸、l-n-甲基脯氨酸、l-n-甲基丝氨酸、l-n-甲基色氨酸、d-鸟氨酸、l-n-甲基乙基甘氨酸、l-正亮氨酸、α-甲基-氨基异丁酸酯、α-甲基环己基丙氨酸、d-α-甲基丙氨酸、d-α-甲基精氨酸、d-α-甲基天冬酰胺、d-α-甲基天冬氨酸酯、d-α-甲基半胱氨酸、d-α-甲基谷氨酰胺、d-α-甲基组氨酸、d-α-甲基异亮氨酸、d-α-甲基亮氨酸、d-α-甲基赖氨酸、d-α-甲基甲硫氨酸、d-α-甲基鸟氨酸、d-α-甲基苯丙氨酸、d-α-甲基脯氨酸、d-α-甲基丝氨酸、d-n-甲基丝氨酸、d-α-甲基苏氨酸、d-α-甲基色氨酸、d-α-甲基酪氨酸、d-α-甲基缬氨酸、d-n-甲基丙氨
酸、d-n-甲基精氨酸、d-n-甲基天冬酰胺、d-n-甲基天冬氨酸酯、d-n-甲基半胱氨酸、d-n-甲基谷氨酰胺、d-n-甲基谷氨酸酯、d-n-甲基组氨酸、d-n-甲基异亮氨酸、d-n-甲基亮氨酸、d-n-甲基赖氨酸、n-甲基环己基丙氨酸、d-n-甲基鸟氨酸、n-甲基甘氨酸、n-甲氨基异丁酸酯、n-(1-甲基丙基)甘氨酸、n-(2-甲基丙基)甘氨酸、d-n-甲基色氨酸、d-n-甲基酪氨酸、d-n-甲基缬氨酸、γ-氨基丁酸、l-叔丁基甘氨酸、l-乙基甘氨酸、l-高苯丙氨酸、l-α-甲基精氨酸、l-α-甲基天冬氨酸酯、l-α-甲基半胱氨酸、l-α-甲基谷氨酰胺、l-α-甲基组氨酸、l-α-甲基异亮氨酸、l-α-甲基亮氨酸、l-α-甲基甲硫氨酸、l-α-甲基正缬氨酸、l-α-甲基苯丙氨酸、l-α-甲基丝氨酸、l-α-甲基色氨酸、l-α-甲基缬氨酸、n-(n-(2,2-二苯乙基)氨甲酰甲基甘氨酸、1-羧基-1-(2,2-二苯-乙氨基)环丙烷、4-羟脯氨酸、鸟氨酸、2-氨基苯甲酰基(邻氨基苯甲酰基)、d-环己基丙氨酸、4-苯基-苯丙氨酸、l-瓜氨酸、α-环己基甘氨酸、l-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、l-噻唑烷-4-羧酸、l-高酪氨酸、l-2-呋喃基丙氨酸、l-组氨酸(3-甲基)、n-(3-胍基丙基)甘氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、o-聚糖-丝氨酸、间酪氨酸、正酪氨酸、l-n,n
′
,n
″‑
三甲基赖氨酸、高赖氨酸、正赖氨酸、n-聚糖天冬酰胺、7-羟基-1,2,3,4-四氢-4-氟苯丙氨酸、4-甲基苯丙氨酸、双-(2-吡啶甲基)胺、五氟苯丙氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、2-氨基苯甲酸、3-氨基-2-萘酸、不对称二甲基精氨酸、l-四氢异喹啉-1-羧酸、d-四氢异喹啉-1-羧酸、1-氨基-环己烷乙酸、d/l-烯丙基甘氨酸、4-氨基苯甲酸、1-氨基-环丁烷羧酸、2或3或4-氨基环己烷羧酸、1-氨基-1-环戊烷羧酸、1-氨基茚满-1-羧酸、4-氨基-吡咯烷-2-羧酸、2-氨基四氢萘-2-羧酸、氮杂环丁烷-3-羧酸、4-苄基-吡咯烷-2-羧酸、叔丁基甘氨酸、b-(苯并噻唑基-2-基)-丙氨酸、b-环丙基丙氨酸、5,5-二甲基-1,3-噻唑烷-4-羧酸、(2r,4s)4-羟基哌啶-2-羧酸、(2s,4s)和(2s,4r)-4-(2-萘基甲氧基)-吡咯烷-2-羧酸、(2s,4s)和(2s,4r)4-苯氧基-吡咯烷-2-羧酸、(2r,5s)和(2s,5r)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸、(2s,4s)-4-氨基-1-苯甲酰基-吡咯烷-2-羧酸、叔丁基丙氨酸、(2s,5r)-5-苯基-吡咯烷-2-羧酸、1-氨基甲基-环己烷-乙酸、3,5-双-(2-氨基)乙氧基-苯甲酸、3,5-二氨基-苯甲酸、2-甲氨基-苯甲酸、n-甲基邻氨基苯甲酸、l-n-甲基丙氨酸、l-n-甲基精氨酸、l-n-甲基天冬酰胺、l-n-甲基天冬氨酸、l-n-甲基半胱氨酸、l-n-甲基谷氨酰胺、l-n-甲基谷氨酸、l-n-甲基组氨酸、l-n-甲基异亮氨酸、l-n-甲基赖氨酸、l-n-甲基正亮氨酸、l-n-甲基鸟氨酸、l-n-甲基苏氨酸、l-n-甲基酪氨酸、l-n-甲基缬氨酸、l-n-甲基-叔丁基甘氨酸、l-正缬氨酸、α-甲基-γ-氨基丁酸酯、4,4
′‑
联苯丙氨酸、α-甲基环戊基丙氨酸、α-甲基-α-萘丙氨酸、α-甲基青霉胺、n-(4-氨基丁基)甘氨酸、n-(2-氨基乙基)甘氨酸、n-(3-氨基丙基)甘氨酸、n-氨基-α-甲基丁酸酯、α-萘丙氨酸、n-苄基甘氨酸、n-(2-氨甲酰乙基)甘氨酸、n-(氨甲酰甲基)甘氨酸、n-(2-羧乙基)甘氨酸、n-(羧甲基)甘氨酸、n-环丁基甘氨酸、n-环癸基甘氨酸、n-环庚基甘氨酸、n-环己基甘氨酸、n-环癸基甘氨酸、n-环十二烷基甘氨酸、n-环辛基甘氨酸、n-环丙基甘氨酸、n-环十一烷基甘氨酸、n-(2,2-二苯乙基)甘氨酸、n-(3,3-二苯丙基)甘氨酸、n-(3-胍基丙基)甘氨酸、n-(1-羟乙基)甘氨酸、n-(羟乙基))甘氨酸、n-(咪唑乙基))甘氨酸、n-(3-吲哚乙基)甘氨酸、n-甲基-γ-氨基丁酸酯、d-n-甲基甲硫氨酸、n-甲基环戊基丙氨酸、d-n-甲基苯丙氨酸、d-n-甲基脯氨酸、d-n-甲基苏氨酸、n-(1-甲基乙基)甘氨酸、n-甲基-萘基丙氨酸、n-甲基青霉胺、n-(p-羟基苯基)甘氨酸、n-(硫甲基)甘氨酸、青霉胺、l-α-甲基丙氨酸、l-α-甲基天冬酰胺、l-α-甲基-叔丁基甘氨酸、l-甲基乙基甘氨酸、l-α-甲基谷氨酸酯、l-α-甲基高苯丙氨酸、n-(2-甲硫乙基)甘氨酸、l-α-甲基赖氨酸、l-α-甲基正亮氨酸、l-α-甲基鸟氨
酸、l-α-甲基脯氨酸、l-α-甲基苏氨酸、l-α-甲基酪氨酸、l-n-甲基-高苯丙氨酸、n-(n-(3,3-二苯丙基)氨甲酰甲基甘氨酸、l-焦谷氨酸、d-焦谷氨酸、o-甲基-l-丝氨酸、o-甲基-l-高丝氨酸、5-羟赖氨酸、α-羧基谷氨酸酯、苯基甘氨酸、l-哌啶酸(高脯氨酸)、l-高亮氨酸、l-赖氨酸(二甲基)、l-2-萘基丙氨酸、l-二甲基多巴(l-dimethyldopa)或l-二甲氧基-苯丙氨酸、l-3-吡啶基丙氨酸、l-组氨酸(苯甲酰基氧甲基)、n-环庚基甘氨酸、l-二苯丙氨酸、o-甲基-l-高酪氨酸、l-β-高赖氨酸、o-聚糖-苏氨酸、邻酪氨酸、l-n,n
′‑
二甲基赖氨酸、l-高精氨酸、新色氨酸、3-苯并噻吩基丙氨酸、异喹啉-3-羧酸、二氨基丙酸、高半胱氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、l-1,2,3,4-四氢去甲哈尔曼(tetrahydronorharman)-3-羧酸、金刚烷基丙氨酸、对称二甲基精氨酸、3-羧基硫代吗啉、d-1,2,3,4-四氢去甲哈尔曼-3-羧酸、3-氨基苯甲酸、3-氨基-1-羧甲基-吡啶-2-酮、1-氨基-1-环己烷羧酸、2-氨基环戊烷羧酸、1-氨基-1-环丙烷羧酸、2-氨基茚满-2-羧酸、4-氨基-四氢噻喃-4-羧酸、氮杂环丁烷-2-羧酸、b-(苯并噻唑基-2-基)-丙氨酸、新戊基甘氨酸、2-羧甲基哌啶、b-环丁基丙氨酸、烯丙基甘氨酸、二氨基丙酸、高环己基丙氨酸、(2s,4r)-4-羟基哌啶-2-羧酸、八氢吲哚-2-羧酸、(2s,4r)和(2s,4r)-4-(2-萘基)、吡咯烷-2-羧酸、哌啶甲酸(nipecotic acid)、(2s,4r)和(2s,4s)-4-(4-苯基苄基)吡咯烷-2-羧酸、(3s)-1-吡咯烷-3-羧酸、(2s,4s)-4-三苯甲基巯基-吡咯烷-2-羧酸、(2s,4s)-4-巯基脯氨酸、叔丁酸甘氨酸、n,n-双(3-氨丙基)甘氨酸、1-氨基-环己烷-1-羧酸、n-巯基乙基甘氨酸以及硒代半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基可以是带电的或极性的。带电氨基酸包括丙氨酸、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸或其非天然存在的类似物。极性氨基酸包括谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸或色氨酸或其非天然存在的类似物。具体地设想了在一些实施方案中，氨基酸中的末端氨基可以是酰胺基或氨基甲酸酯基。
[0118]
如本文所用的术语“接头”、“l”等是指融合蛋白或缀合物中的两种或更多种组分之间(例如，在治疗性肽剂和变体fc结构域单体之间以形成融合蛋白、在两种治疗剂之间、在治疗剂和融合蛋白之间、在一种或多种治疗剂和融合蛋白之间，以及在一种或多种治疗剂和变体fc结构域单体之间)的共价连键或连接。在一些实施方案中，接头是二价接头，例如连接治疗性肽剂和变体fc结构域单体的接头、将治疗剂连接至融合蛋白的接头，或将治疗剂连接至变体fc结构域的接头。在一些实施方案中，本文所述的缀合物可含有具有三价结构的接头(例如，三价接头)。三价接头具有三个臂，其中每个臂与缀合物的组分共价连接(例如，第一臂与第一治疗剂缀合，第二臂与治疗剂缀合，并且第三臂与融合蛋白或变体fc结构域单体缀合)。接头可以是本领域的技术人员已知的化学接头，并且在本文中有详细描述。化学接头可被用来将两个小分子接合起来(例如，以形成二聚体)，用来将小分子单体或小分子二聚体与多肽接合起来，或用来将两个多肽接合起来以形成融合蛋白。接头可替代地是肽接头。肽接头也可被用来将两个小分子接合起来，用来将小分子单体或小分子二聚体与多肽接合起来，或用来与多肽接合以形成融合蛋白。
[0119]
可用作接头的分子包括至少两个可相同或不同的官能团，例如，两个羧酸基团、两个胺基团、两个磺酸基团、羧酸基团和马来酰亚胺基团、羧酸基团和炔烃基团、羧酸基团和胺基团，羧酸基团和磺酸基团，胺基团和马来酰亚胺基团，胺基团和炔烃基团，或胺基团和磺酸基团。在二价接头中，第一官能团可与第一组分形成共价连键并且第二官能团可与第二组分形成共价连键。在一些实施方案中，在接头是三价接头的情况下，接头的两个臂可含
有两个二元羧酸，其中第一羧酸可与缀合物中的第一治疗剂形成共价连键并且第二羧酸可与缀合物中的第二治疗剂形成共价连键，并且接头的第三臂可与缀合物中的变体fc结构域单体或融合蛋白形成共价连键。本文进一步描述了二元羧酸的实例。在一些实施方案中，含有一个或多个马来酰亚胺基团的分子可用作接头，其中马来酰亚胺基团可与缀合物中的组分中的半胱氨酸形成碳-硫连键。在一些实施方案中，含有一个或多个炔烃基团的分子可用作接头，其中炔烃基团可与缀合物中的组分中的叠氮基团形成1,2,3-三唑连键。在一些实施方案中，含有一个或多个叠氮基团的分子可用作接头，其中叠氮基团可与缀合物中的组分中的炔烃形成1,2,3-三唑连键。在一些实施方案中，含有一个或多个双砜基团的分子可用作接头，其中双砜基团可与缀合物中的组分中的胺基团形成连键。在一些实施方案中，含有一个或多个磺酸基团的分子可用作接头，其中磺酸基团可与缀合物中的组分形成磺酰胺连键。在一些实施方案中，含有一个或多个异氰酸酯基团的分子可用作接头，其中异氰酸酯基团可与缀合物中的组分形成脲连键。在一些实施方案中，含有一个或多个卤代烷基的分子可用作接头，其中卤代烷基可与缀合物中的组分形成共价连键，例如c-n连键和c-o连键。
[0120]
在一些实施方案中，接头提供两种或更多种组分之间的空间、刚性和/或柔性。在一些实施方案中，接头可以是键，例如共价键。术语“键”是指化学键，例如酰胺键、二硫键、c-o键、c-n键、n-n键、c-s键或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。在一些实施方案中，接头包括不超过250个原子。在一些实施方案中，接头包括不超过250个非氢原子。在一些实施方案中，接头的骨架包括不超过250个原子。接头的“骨架”是指接头中的一起形成从缀合物的一部分到缀合物的另一部分的最短路径的原子。接头骨架中的原子直接参与将缀合物的一部分连接至缀合物的另一部分。例如，附接至接头骨架中的碳的氢原子不被视为直接参与将缀合物的一部分连接至缀合物的另一部分。
[0121]
在一些实施方案中，接头可包括衍生自例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(peg)聚合物)的合成基团。在一些实施方案中，接头可包括一个或多个氨基酸残基，诸如d-或l-氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列(例如，1至25个氨基酸、1至10个氨基酸、1至9个氨基酸、1至8个氨基酸、1至7个氨基酸、1至6个氨基酸、1至5个氨基酸、1至4个氨基酸、1至3个氨基酸、1至2个氨基酸或1个氨基酸的序列)的残基。在一些实施方案中，接头可包括一个或多个(例如，1至100个、1至50个、1至25个、1至10个、1至5个或1至3个)任选取代的亚烷基，任选取代的亚杂烷基(例如，peg单元)、任选取代的亚烯基、任选取代的亚杂烯基、任选取代的亚炔基、任选取代的亚杂炔基、任选取代的亚环烷基、任选取代的亚杂环烷基、任选取代的亚环烯基、任选取代的亚杂环烯基、任选取代的亚环炔基、任选取代的亚杂环炔基、任选取代的亚芳基，任选取代的亚杂芳基(例如，吡啶)、o、s、nri(ri为h、任选取代的烷基、任选取代的杂烷基、任选取代的烯基、任选取代的杂烯基、任选取代的炔基、任选取代的杂炔基、任选取代的环烷基、任选取代的杂环烷基、任选取代的环烯基、任选取代的杂环烯基、任选取代的环炔基、任选取代的杂环炔基、任选取代的芳基，或任选取代的杂芳基)、p、羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。例如，接头可包括一个或多个任选取代的c1至c20亚烷基、任选取代的c1至c20亚杂烷基(例如，peg单元)、任选取代的c2至c20亚烯基(例如，c2亚烯基)、任选取代的c2至c20亚杂烯基、任选取代的c2至c20亚炔基、任选取代的c2-c20亚杂炔基、任选取代的c3至c
20
亚环烷基(例如，亚环丙基、亚环丁基)、任选取代的c2至c
20
亚杂环烷基、任选取代的c4至c20亚环烯基、任选取代的c4至c20亚杂环烯基、任
选取代的c8至c20亚环炔基、任选取代的c8至c20亚杂环炔基、任选取代的c5至c15亚芳基(例如，c6亚芳基)、任选取代的c3至c
15
亚杂芳基(例如，咪唑、吡啶)、o、s、nri(ri为h、任选取代的c1至c20烷基、任选取代的c1至c20杂烷基、任选取代的c2至c20烯基、任选取代的c2至c20杂烯基、任选取代的c2至c20炔基、任选取代的c2至c20杂炔基、任选取代的c3至c
20
环烷基、任选取代的c2至c
20
杂环烷基、任选取代的c4至c20环烯基、任选取代的c4至c20杂环烯基、任选取代的c8至c20环炔基、任选取代的c8至c20杂环炔基、任选取代的c5至c15芳基或任选取代的c3至c
15
杂芳基)、p、羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。
[0122]
如本文所用，术语“化学接头”包括本文所述的不包含多肽的任何接头。例如，化学接头可包括任选地包含一个或多个杂原子的烃链(例如，任选地取代的亚烷基、亚杂烷基、亚烯基、亚杂烯基、亚炔基或亚杂炔基)。化学接头可包括在接头主链内的一个或多个环烷基、杂环炔基、芳基或杂芳基环。化学接头可包括聚乙二醇(peg)聚合物，例如peg2至peg
50
，最优选地peg2、peg3、peg4、peg5、peg6、peg7、peg8、peg9或peg
10
。化学接头可以是键。如本文更详细地描述(参见，例如，缀合化学)，化学接头可包括至少两个可相同或不同的官能团，例如，两个羧酸基团、两个胺基团、两个磺酸基团、羧酸基团和马来酰亚胺基团、羧酸基团和炔烃基团、羧酸基团和胺基团，羧酸基团和磺酸基团，胺基团和马来酰亚胺基团，胺基团和炔烃基团，或胺基团和磺酸基团。在二价接头中，例如，第一官能团可与第一组分形成共价连键并且第二官能团可与第二组分形成共价连键。
[0123]
如本文可互换使用的，术语“肽接头”或“多肽接头”包括任何包含两个或更多个氨基酸残基的接头。例如，肽接头可包括2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、40个或更多个或50个或更多个氨基酸残基，该氨基酸残基是例如通过肽键接合的。肽接头的羧基末端可与第一部分(例如，变体fc结构域单体或治疗性肽剂)共价缀合(例如，通过肽键共价缀合)并且肽接头的氨基末端可与第二部分(例如，变体fc结构域单体或治疗性肽剂)共价缀合(例如，通过肽键共价缀合)，从而使第一部分和第二部分缀合并且允许第一部分和第二部分之间具有空间和/或柔性。肽接头可由多核苷酸构建体表达或化学合成，并且随后与第一部分和第二部分化学缀合。可替代地，肽接头可与第一多肽(例如，变体fc结构域单体或治疗性肽剂)和第二多肽(例如，变体fc结构域单体或治疗性肽剂)串联地表达，从而将第一多肽和第二多肽接合从而形成融合蛋白。
[0124]
如本文所用，术语“同一性百分比(％)”是指在比对候选序列(例如，fc-igg或其片段)和参考序列并引入空位(如果必要的话)以实现最大同一性百分比(即，可以在候选序列和参考序列中的一者或两者中引入空位以进行最佳比对，并且为了比较的目的，可以忽略非同源序列)之后，候选序列中与参考序列的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。用于确定同一性百分比的目的比对可以以本领域技术范围内的各种方式，例如，使用可公开获得的计算机软件，诸如blast、align或megalign(dnastar)软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。在一些实施方案中，给定候选序列与、同或相对于给定参考序列的氨基酸序列同一性百分比(其可替代地被表述为给定候选序列具有或包括的与、同或相对于给定参考序列的某种氨基酸同一性百分比)如下计算：
[0125]
100x(a/b的分数)
[0126]
其中a是在候选序列和参考序列的比对中被评分为同一的氨基酸残基数目，并且其中b是参考序列中氨基酸残基的总数目。在候选序列的长度与参考序列的长度不相等的一些实施方案中，候选序列与参考序列的氨基酸序列同一性百分比将不等于参考序列与候选序列的氨基酸序列同一性百分比。
[0127]
如果当如上所述的那样比对以实现最大对应时，两个多核苷酸或多肽序列中的核苷酸或氨基酸的序列是相同的，则两个序列被说成是“同一的”。两个序列之间的比较通常通过在比较窗上比较该序列来进行，以鉴定和比较具有序列相似性的局部区域。如本文所用的“比较窗”是指至少约15个邻接位置、约20个邻接位置、约25个邻接位置或更多邻接位置(例如，约30个至约75个邻接位置，或约40个至约50个邻接位置)的区段，其中可在将某一序列与具有相同数量的邻接位置的参考序列最佳比对之后对这两个序列进行比较。
[0128]
如本文所用，术语“融合蛋白”是指包括共价连接的两种或更多种肽、多肽或蛋白质的任何缀合物。所述两种或更多种肽、多肽或蛋白质可通过接头(例如，本文所述的任何接头，包括化学接头、肽接头或键)共价缀合。例如，融合蛋白可包括一种或多种治疗性肽剂和一种或多种变体fc结构域单体。所述一种或多种治疗性肽剂和一种或多种变体fc结构域单体可由同一个多核苷酸序列(例如，可操作地连接的单一连续多核苷酸序列)编码并表达为单一多肽构建体。替代地，所述一种或多种治疗性肽剂和一种或多种变体fc结构域单体可由分开的多核苷酸(例如，不连续的并且可以在同一个载体或分开的载体上的多核苷酸序列)编码，表达为分开的多肽构建体，并且随后通过本文所述的任何接头和/或缀合化学物共价缀合。在一些情况下，融合蛋白的变体fc结构域单体可经由接头(例如，本文所述的任何接头)与一种或多种(例如，1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种)小分子治疗剂缀合。
[0129]
如本文所用，术语“药物组合物”是指含有至少一种活性成分(例如，式(1)的缀合物或本文所述的融合蛋白)以及一种或多种用于使活性成分适合于施用方法的赋形剂和稀释剂的药用或药物制剂。本公开的药物组合物包括与本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)或融合蛋白相容的药学上可接受的组分。
[0130]
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”是指药物组合物中的赋形剂或稀释剂。例如，药学上可接受的载体可以是能够悬浮或溶解本文所述的活性缀合物(例如，式(1)的缀合物)或融合蛋白的媒介物。药学上可接受的载体必须与制剂的其他成分相容并且对接受者无害。在本公开中，药学上可接受的载体必须为本文所述的缀合物或融合蛋白提供足够的药物稳定性。载体的性质因施用方式而异。例如，对于经口施用，优选固体载体；对于静脉内施用，一般使用水溶液载体(例如，wfi和/或缓冲溶液)。
[0131]
如本文所用的术语“药学上可接受的盐”表示本文所述缀合物(例如式(1)的缀合物)的盐，其在合理的医学判断范围内、适用于本文所述的方法，而没有不适当的毒性、刺激和/或过敏反应。药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，药学上可接受的盐在pharmaceutical salts:properties,selection,and use(eds.p.h.stahl and c.g.wermuth),wiley-vch,2008中有所描述。所述盐可以在本文所述缀合物的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱基团与合适的有机酸反应而单独制备。
[0132]
术语“药物抗体比”或“dar”是指与本文所述的变体fc结构域单体或变体fc结构域
asaccharolytica)、二路普雷沃氏菌(prevotella bivia)、奇异变形杆菌(proteus mirabilis)、普通变形杆菌(proteus vulgaris)、雷氏普罗威登斯菌(providencia rettgeri)、斯氏普罗威登斯菌(providencia stuartii)、铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、粘质沙雷菌(serratia marcescens)、咽峡炎链球菌(streptococcus anginosus)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(对甲氧西林(methicillin)敏感和耐药的分离物)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)(对甲氧西林敏感的和耐药的分离物)、嗜麦芽窄食单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)、无乳链球菌(streptococcus agalactiae)、星座链球菌(streptococcus constellatus)、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)(对青霉素(penicillin)敏感和耐药的分离物)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes))在宿主生物体(例如，人受试者)中的病原性生长。细菌感染可以是一种或多种细菌群体的存在对宿主身体造成损害的任何情况。因此，当受试者的体内或体表上存在过量的一种或多种细菌群体时，或当一种或多种细菌群体的存在对受试者的细胞或其他组织造成损害时，受试者正“患有”细菌感染。
[0137]“真菌感染”意指真菌(例如，毛癣菌属物种(trichophyton species)(例如，阿耶洛毛癣菌(t.ajelloi)、同心圆毛癣菌(t.concentricum)、马毛癣菌(t.equinum)、意瑞奈斯毛癣菌(t.erinacei)、淡黄毛癣菌(t.flavescens)、光辉毛癣菌(t.gloriae)、趾间毛癣菌(t.interdigitale)、麦格尼毛癣菌(t.megnini)、下颔毛癣菌(t.mentagrophytes)、豆形毛癣菌(t.phaseoliforme)、红色毛癣菌(t.rubrum)、许兰毛癣菌(t.schoenleini)、猴毛癣菌(t.simii)、苏丹奈斯毛癣菌(t.soudanense)、土毛癣菌(t.terrestre)、断发毛癣菌(t.tonsurans)、范布鲁西米氏毛癣菌(t.vanbreuseghemii)、疣状毛癣菌(t.verrucosum)、紫色毛癣菌(t.violaceum)或赤非毛癣菌(t.yaoundei))、表皮癣菌属物种(epidermophyton species)(例如，絮状表皮癣菌(e.floccosum)或斯托克表皮癣菌(e.stockdaleae))、念珠菌属物种(candida species)(例如，白色念珠菌(c.albicans)、近平滑念珠菌(c.parapsiliosis)、克鲁斯念珠菌(c.krusei)、热带念珠菌(c.tropicalis)、光滑念珠菌(c.glabrata)、近平滑念珠菌(c.parapsilos is)、葡萄牙念珠菌(c.lusitaniae)、乳酒念珠菌(c.kefyr)、高里念珠菌(c.guilliermondii)或都柏林念珠菌(c.dubliniensis))、小孢子菌属物种(microsporum species)(例如，犬小孢子菌(m.canis)、石膏样小孢子菌(m.gypseum)、奥杜盎小孢子菌(m.audouini)、鸡小孢子菌(m.gallinae)、铁锈色小孢子菌(m.ferrugineum)、扭曲小孢子菌(m.distortum)、矮小小孢子菌(m.nanum)、库克小孢子菌(m.cookie)或范布瑞西米小孢子菌(m.vanbreuseghemii))、附球菌属物种(epicoccum species)(例如，黑附球菌(e.nigrum))、曲霉属物种(aspergillus species)(例如，聚多曲霉(a.sydowii)、土曲霉(a.terreus)、黑曲霉(a.niger)、土曲霉(a.terreus)、烟曲霉(a.fumigatus)、黄曲霉(a.flavus)、棒曲霉(a.clavatus)、灰带蓝曲霉群(a.glaucus group)、构巢曲霉(a.nidulans)、米曲霉(a.oryzae)、土曲霉(a.terreus)、焦曲霉(a.ustus)或杂色曲霉(a.versicolor))、拟青霉属物种(paecilomyces species)(例如，淡紫拟青霉(p.lilacinus)或宛氏拟青霉(p.variotii))、镰刀菌属物种(fusarium species)(例如，尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、腐皮镰刀菌(f.solani)或半裸镰刀菌(f.semitectum))、顶孢霉属物种(acremonium species)(例如，枝顶孢霉(a.strictum)、a.roseogiseum、瓜顶孢霉(a.cucurbitacearum)、
基利顶孢霉(a.kiliense)、弯曲顶孢霉(a.curvatum)、a.comptosporum、纸细基孢菌(ulocladium chartarum)、芳香顶孢霉(a.alternatum)或小翅孢壳(emercellopsis minima))、毛壳菌属物种(chaetomium species)(例如，c.atrobrunneum、粪生毛壳菌(c.funicola)、球毛壳菌(c.globosum)或瘤突毛壳菌(c.strumarium))、茎点霉属物种(phoma species)、帚霉属物种(scopulariopsis species)(例如，短柄帚霉(s.brevicaulis)、念珠帚霉(s.candida)、康氏帚霉(s.koningii)、顶孢帚霉(s.acremonium)、黄帚霉(s.flava)、灰质帚霉(s.cinerea)、s.trigonospora、布朗氏帚霉(s.brumptii)、s.chartarum、暗色帚霉(s.fusca)或s.asperula)、链格孢属物种(alternaria species)(例如，互隔链格孢(a.alternate)、纸链格孢(a.chartarum)、石竹链格孢(a.dianthicola)、a.geophilia、感染链格孢(a.infectoria)、匍柄链格孢(a.stemphyloides)或极细链格孢(a.teunissima))以及弯孢霉属物种(curvularia species)(例如，短孢弯孢霉(c.brachyspora)、棒状弯孢霉(c.clavata)、膝弯孢霉(c.geniculata)、新月弯孢霉(c.lunata)、苍白弯孢霉(c.pallescens)、塞内加尔弯孢霉(c.senegalensis)或疣状弯孢霉(c.verruculosa)))在宿主生物体(例如，人受试者)中的病原性生长。真菌感染可以是一种或多种真菌群体的存在对宿主身体造成损害的任何情况。因此，当受试者的体内或体表上存在过量的一种或多种真菌群体时，或当一种或多种真菌群体的存在对受试者的细胞或其他组织造成损害时，受试者正“患有”真菌感染。
[0138]
如本文所用的术语“治疗(treating)”或“治疗(to treat)”是指对受试者的病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症或感染)的治疗性治疗。在一些实施方案中，治疗性治疗可减缓病症的进展、改善受试者的结果和/或消除病症。在一些实施方案中，与在治疗性治疗不存在的情况下受试者的病症的状态和/或病状相比，对该受试者的病症的治疗性治疗可缓解或减轻与病症相关的一种或多种症状或病状，减弱病症的程度，稳定(即，不恶化)病症的状态，防止病症的扩散,以及/或者延迟或减缓病症的进展。
[0139]
如本文所用，“组合疗法”或“组合施用”意指将两种或更多种活性剂作为明确的治疗方案的一部分施用给受试者。治疗方案限定了每种剂的施用剂量和施用周期，使得分开的剂对受试者的作用重叠。在一些实施方案中，缀合物和一种或多种剂的递送是同时或并行的，并且缀合物和一种或多种剂可被共同配制。在一些实施方案中，缀合物和一种或多种剂不是共同配制的，并且作为处方方案的一部分以顺序方式施用。在一些实施方案中，缀合物和一种或多种剂或治疗的组合施用使得与病毒感染相关的症状或其他参数的减少大于在仅递送一种剂或治疗的情况下或在不存在另一种剂或治疗的情况下观察到的。缀合物和一种或多种剂的作用可部分累加、完全累加或大于累加(例如，协同作用)。每种治疗剂的顺序施用或实质上同时施用可通过任何适当的途径进行，所述途径包括但不限于经口途径、静脉内途径、肌肉内途径以及通过粘膜直接吸收。可通过相同途径或通过不同途径施用治疗剂。例如，本文所述的缀合物或融合蛋白可通过静脉内注射施用，而组合中的第二治疗剂可通过另一种途径施用，例如经口施用。
[0140]
如本文所用的术语“受试者”可以是人、非人灵长类动物或其他哺乳动物，诸如但不限于狗、猫、马、牛、猪、火鸡、山羊、鱼、猴、鸡、大鼠、小鼠和羊。
[0141]
如本文所用的术语“治疗有效量”是指有效地引起受试者的期望效果或者有效地
治疗患有本文所述的病状或病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、肌肉病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症或感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染))的受试者的量(例如，药物剂量)。在本文中还应当理解，“治疗有效量”可被解释为给予期望的治疗性和/或预防性作用、以一次或多次剂量或以任何剂量或途径服用，和/或单独服用或与其他治疗剂(例如，本文所述的抗病毒剂)组合服用的量。例如，在施用用于治疗感染的药物组合物(例如，本文所述的式(1)的缀合物或融合蛋白)的背景下，缀合物或融合蛋白的有效量是例如与在未施用缀合物或融合蛋白的情况下获得的响应相比，足以防止、减缓或逆转感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染)进展的量。
[0142]
如本文所用，术语“小分子”是指可调节生物过程的低分子量化合物(例如，小于900da的化合物(例如，有机化合物))，其尺寸在1nm量级。在一些情况下，治疗剂是小分子治疗剂。在一些情况下，小分子剂介于约300和约700da之间(例如，约325da、约350da、约375da、约400da、约425da、约450da、约475da、约500da、约525da、约550da、约575da、约600da、约625da、约650da或约675da)。
[0143]
如本文所用的术语“约”表示至多
±
5％的偏差。例如，约10％是指9.5％至10.5％。
[0144]
在值范围内提供的任何值包括上限和下限，以及包含在上限和下限内的任何值。
[0145]
本文所述的缀合物的其他特征和优点通过以下具体实施方式和权利要求书将显而易见。
附图说明
[0146]
图1是示出了在非人灵长类动物pk研究中对包括与具有c220s/m252y/s254t/t256e四重突变的变体fc结构域单体(seq id no:10)(2mpk iv)缀合的小分子的缀合物的血浆水平与包括与具有c220s突变的fc结构域(seq id no:21)(2mpk iv)缀合的同一小分子的缀合物的血浆水平进行的比较的图。该研究如实施例4中所述的那样来进行。
[0147]
图2是示出了对小鼠中与具有c220s突变的变体fc结构域单体(seq id no:21)缀合的小分子的血浆浓度水平与相同缀合物的上皮内衬液(elf)水平进行的比较的图。该研究如实施例5中所述的那样来进行。
[0148]
图3是示出了在小鼠pk研究中对包括与具有c220s/m252y/s254t/t256e四重突变的fc结构域单体(seq id no:10)缀合的小分子的缀合物的血浆水平与包括与具有c220s突变的fc结构域(seq id no:21)缀合的同一小分子的缀合物的血浆水平进行的比较的图。该研究如实施例6中所述的那样来进行。
[0149]
图4是示出了小鼠pk研究中的fc结构域单体(seq id no:53至55)的血浆浓度水平的图。该图示出了fc结构域血浆水平随着分子量的增加而增加(seq id no:53》seq id no:55》seq id no:54)。该研究如实施例7中所述的那样来进行。
[0150]
图5是示出了小鼠pk研究中的fc结构域单体(seq id no:53、56和58)的平均fc血浆水平的图。该研究如实施例7中所述的那样来进行。
具体实施方式
[0151]
本公开提供了fc结构域单体、包括fc结构域单体的缀合物和包括fc结构域单体的融合蛋白，其中fc结构域单体是亲本fc多肽(例如，igg1或igg2多肽)的突变变体。fc结构域
单体可包括有助于增加半衰期和/或功效的一种或多种突变。所述一种或多种突变还可使制造期间的聚集最小化，从而增加产量并降低成本。fc结构域单体还可针对尺寸(例如，如通过kda或氨基酸残基测量)进行优化，以便使组织分布到组织或感兴趣的部位最大化和/或使肾清除最小化。
[0152]
特别地，本发明的特征在于包括位于位置220处的氨基酸突变(例如，c220s)的变体fc结构域单体。本发明的特征在于包括位于位置220、252、254和/或256处的氨基酸突变(例如，c220s/m252y/s254t/t256e突变)的变体fc结构域单体。本发明还包括包括位于位置220、309、311和/或434处的氨基酸突变(例如，c220s/v309d/q311h/n434s突变)的变体fc结构域单体。本发明还包括包含一种或多种与一种或多种治疗剂缀合的变体fc结构域单体的缀合物。本发明的特征进一步在于包括至少一种治疗性肽剂和至少一种变体fc结构域单体或其缀合物的融合蛋白。变体fc结构域单体(例如，两种缀合物或两种融合蛋白中的每一者的变体fc结构域单体)可二聚化从而形成变体fc结构域。
[0153]
在一些情况下，变体fc结构域单体与免疫细胞(例如，中性粒细胞)上的fcγr(例如，fcrn、fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)结合，从而激活吞噬作用和效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，因此导致感染因子(例如，病毒、真菌或细菌)被吞噬和破坏。在其他情况下，变体fc结构域单体进一步包括减少或消融与免疫细胞(例如，中性粒细胞)上的fcγr(例如，fcrn、fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)的结合的突变，并且特别可用于递送治疗剂(例如，小分子治疗剂和治疗性肽剂)。
[0154]
变体fc结构域单体及其缀合物和融合蛋白表现出期望的组织分布。因此，此类组合物可用于治疗病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症)、抑制感染生长的方法，以及治疗感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染)的方法。
[0155]
i.变体fc结构域单体和变体fc结构域
[0156]
变体fc结构域单体包括铰链结构域、ch2抗体恒定结构域和ch3抗体恒定结构域。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括四重突变c220s/m252y/s254t/t256e。在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括四重突变c220s/v309d/q311h/n434s。在另一个实施方案中，变体fc结构域单体包括c220s突变。氨基酸取代是相对于野生型fc单体氨基酸序列，例如野生型人igg1或igg2而言的。
[0157]
变体fc结构域单体可以是免疫球蛋白抗体同种型igg。变体fc结构域单体也可以是任何免疫球蛋白抗体同种型(例如，igg1、igg2a或igg2b)。变体fc结构域单体可以是任何免疫球蛋白抗体同种异型(例如，ighg1*01(即，g1m(za))、ighg1*07(即，g1m(zax))、ig hg1*04(即，g1m(zav))、ighg1*03(g1m(f))、ighg1*08(即，g1m(fa))、ighg2*01、ighg2*06或ighg2*02)(如例如vidarsson等人i gg subclasses and allotypes:from structure to effector functionfrontiers in immunology.5(520):1-17(2014)中所述)。变体fc结构域单体也可以是任何物种，例如人、鼠科动物或小鼠的。变体fc结构域单体的二聚体是可以结合至fc受体的变体fc结构域，该fc受体是位于白细胞表面的受体。
[0158]
在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括相对于具有seq id no:1至29、31至52或56至58中的任一个的序列的变体fc结构域单体的一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺
失。在一些实施方案中，如本文所述的缀合物中的变体fc结构域单体中的asn297可被ala替代，以防止n连接糖基化(参见，例如seq id no:4，其中asn297至ala的取代被标记为(*))。
[0159]
在一些实施方案中，本发明的变体fc结构域单体或变体fc结构域是非糖基化的fc结构域单体或fc结构域(例如，保持与fc受体(例如，fcrn)的接合的fc结构域单体或fc结构域)。例如，fc结构域是保持与fc受体的接合的非糖基化igg1变体(例如，在糖基化基序的n297和/或t299处具有氨基酸取代的igg1)。示例性的非糖基化fc结构域和用于制备非糖基化fc结构域的方法是本领域已知的，例如，如sazinsky s.l.等人，aglycosylated immunoglobulin g1 varia nts productively engage activating fc receptors,pnas,2008,105(51):20167-20172中所述，所述文献整体并入本文。
[0160]
fc区的c末端lys447可存在或可不存在，而不影响fc区的结构或稳定性。本公开具体地设想了不包括与lys447相对应的c末端lys的seq id no:1至29和31至52中的任一个。变体fc结构域单体的n末端asn可存在或可不存在，而不影响变体fc结构域单体的结构或稳定性。本公开具体地设想了不包括n末端asn残基的seq id no:1至29、31至52和56至58中的任一个。
[0161]
在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括与变体fc结构域单体的n或c末端附接的另外的部分，例如纯化肽(例如，六组氨酸肽(hhhhhh(seq id no:59)))或信号序列(例如，il2信号序列myrmqllscialslalvtns(seq id no:60))。在一些实施方案中，缀合物中的变体fc结构域单体不含有任何类型的抗体可变区，例如vh、v
l
、互补决定区(cdr)或高变区(hvr)。
[0162]
在一些实施方案中，变体fc结构域单体具有与下文所示的seq id no:1至29、31至52和56至58中的任一个的序列至少95％同一(例如，97％、99％或99.5％同一)的序列。在一些实施方案中，变体fc结构域单体具有如下所示的seq id no:1至29、31至52和56至58中的任一个的序列。
[0163]
seq id no:1：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，x1为asp或glu，并且x2为leu或met，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0164][0165]
seq id no:2：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0166][0167]
seq id no:3：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0168][0169]
seq id no:4：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，asn至ala的取代(*)，x1为asp或glu，并且x2为leu或met，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0170]
seq id no:5：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0171]
seq id no:6：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0172]
seq id no:7：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，x6为asp或glu，并且x7为leu或met，z1为asn或不存在，z2为asn或ala，z3为lys或不存在，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0173][0174]
seq id no:8：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0175][0176]
seq id no:9：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0177][0178][0179]
seq id no:10：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0180][0181]
seq id no:11：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0182][0183]
seq id no:12：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0184][0185][0186]
seq id no:13：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0187][0188]
seq id no:14：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0189]
seq id no:15：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0190][0191]
seq id no:16：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0192]
seq id no:17：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0193]
seq id no:18：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0194][0195]
seq id no:19：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，yte三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，asn至ala的取代(*)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
为lys或不存在，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0202]
seq id no:24：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，x6为asp或glu，x7为leu或met，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0203][0204]
seq id no:25：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，x4为asp或glu，x5为leu或met，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0205][0206]
seq id no:26：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，x4为asp或glu，x5为leu或met，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0207][0208]
seq id no:27：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，x6为asp或glu，x7为leu或met，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0209][0210]
seq id no:28：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0211][0212]
seq id no:29：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，并且z2为asn或ala，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0213][0214]
seq id no:30：具有小鼠重链migg vh信号序列的成熟人igg1 fc(粗体)，cys至
ser的取代(#)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0215][0216]
seq id no:31：成熟人fc igg1，z1为asn或不存在，z3为lys或不存在，j1为cys或ser，并且其中x1为met或tyr，x2为ser或thr，x3为thr或glu，z3为asn或ala，x4为leu或asp，x5为gln或his，x6为asp或glu，并且x7为leu或met，x8为met或leu，并且x9为asn或ser，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0217][0218]
seq id no:32：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，z1为asn或不存在，z3为lys或不存在，并且其中z2为asn或ala，x4为leu或asp，x5为gln或his，x6为asp或glu，x7为leu或met，x8为met或leu，并且x9为asn或ser，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0219][0220]
seq id no:33：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，z1为asn或不存在，z3为lys或不存在，并且其中z2为asn或ala，x6为asp或glu，并且x7为leu或met，x8为met或leu，并且x9为asn或ser，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0221][0222]
seq id no:34：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，其中z2为asn或ala，x6为asp或glu，并且x7为leu或met，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0223][0224]
seq id no:35：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，其中x6为asp或glu并且x7为leu或met，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0225]
seq id no:36：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0226][0227]
seq id no:37：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划
线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0228][0229]
seq id no:38：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0230][0231]
seq id no:39：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0232][0233]
seq id no:40：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0234][0235]
seq id no:41：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划
线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0236][0237]
seq id no:42：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0238][0239]
seq id no:43：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0240][0241]
seq id no:44：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，其中x6为asp或glu并且x7为leu或met，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0242]
[0243]
seq id no:45：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0244]
seq id no:46：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0245][0246]
seq id no:47：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0247]
seq id no:48：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0248]
seq id no:49：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0249][0250]
seq id no:50：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0251]
seq id no:51：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0252]
seq id no:52：成熟人fc igg1，cys至ser的取代(#)，asn至ala的取代(*)，dhs三重突变(加粗并带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0253][0254]
seq id no:53：成熟人fc igg1，添加的n末端isamvrs氨基酸残基(斜体)，c末端g4s接头(斜体)，c末端myc标签(带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)
[0255][0256]
seq id no:54：成熟人fc igg1，添加的n末端isamvrs氨基酸残基(斜体)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)
[0257][0258]
seq id no:55：成熟人fc igg1，添加的n末端氨基酸残基(斜体)，铰链残基(斜
体)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)
[0259][0260][0261]
seq id no:56：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0262]
seq id no:57：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，同种异型g1m(f)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0263]
seq id no:58：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，m428l、n434s(粗体/带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0264][0264][0265]
如本文所定义，变体fc结构域包括通过ch3抗体恒定结构域之间的相互作用而二
聚化的两种变体fc结构域单体，以及在两个二聚化变体fc结构域单体的铰链结构域之间形成的一个或多个二硫键。在一些情况下，变体fc结构域形成结合至fc受体(例如，fc伽马受体(即，fcγ受体(fcγr))、fc阿尔法受体(即，fcα受体(fcαr))、fc厄普西隆受体(即，fcε受体(fcεr))和/或新生儿fc受体(fcrn))的最小结构。在一些实施方案中，本发明的fc结构域结合至fcγ受体(例如，fcrn、fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b))和/或fcγriv和/或新生儿fc受体(fcrn)。
[0266]
在一些实施方案中，本发明的变体fc结构域或变体fc结构域单体被工程改造为增强与新生儿fc受体(fcrn)的结合。增强与fcrn的结合可增加含有fc结构域的缀合物或融合蛋白的半衰期，例如，变体fc结构域单体或变体fc结构域可使缀合物的半衰期相对于具有不含c220s/m252y/s254t/t256e、c220s/v309d/q311h/n434s、c220s或增强fcrn结合的进一步的突变的对应fc结构域的缀合物增加5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。如本文所用，与特定氨基酸残基(例如，特定seq id no的特定氨基酸残基)“相对应”的氨基酸应被理解为包括本领域的技术人员将理解为与特定残基(例如，特定序列的特定残基)比对的任何氨基酸残基。例如，可通过如下方式使seq id no：1至3、8至13，或20至29中的任一个突变为包括n297(例如，n297a)突变：通过使该氨基酸序列的“对应残基”突变。
[0267]
在一些情况下，本发明的变体fc结构域或变体fc结构域单体被工程改造成降低或消融与fc受体(例如，fc伽马受体(即，fcγ受体(fcγr))、fc阿尔法受体(即，fcα受体(fcαr))、fc厄普西隆受体(即，fcε受体(fcεr))和/或新生儿fc受体(fcrn))的结合。在一些实施方案中，本发明的fc结构域结合至fcγ受体(例如，fcrn、fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b))和/或fcγriv和/或新生儿fc受体(fcrn)并且特别可用于递送治疗剂(例如，小分子治疗剂或治疗性肽剂)。
[0268]
在一些实施方案中，具有seq id no:1至29和31至52中的任一个的序列的本发明的变体fc结构域或变体fc结构域单体可进一步包括位于n末端处的另外的氨基酸(xaa)x和/或位于c末端处的另外的氨基酸(xaa)z，其中每个xaa均独立地为任何氨基酸并且x和z是大于或等于零、一般小于100，优选小于10并且更优选为0、1、2、3、4或5的整数。
[0269]
免疫细胞的激活
[0270]
fc-γ受体(fcγr)与免疫球蛋白g(igg)的fc部分结合，并且在免疫激活和调节中发挥重要作用。例如，免疫复合物(ic)中的igg fc结构域以高亲和力接合fcγr，因此触发调节免疫细胞激活的信号级联反应。人fcγr家族含有若干激活受体(fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)和一种抑制性受体(fcγriib)。fcγr信号转导由细胞内结构域介导，该细胞内结构域含有用于激活fcγr的免疫酪氨酸激活基序(itam)和用于抑制性受体fcγriib的免疫酪氨酸抑制基序(itim)。在一些实施方案中，fc结构域与fcγr的结合导致由src家族激酶引起的itam磷酸化；这会激活syk家族激酶并诱导包括pi3k和ras通路的下游信号传导网络。
[0271]
在一些情况下，在本文所述的缀合物和融合蛋白中，缀合物或融合蛋白的包括治疗剂的单体或二聚体的部分与感染性病原体(例如，病毒颗粒、真菌或细菌)的暴露于表面的靶点结合，而缀合物或融合蛋白的变体fc结构域部分与免疫细胞上的fcγr(例如，fcrn、fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)结合并激活吞噬作用和效应子功能，
诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，因此导致免疫细胞吞噬和破坏感染性病原体并且进一步增强缀合物的抗病原(例如，抗病毒、抗真菌或抗细菌)活性。可由本文所述的缀合物激活的免疫细胞的实例包括但不限于巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、滤泡树突细胞、自然杀伤细胞和肥大细胞。
[0272]
半衰期
[0273]
生物半衰期(t
1/2
)是治疗剂将其最大浓度减少一半所需的时间。改善治疗剂的半衰期可以降低有效剂量。存在从患者的变量(例如，年龄、血液循环、饮食、过量液体、低液体、性别、用药史、肾功能、肝功能、肥胖、既有身体状况等等)到治疗剂特定变量(例如，治疗剂剂型、药代动力学、施用方法、药物清除(例如，肾、肝或肺)、组织分布和积累、治疗剂尺寸、电荷、pka等等)的许多影响半衰期的变量。对于肽治疗剂而言，血浆半衰期短通常是由于肾清除速度快以及在体循环期间发生的酶降解。肽或蛋白质的修饰可导致血浆半衰期时间延长。在一些情况下，变体fc结构域或融合蛋白被工程改造成增加变体fc结构域单体、缀合物或融合蛋白的半衰期。在一些实施方案中，本发明的变体fc结构域或变体fc结构域单体被工程改造成增强与新生儿fc受体(fcrn)的结合。增强与fcrn的结合可增加含有fc结构域的缀合物或融合蛋白的半衰期，例如，相对于具有不含突变(例如c220s/m252y/s254t/t256e、c220s/v309d/q311h/n434s，或增强fcrn结合的进一步的突变)的对应的fc结构域的缀合物，变体fc结构域单体或变体fc结构域可使缀合物的半衰期增加5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％或更多。在一些情况下，变体fc结构域单体被工程改造成包含至少220个残基。
[0274]
肾清除
[0275]
许多治疗性肽由于其尺寸而在体内具有短的半衰期(分钟)。肽的快速清除和短半衰期限制了它们发展为成功的药物。肾清除是肽从体循环中快速清除的主要原因之一。肾小球具有大约8nm的孔径，并且mw《2-25kda的亲水性肽易于通过肾的肾小球快速过滤。在一些实施方案中，本文所述的变体fc结构域单体和融合蛋白大于20kda。在一些实施方案中，两种缀合物或融合蛋白的变体fc结构域单体和融合蛋白可二聚化从而形成变体fc结构域。在一些实施方案中，变体fc结构域单体、缀合物或融合蛋白被工程改造成减少肾清除。肾清除减少可增加本文所述的缀合物或融合蛋白的变体fc结构域单体的半衰期，例如，变体fc结构域可包括至少约200个氨基酸(例如，至少200个、至少225个、至少约230个、至少约240个、至少约242个、至少约243个、至少约250个、至少约255个、至少约260个、至少约265个、至少约270个、至少约275个、至少约280个、至少约285个、至少约290个、至少约295或至少约300个氨基酸)。
[0276]
组织分布
[0277]
在治疗剂进入体循环后，治疗剂被分布到身体的组织中。分布通常是不均匀的，因为血液灌注、组织结合、区域ph和细胞膜通透性不同。药物进入组织的速率取决于流向该组织的血流速率、组织质量以及血液和组织之间的分配特性。血液和组织之间的分布平衡(当进入和退出速率相同时)在血管丰富的区域中更快地达到，除非跨细胞膜的扩散是限速步骤。尺寸、形状、电荷、靶点结合、fcrn和靶点结合机制、施用途径和剂型影响组织分布。
[0278]
在一些情况下，变体fc多肽被优化成分布到肺组织中。在一些情况下，在施用后2小时内，上皮衬里液中的变体fc结构域单体、缀合物和融合蛋白的分布浓度占血浆中所述
多肽、缀合物或融合蛋白的浓度的比率为至少30％。在某些实施方案中，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少45％。在一些实施方案中，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少55％。特别地，在施用后2小时内，所述浓度的比率为至少60％。如实施例5和图2所示，到注射后2小时，如通过跨越剩余时间过程的auc衡量的，缀合物2的elf水平令人惊讶地是血浆暴露水平的～60％，这表明缀合物2几乎立即从血浆分配到肺中的elf中。这证明了缀合物2快速分布到肺中，并且相对于血浆中的水平在肺中保持高浓度。
[0279]
在一些实施方案中，变体fc结构域单体包括400个或更少的氨基酸残基、350个或更少的氨基酸残基、300个或更少的氨基酸残基或250个或更少的氨基酸残基。
[0280]
在一些情况下，变体fc多肽被优化成分布到肝、神经(例如，cns)、肌肉、表皮、眼部或血管组织中。
[0281]
在fc多肽优先分布到一个或多个特定组织中的情况下，多肽可被用于治疗对应组织的病症(例如，将治疗剂递送至该组织)。
[0282]
fc结构域单体的边界
[0283]
可优化变体fc结构域单体的长度(例如，如通过n末端和c末端边界确定)以防止肾清除并增加对期望组织(例如，肺组织)的分布。抗体分为两个结构域：fc(效应子)结构域和抗原结合片段(fab)结构域，后者含有抗原结合区。本公开提供了变体fc结构域单体，其包括位于fc结构域的n末端处的fab结构域的一部分。已经观察到较小的fc构建体(例如，缺乏fab结构域的一部分的fc构建体)表现出减少的半衰期，这可能是由于肾消除。为了解决此问题，通过在n末端上加回一些fab结构域来反复地拉长fc构建体，直到尺寸的进一步增加不导致改善(例如，在小鼠药代动力学实验中)为止。本公开提供了变体fc结构域单体，其已经被优化(例如，除了突变变异之外，还通过长度、质量、n末端和/或c末端边界优化)以实现期望的增加的半衰期和/或组织分布。
[0284]
在一些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端包含fab结构域的10个至20个的残基(例如，11、12、13、14、15、16、17、18或19个残基)。在某些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基198至205中的任一个。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基201(例如，asn201)。在某些实施方案中，变体fc结构域单体的n末端是氨基酸残基202(例如，val202)。在其他实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基437至447中的任一个。在另一个实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基446(例如，gly446)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体的c末端是氨基酸残基447(例如，lys447)。
[0285]
延长构建体需要添加含有游离半胱氨酸残基(c220)的铰链区的一部分，这会产生硫醇介导的聚集问题。将c220突变为丝氨酸(c220s)以避免此问题。
[0286]
治疗剂递送
[0287]
抗体分子的大尺寸会使靶向系统难以跨细胞膜运输。在一些情况下，大的靶向系统会导致从血液循环中缓慢消除，这最终会导致骨髓毒性。此外，在体内使用基于抗体的靶向系统是昂贵的，并且在反复注射此类制剂后会导致免疫原性。已经成功制备比完整抗体更小的抗体片段，但该抗体片段在许多情况下仍然太大。片段可以比完整抗体更容易到达细胞外空间。在一些情况下，变体fc结构域单体可用于缀合物中以递送治疗剂。在一些情况下，变体fc结构域形成结合至fc受体(例如，fc伽马受体(即，fcγ受体(fcγr))、fc阿尔法
受体(即，fcα受体(fcαr))、fc厄普西隆受体(即，fcε受体(fcεr))和/或新生儿fc受体(fcrn))的最小结构。在一些实施方案中，本发明的fc结构域结合至fcγ受体(例如，fcrn、fcγri(cd64)、fcγriia(cd32)、fcγriib(cd32)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b))和/或fcγriv和/或新生儿fc受体(fcrn)。新生儿fc受体的结合介导变体fc结构域单体或其缀合物或融合蛋白的内化，从而将治疗剂递送至细胞。内化后，内吞补救途径防止变体fc结构域单体或其缀合物或融合蛋白降解。在一些情况下，变体fc结构域的变体fc结构域单体被工程改造成降低新生儿fc受体结合，从而减少进入细胞的内化并增加变体fc结构域缀合物或其融合蛋白的血浆浓度。
[0288]
ii.本公开的缀合物
[0289]
本文提供了可用于治疗本文所述的病状或病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、肌肉病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症或感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染))的合成缀合物。本文公开的缀合物(例如，式(1)描述的缀合物)包括与一种或多种治疗剂(例如，一种或多种小分子治疗剂)缀合的变体fc结构域。
[0290]
不受理论的束缚，在一些方面，本文所述的缀合物通过缀合物中的治疗剂和感染性病原体(例如，病毒颗粒、真菌或细菌)的表面上的蛋白质之间的相互作用与该感染性病原体的暴露于表面的靶点结合。
[0291]
本发明的缀合物包括与变体fc结构域或变体fc结构域单体缀合的治疗剂。本文所述的缀合物中的变体fc结构域与免疫细胞上的fcγr(例如，fcrn、fcγri、fcγriia、fcγriic、fcγriiia和fcγriiib)结合。本文所述缀合物中的变体fc结构域与免疫细胞上的fcγr的结合激活吞噬作用和效应子功能，诸如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)，因此导致免疫细胞吞噬和破坏感染性病原体并且进一步增强缀合物的活性。
[0292]
在一些实施方案中，本文提供的缀合物由式(1)描述。在一些实施方案中，当n为2时，e(变体fc结构域单体)二聚化从而形成变体fc结构域。
[0293]
在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体包括少于约300个氨基酸残基(例如，少于约300个、少于约295个、少于约290个、少于约285个、少于约280个、少于约275个、少于约270个、少于约265个、少于约260个、少于约255个、少于约250个、少于约245个、少于约240个、少于约235个、少于约230个、少于约225个或少于约220个氨基酸残基)。在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体小于约40kda(例如，小于约35kda，小于约30kda，小于约25kda)。
[0294]
在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体包括至少200个氨基酸残基(例如，至少210个、至少220个、至少230个、至少240个、至少250个、至少260个、至少270个、至少280个、至少290个或至少300个氨基残基)。在一些实施方案中，变体fc结构域单体为至少20kda(例如，至少25kda、至少30kda或至少35kda)。
[0295]
在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体包括200至400个氨基酸残基(例如，200至250个、250至300个、300至350个、350至400个、200至300个、250至350个或300至400个氨基酸残基)。在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体的长度介于200个和300个氨基酸残基之间(例如，介于210个和300个氨基酸残基之间、介于230个和300个氨基酸残基之间、介于250个和300个氨基酸残基之间、介于270个和300个氨基酸残基之间、介于290个和300个氨基酸残基之间、介于210个和290个氨基酸残基之间、介于220个和280
个氨基酸残基之间、介于230个和270个氨基酸残基之间、介于240个和260个氨基酸残基之间，或介于245个和255个氨基酸残基之间)。在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体为20至40kda(例如，20至25kda、25至30kda、35至40kda、20至30kda、25至35kda或30至40kda)。在一些实施方案中，所述缀合物的变体fc结构域单体的质量介于约20kda和约40kda之间(例如，20kda至25kda、25kda至30kda、30kda至35kda、35kda至40kda)。
[0296]
在一些实施方案中，每个接头包括聚乙二醇(peg)接头，该聚乙二醇(peg)接头包括介于约2个和10个之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)peg单元。在一些实施方案中，三价接头的至少一个臂包括聚乙二醇(peg)接头，该聚乙二醇(peg)接头包括约2至10个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个)peg单元。
[0297]
在一些实施方案中，所述缀合物为至少40kda(例如，至少45kda、至少50kda、至少55kda、至少60kda、至少65kda、至少70kda、至少75kda或至少80kda)。在一些实施方案中，所述缀合物的质量介于约40kda和约80kda之间(例如，40kda至50kda、45kda至55kda、50kda至60kda、55kda至65kda、60kda至70kda、65kda至75kda或70kda至80kda)。
[0298]
在特定实施方案中，所述缀合物包括变体fc结构域单体，所述变体fc结构域单体包括230至250个氨基酸残基(例如，231个氨基酸残基、232个氨基酸残基、233个氨基酸残基、234个氨基酸残基、235个氨基酸残基、236个氨基酸残基、237个氨基酸残基、238个氨基酸残基、239个氨基酸残基、240个氨基酸残基、241个氨基酸残基、242个氨基酸残基、243个氨基酸残基、244个氨基酸残基、245个氨基酸残基、246个氨基酸残基、247个氨基酸残基、248个氨基酸残基、249个氨基酸残基或250个氨基酸残基)，该氨基酸残基通过连接至一个或多个(例如，1个、2个、3个、4个或更多个)小分子的接头(例如，二聚体接头或三聚体接头(例如，包括2至10个peg单元的接头))与平均1至10个(例如，1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5或10个)小分子连接。
[0299]
本文所述的缀合物可使用本领域中可用的化学合成技术来合成。在官能团不可用于缀合的情况下，可使用本领域众所周知的常规化学合成技术来对分子进行衍生化。在一些实施方案中，本文所述的缀合物含有一个或多个手性中心。所述缀合物包括每种分离的立体异构体形式，以及手性纯度的程度不同的立体异构体混合物，包括外消旋的混合物。它还涵盖可以形成的各种非对映体、对映体和互变异构体。
[0300]
在本文所述的缀合物中，连接至e的波浪线表示一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)治疗剂可与变体fc结构域单体附接。在一些实施方案中，当n为1时，一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)治疗剂可与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接。在一些实施方案中，当n为2时，一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)治疗剂可与变体fc结构域附接。本文所述的缀合物中的波浪线不被解读为一种或多种治疗剂和变体fc结构域中的原子之间的单键。在一些实施方案中，当t为1时，一种治疗剂可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。在一些实施方案中，当t为2时，两种治疗剂可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。
[0301]
如本文进一步描述的，本文所述的缀合物中的接头(例如，l)可以是分支结构。如本文进一步描述的，本文所述的缀合物中的接头(例如，l)可以是多价结构，例如，分别具有两个或三个臂的二价或三价结构。在一些实施方案中，当接头具有三个臂时，其中的两个臂
可与第一和第二治疗剂附接，并且第三臂可与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接。
[0302]
在如通过式(1)所描述的具有与一种或多种治疗剂共价连接的变体fc结构域的缀合物中，当n为2时，两种变体fc结构域单体(每种变体fc结构域单体均由e表示)二聚化从而形成变体fc结构域。
[0303]
与变体fc结构域连接的治疗剂的单体的缀合物
[0304]
在一些实施方案中，本文所述的缀合物包括与治疗剂的一种或多种单体共价连接的变体fc结构域单体或变体fc结构域。变体fc结构域单体和治疗剂的一种或多种单体的缀合物可通过将变体fc结构域通过接头(诸如本文所述的任何接头)与治疗剂的每种单体连接来形成。
[0305]
在本文所述的具有与治疗剂的一种或多种单体连接的变体fc结构域的缀合物中，连接至e的波浪线表示治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)单体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接。在一些实施方案中，当n为1时，治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)单体可与变体fc结构域单体附接。在一些实施方案中，当n为2时，治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)单体可与变体fc结构域附接。本文所述的缀合物中的波浪线不被解读为治疗剂的一种或多种单体和变体fc结构域单体或fc结构域中的原子之间的单键。在一些实施方案中，当t为1时，治疗剂的一种单体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。在一些实施方案中，当t为2时，治疗剂的两种单体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。在一些实施方案中，缀合的变体fc结构域是本文所述的融合蛋白的一部分。
[0306]
在一些实施方案中，第一a-l部分与e的赖氨酸残基(例如，e的暴露于表面的赖氨酸残基的氮原子)特异性地缀合，并且第二a-l部分与e的半胱氨酸残基(例如，e的暴露于表面的半胱氨酸残基的硫原子)特异性地缀合。在一些实施方案中，第一a-l部分与e的半胱氨酸残基(例如，e的暴露于表面的半胱氨酸的硫原子)特异性地缀合，并且第二a-l部分与e的赖氨酸残基(例如，e的暴露于表面的赖氨酸残基的氮原子)特异性地缀合。
[0307]
如本文进一步描述的，本文所述的具有与一种或多种治疗剂共价连接的变体fc结构域单体或变体fc结构域的缀合物中的接头(例如，l)可以是具有两个臂的二价结构。二价接头中的一个臂可与治疗剂附接，并且另一个臂可与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接。
[0308]
在如本文所述的具有与治疗剂的一种或多种单体共价连接的变体fc结构域的缀合物中，当n为2时，两种变体fc结构域单体(每种变体fc结构域单体由e表示)二聚化从而形成变体fc结构域。
[0309]
与变体fc结构域连接的治疗剂的二聚体的缀合物
[0310]
在一些实施方案中，本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)包括与治疗剂的一种或多种二聚体共价连接的变体fc结构域单体或变体fc结构域。变体fc结构域单体和治疗剂的一种或多种二聚体的缀合物可通过将变体fc结构域通过接头(诸如本文所述的接头)与治疗剂的每种二聚体连接来形成。第一和第二治疗剂通过接头(诸如本文所述的接头)彼此连接。在一些实施方案中，在治疗剂是二聚体的情况下，每种治疗剂可以是相同的小分子剂(例如，同源二聚体)或不同的小分子剂(例如，异源二聚体)。
[0311]
在本文所述的具有与治疗剂的一种或多种二聚体共价连接的变体fc结构域的缀合物中，连接至e的波浪线表示治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)二聚体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接。在一些实施方案中，当n为1时，治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种)二聚体可与变体fc结构域单体附接。在一些实施方案中，当n为2时，治疗剂的一种或多种(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种)二聚体可与变体fc结构域附接。本文所述的缀合物中的波浪线不应解读为治疗剂的一种或多种二聚体和变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子之间的单键。在一些实施方案中，当t为1时，治疗剂的一种二聚体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。在一些实施方案中，当t为2时，治疗剂的两种单体可与变体fc结构域单体或变体fc结构域中的原子附接。在一些实施方案中，变体fc结构域是本文所述的融合蛋白的一部分。
[0312]
在一些实施方案中，第一a-l部分与e的赖氨酸残基(例如，e的暴露于表面的赖氨酸残基的氮原子)特异性地缀合，并且第二a-l部分与e的半胱氨酸残基(例如，e的暴露于表面的半胱氨酸残基的硫原子)特异性地缀合。在一些实施方案中，第一a-l部分与e的半胱氨酸残基(例如，e的暴露于表面的半胱氨酸残基的硫原子)特异性地缀合，并且第二a-l部分与e的赖氨酸残基(例如，e的暴露于表面的赖氨酸残基的氮原子)特异性地缀合。
[0313]
如本文进一步描述的，本文所述的具有与治疗剂的一种或多种二聚体共价连接的变体fc结构域单体或变体fc结构域的缀合物中的接头(例如，l)可以是三价结构(例如，三价接头)。三价接头具有三个臂，其中每个臂与缀合物的组分共价连接(例如，第一臂与第一治疗剂缀合，第二臂与治疗剂缀合，并且第三臂与融合蛋白或变体fc结构域单体缀合)。
[0314]
在如本文所述的具有与治疗剂的一种或多种二聚体共价连接的变体fc结构域的缀合物中，当n为2时，两种变体fc结构域单体(每种变体fc结构域单体均由e表示)二聚化从而形成变体fc结构域。
[0315]
iii.融合蛋白
[0316]
本发明的特征在于融合蛋白，其至少一种包括与至少一种(例如，一种或两种)治疗性肽剂缀合的变体fc结构域单体。本发明的示例性融合蛋白包括结构(p
2-l2)n
2-b-(l
1-p1)n1，其中b是变体fc结构域单体(例如，包括seq id no:1至29、31至52和56至58中的任一个的氨基酸序列的变体fc结构域单体)或其缀合物；p1和p2各自独立地为治疗性肽剂；l1和l2各自独立地为接头(例如，化学接头或肽接头)；并且n1和n2各自独立地为0或1，其中n1和n2中的至少一者为1(例如，融合蛋白必须包括至少一种治疗剂)。
[0317]
在一些实施方案中，融合蛋白包括一种与一种治疗性肽剂缀合的变体fc结构域单体。例如，n1为1，n2为0，并且融合蛋白包括结构：b-l
1-p1。变体fc结构域单体和治疗性肽剂可以任何取向缀合。在发生c至n缀合的情况下，变体fc结构域单体和治疗性肽剂可表达为包含多肽接头的单一多肽构建体或可单独地表达，并且随后可经由多肽接头或化学接头缀合。在发生c至c或n至n缀合的情况下，变体fc结构域单体和治疗性肽剂单独地表达并随后缀合，例如经由化学接头或肽接头缀合。例如，接头(l1)可与变体fc结构域单体(b)的c末端以及与治疗性肽剂(p1)的n末端缀合。可替代地，接头(l1)可与变体fc结构域单体(b)的n末端以及与治疗性肽剂(p1)的c末端缀合。可替代地，接头(l1)与变体fc结构域单体(b)的n末端以及与治疗性肽剂(p1)的n末端缀合。可替代地，接头(l1)与变体fc结构域单体(b)的c末
端以及与治疗性肽剂(p1)的c末端缀合。
[0318]
在一些实施方案中，融合蛋白包括一种与两种治疗性肽剂缀合的变体fc结构域单体。例如，n1为1，n2为1，并且融合蛋白包括结构：p
2-l
2-b-l
1-p1。如上所述，缀合可以以任何取向发生，并且融合蛋白可表达为单一多肽构建体或可通过化学缀合组装。例如，接头(l2)可与治疗性肽剂(p2)的c末端以及与变体fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)可与变体fc结构域单体(b)的c末端以及与治疗性肽剂(p1)的n末端缀合。可替代地，接头(l2)可与治疗性肽剂(p2)的n末端以及与变体fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)可与治疗性肽剂(p1)的n末端以及与变体fc结构域单体(b)的c末端缀合。可替代地，接头(l2)可与治疗性肽剂(p2)的c末端以及与变体fc结构域单体(b)的n末端缀合，并且接头(l1)可与治疗性肽剂(p1)的c末端以及与变体fc结构域单体(b)的c末端缀合。
[0319]
本公开还提供了一种缀合物，其包括：第一融合蛋白，其选自本文所述的治疗性肽剂-变体fc结构域单体融合蛋白中的任一种；和第二融合蛋白，其选自本文所述的治疗性肽剂-变体fc结构域单体融合蛋白中的任一种；其中第一融合蛋白的变体fc结构域单体(b)和第二融合蛋白的变体fc结构域单体(b)二聚化从而形成变体fc结构域单体。在一些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白具有相同的结构并且缀合物是同源二聚体。
[0320]
iv.接头
[0321]
接头是指本文所述的缀合物中的两种或更多种组分之间(例如，本文所述的缀合物中的两种治疗剂之间、本文所述的缀合物中的治疗剂和变体fc结构域单体或变体fc结构域之间，以及本文所述的缀合物中的两种治疗剂的二聚体和变体fc结构域单体或变体fc结构域之间)的连键或连接。
[0322]
接头可以是简单的共价键(例如，肽键)、合成聚合物(例如，聚乙二醇(peg)聚合物)或由化学反应(例如,化学缀合)产生的任何种类的键。在接头是肽键的情况下，一个蛋白质结构域的c末端处的羧酸基团可以与另一个蛋白质结构域的n末端处的氨基以缩合反应的方式发生反应从而形成肽键。具体地，肽键可以由合成方式通过本领域众所周知的常规有机化学反应形成，或通过宿主细胞的天然生产形成，其中串联编码两种蛋白质(例如，两种变体fc结构域单体)的dna序列的多核苷酸序列可以通过宿主细胞中的必要的分子机制(例如，dna聚合酶和核糖体)直接转录并翻译成编码两种蛋白质的邻接多肽。
[0323]
在接头是合成聚合物(例如，peg聚合物)的情况下，该聚合物可以在每一端用反应性化学官能团官能化，以与两种蛋白质的连接端处的末端氨基酸反应。
[0324]
在接头(上文提到的肽接头除外)由化学反应制备的情况下，可以以合成方式使化学官能团(例如，胺、羧酸、酯、叠氮基或本领域通常使用的其他官能团)分别与一种蛋白质的c末端和另一种蛋白质的n末端附接。然后可以使这两个官能团通过合成化学方式反应以形成化学键，从而将两个蛋白质连接在一起。此类化学缀合程序对于本领域的技术人员来说是常规的。
[0325]
肽接头
[0326]
在本发明中，治疗性肽剂和变体fc结构域单体之间的接头(例如，l1或l2)可以是包括3至200个氨基酸(例如，3至200个、3至180个、3至160个、3至140个、3至120个、3至100个、3至90个、3至80个、3至70个、3至60个、3至50个、3至45个、3至40个、3至35个、3至30个、3至25个、3至20个、3至15个、3至10个、3至9个、3至8个、3至7个、3至6个、3至5个、3至4个、4至200
个、5至200个、6至200个、7至200个、8至200个、9至200个、10至200个、15至200个、20至200个、25至200个、30至200个、35至200个、40至200个、45至200个、50至200个、60至200个、70至200个、80至200个、90至200个、100至200个、120至200个、140至200个、160至200个或180至200个氨基酸)的多肽。在一些实施方案中，治疗性肽剂和变体fc结构域单体之间的接头(例如，l1或l2)是含有至少12个氨基酸，诸如12至200个氨基酸(例如，12至200个、12至180个、12至160个、12至140个、12至120个、12至100个、12至90个、12至80个、12至70个、12至60个、12至50个、12至40个、12至30个、12至20个、12至19个、12至18个、12至17个、12至16个、12至15个、12至14个或12至13个氨基酸)(例如，14至200个、16至200个、18至200个、20至200个、30至200个、40至200个、50至200个、60至200个、70至200个、80至200个、90至200个、100至200个、120至200个、140至200个、160至200个、180至200个或190至200个氨基酸)的多肽。在一些实施方案中，治疗性肽剂和变体fc结构域单体之间的接头(例如，l1或l2)是含有12至30个氨基酸(例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个氨基酸)的多肽。
[0327]
合适的肽接头是本领域已知的，并且包括，例如，含有柔性氨基酸残基(诸如甘氨酸和丝氨酸)的肽接头。在一些实施方案中，接头可以含有gs、ggs(seq id no:61)、ggggs(seq id no:62)、ggsg(seq id no:63)或sggg(seq id no:64)的基序，例如多个基序或重复基序。在一些实施方案中，接头可以含有包括gs的基序(例如，gs、gsgs(seq id no:65)、gsgsgs(seq id no:66)、gsgsgsgs(seq id no:67)、gsgsgsgsgs(seq id no:68)或gsgsgsgsgsgs(seq id no:69))的2至12个氨基酸。在一些其他实施方案中，接头可以含有包括ggs的基序(例如，ggs、ggsggs(seq id no:70)、ggsggsggs(seq id no:71)和ggsggsggsggs(seq id no:72))的3至12个氨基酸。在另一些其他实施方案中，接头可以含有包括ggsg(seq id no:73)的基序(例如，ggsgggsg(seq id no:74)或ggsgggsgggsg(seq id no:75))的4至12个氨基酸。在其他实施方案中，接头可以含有ggggs(seq id no:61)的基序，例如ggggsggggsggggs(seq id no:76)。在一些实施方案中，接头是sgggsgggsgggsgggsggg(seq id no:77)。
[0328]
在优选的实施方案中，肽接头(例如，l1和l2)是包括(gs)x、(ggs)x、(ggggs)x、(ggsg)x、(sggg)x中的任一者的氨基酸序列的肽接头，其中x为1至50(例如，1至40、1至30、1至20、1至10或1至5)的整数。
[0329]
在一些实施方案中，肽接头仅含有甘氨酸残基，例如，至少4个甘氨酸残基(例如，4至200个、4至180个、4至160个、4至140个、4至40个、4至100个、4至90个、4至80个、4至70个、4至60个、4至50个、4至40个、4至30个、4至20个、4至19个、4至18个、4至17个、4至16个、4至15个、4至14个、4至13个、4至12个、4至11个、4至10个、4至9个、4至8个、4至7个、4至6个或4至5个甘氨酸残基)(例如，4至200个、6至200个、8至200个、10至200个、12至200个、14至200个、16至200个、18至200个、20至200个、30至200个、40至200个、50至200个、60至200个、70至200个、80至200个、90至200个、100至200个、120至200个、140至200个、160至200个、180至200个或190至200个甘氨酸残基)。在一些实施方案中，接头具有4至30个甘氨酸残基(例如，4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个甘氨酸残基)。在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的接头可不被糖基化(例如，o连接糖基化，也称为o糖基化)，或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的接头相比，可具有降低的糖基
化水平(例如，降低的o糖基化水平)(例如，降低的针对聚糖，诸如木糖、甘露糖、唾液酸、岩藻糖(fuc)和/或半乳糖(gal)(例如，木糖)的o糖基化水平)。
[0330]
在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的接头可不被o糖基化(例如，o木糖基化)，或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的接头相比，可具有降低的o糖基化水平(例如，降低的o木糖基化水平)。
[0331]
在一些实施方案中，仅含有甘氨酸残基的接头可不经历蛋白质水解，或者与例如含有一个或多个丝氨酸残基的接头相比，可具有降低的蛋白质水解速率。
[0332]
在一些实施方案中，接头可以含有gggg(seq id no:78)的基序，例如gggggggg(seq id no:79)、gggggggggggg(seq id no:80)、gggggggggggggggg(seq id no:81)或gggggggggggggggggggg(seq id no:82)。在一些实施方案中，接头可以含有ggggg(seq id no:83)的基序，例如gggggggggg(seq id no:84)、ggggggggggggggg(seq id no:85)或gggggggggggggggggggg(seq id no:82)。在一些实施方案中，接头是gggggggggggggggggggg(seq id no:82)。
[0333]
在其他实施方案中，接头还可以含有甘氨酸和丝氨酸以外的氨基酸残基，例如，genlyfqsgg(seq id no:86)、sacycels(seq id no:87)、rsiat(seq id no:88)、rpackipndlkqkvmnh(seq id no:89)、ggsaggsgsgssggssgasgtgtaggtgsgsgtgsg(seq id no:90)、aaanssidlisvpvdsr(seq id no:91)或ggsgggsegggsegggsegggsegggsegggsgggs(seq id no:92)。
[0334]
化学接头
[0335]
在一些实施方案中，接头提供本文所述的缀合物和融合蛋白中的治疗剂和变体fc结构域单体或变体fc结构域之间的或本文所述的缀合物中的两种治疗剂之间的空间、刚性和/或柔性。在一些实施方案中，接头可以是键，例如共价键(例如酰胺键、二硫键、c-o键、c-n键、n-n键、c-s键)或由化学反应(例如，化学缀合)产生的任何种类的键。在一些实施方案中，接头(如式(1)中所示的l)包括不超过250个原子(例如，1至2个、1至4个、1至6个、1至8个、1至10个、1至12个、1至14个、1至16个、1至18个、1至20个、1至25个、1至30个、1至35个、1至40个、1至45个、1至50个、1至55个、1至60个、1至65个、1至70个、1至75个、1至80个、1至85个、1至90个、1至95个、1至100个、1至110个、1至120个、1至130个、1至140个、1至150个、1至160个、1至170个、1至180个、1至190个、1至200个、1至210个、1至220个、1至230个、1至240个或1至250个原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个原子)。在一些实施方案中，接头(l)包括不超过250个非氢原子(例如，1至2个、1至4个、1至6个、1至8个、1至10个、1至12个、1至14个、1至16个、1至18个、1至20个、1至25个、1至30个、1至35个、1至40个、1至45个、1至50个、1至55个、1至60个、1至65个、1至70个、1至75个、1至80个、1至85个、1至90个、1至95个、1至100个、1至110个、1至120个、1至130个、1至140个、1至150个、1至160个、1至170个、1至180个、1至190个、1至200个、1至210个、1至220个、1至230个、1至240个或1至250个非氢原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、
30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个非氢原子)。在一些实施方案中，接头(l)的骨架包括不超过250个原子(例如，1至2个、1至4个、1至6个、1至8个、1至10个、1至12个、1至14个、1至16个、1至18个、1至20个、1至25个、1至30个、1至35个、1至40个、1至45个、1至50个、1至55个、1至60个、1至65个、1至70个、1至75个、1至80个、1至85个、1至90个、1至95个、1至100个、1至110个、1至120个、1至130个、1至140个、1至150个、1至160个、1至170个、1至180个、1至190个、1至200个、1至210个、1至220个、1至230个、1至240个或1至250个原子；250个、240个、230个、220个、210个、200个、190个、180个、170个、160个、150个、140个、130个、120个、110个、100个、95个、90个、85个、80个、75个、70个、65个、60个、55个、50个、45个、40个、35个、30个、28个、26个、24个、22个、20个、18个、16个、14个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个原子)。接头的“骨架”是指接头中的一起形成从缀合物的一部分到缀合物的另一部分的最短路径的原子。接头骨架中的原子直接参与将缀合物的一部分连接至缀合物的另一部分。例如，附接至接头骨架中的碳的氢原子不被视为直接参与将缀合物的一部分附接至缀合物的另一部分。
[0336]
可用于制备接头(l)的分子包括至少两个官能团，例如两个羧酸基团。在三价接头一些实施方案中，接头的两个臂可含有两个二元羧酸，其中第一羧酸可与缀合物中的第一治疗剂形成共价连键，并且第二羧酸可与缀合物中的第二治疗剂形成共价连键，并且接头的第三臂可与本文所述的缀合物或融合蛋白中的变体fc结构域单体或变体fc结构域形成共价连键(例如，c-o键)。在二价接头的一些实施方案中，二价接头可含有两个羧酸，其中第一羧酸可与缀合物中的一种组分(例如，治疗剂)形成共价连键，并且第二羧酸可与缀合物中的另一种组分(例如，变体fc结构域单体或变体fc结构域)形成共价连键(例如，c-s键或c-n键)。
[0337]
在一些实施方案中，二元羧酸分子可用作接头(例如，二元羧酸接头)。例如，在含有与治疗剂的一种或多种二聚体共价连接的变体fc结构域单体或变体fc结构域的缀合物中，二元羧酸分子中的第一羧酸可与第一治疗剂的羟基或胺基团形成共价连键，并且第二羧酸可与第二治疗剂的羟基或胺基团形成共价连键。在一些情况下，如果治疗剂上的反应性基团(例如，羧酸、羟基或胺)不可用，可以以不破坏治疗剂活性的方式将反应性基团(例如，羧酸、羟基或胺)引入到治疗剂中。
[0338]
在一些实施方案中，二元羧酸分子(诸如本文所述的那些)可被进一步官能化成含有一个或多个另外的官能团。二元羧酸可被进一步官能化成例如提供与本文所述的变体fc结构域单体、变体fc结构域，或融合蛋白的附接点(例如，通过接头，诸如peg接头)。
[0339]
在一些实施方案中，当治疗剂与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接时，连接基团可包括包含间隔1至25个原子的羧酸部分和氨基部分的部分。
[0340]
在一些实施方案中，连接基团可包括包含羧酸部分和氨基部分的部分(诸如本文所述的那些)，并可被进一步官能化成含有一个或多个另外的官能团。此类连接基团可被进一步官能成例如提供与本文所述的变体fc结构域单体、变体fc结构域或融合蛋白的附接点(例如，通过接头，诸如peg接头)。
[0341]
在一些实施方案中，当治疗剂与变体fc结构域单体或变体fc结构域附接时，连接基团可包括包含间隔1至25个原子的两个氨基部分(例如，二氨基部分)的部分。
[0342]
在一些实施方案中，连接基团可包括二氨基部分(诸如本文所述的那些)，并可被进一步官能化成含有一个或多个另外的官能团。此类二氨基连接基团可被进一步官能成例如提供与本文所述的变体fc结构域单体、变体fc结构域或融合蛋白的附接点(例如，通过接头，诸如peg接头)。
[0343]
在一些实施方案中，含有叠氮基的分子可用于形成接头，其中叠氮基可与炔烃发生环加成反应从而形成1,2,3-三唑连键。在一些实施方案中，含有炔烃基团的分子可用于形成接头，其中炔烃基团可与叠氮基发生环加成反应从而形成1,2,3-三唑连键。在一些实施方案中，含有马来酰亚胺基团的分子可用于形成接头，其中马来酰亚胺基团可与半胱氨酸反应从而形成c-s连键。在一些实施方案中，含有一个或多个磺酸基团的分子可用于形成接头，其中磺酸基团可与治疗剂中的连接氮形成磺酰胺连键。在一些实施方案中，含有一个或多个异氰酸酯基团的分子可用于形成接头，其中异氰酸酯基团可与治疗剂中的连接氮形成脲连键。在一些实施方案中，含有一个或多个卤代烷基的分子可用于形成接头，其中卤代烷基可与治疗剂形成共价连键，例如c-n连键或c-o连键。
[0344]
在一些实施方案中，接头(l)可包括衍生自例如合成聚合物(例如，聚乙二醇(peg)聚合物)的合成基团。在一些实施方案中，接头可包括一个或多个氨基酸残基。在一些实施方案中，接头可以是氨基酸序列(例如，1至25个氨基酸、1至10个氨基酸、1至9个氨基酸、1至8个氨基酸、1至7个氨基酸、1至6个氨基酸、1至5个氨基酸、1至4个氨基酸、1至3个氨基酸、1至2个氨基酸或1个氨基酸的序列)。在一些实施方案中，接头(l)可包括一个或多个任选取代的c1至c20亚烷基、任选取代的c1至c20亚杂烷基(例如，peg单元)、任选取代的c2至c20亚烯基(例如，c2亚烯基)、任选取代的c2至c20亚杂烯基、任选取代的c2至c20亚炔基、任选取代的c2-c20亚杂炔基、任选取代的c3至c20亚环烷基(例如，亚环丙基、亚环丁基)、任选取代的c3至c20亚杂环烷基、任选取代的c4至c20亚环烯基、任选取代的c4至c20亚杂环烯基、任选取代的c8至c20亚环炔基、任选取代的c8至c20亚杂环炔基、任选取代的c5至c15亚芳基(例如，c6亚芳基)、任选取代的c2至c15亚杂芳基(例如，咪唑、吡啶)、o、s、nri(ri为h、任选取代的c1至c20烷基、任选取代的c1至c20杂烷基、任选取代的c2至c20烯基、任选取代的c2至c20杂烯基、任选取代的c2至c20炔基、任选取代的c2至c20杂炔基、任选取代的c3至c20环烷基、任选取代的c3至c20杂环烷基、任选取代的c4至c20环烯基、任选取代的c4至c20杂环烯基、任选取代的c8至c20环炔基、任选取代的c8至c20杂环炔基、任选取代的c5至c15芳基或任选取代的c2至c15杂芳基)、p、羰基、硫代羰基、磺酰基、磷酸酯基、磷酰基或亚氨基。
[0345]
缀合化学
[0346]
可使用众所周知的有机化学合成技术和方法来完成使用接头对缀合物中的两种或更多种组分的共价缀合。两种组分上的互补官能团可彼此反应从而形成共价键。互补反应性官能团的实例包括但不限于，例如，马来酰亚胺和半胱氨酸、胺和激活的羧酸、硫醇和马来酰亚胺、激活的磺酸和胺、异氰酸酯和胺、叠氮基团和炔烃，以及烯烃和四嗪。可使用本领域已知的技术来完成与多肽(例如，变体fc结构域单体、变体fc结构域或融合蛋白)的位点特异性缀合。agarwall.p.等人bioconjugate chem.26:176-192(2015)中提供了用于将小分子与fc结构域单体或fc结构域(例如，本文所述的变体fc结构域单体或变体fc结构域)位点特异性地缀合的示例性技术。
[0347]
能够与氨基反应的官能团的其他实例包括，例如，烷基化剂和酰化剂。代表性烷基
化剂包括：(i)α-卤代乙酰基，例如xch2co-(其中x＝br、cl或i)；(ii)n-马来酰亚胺基团，其可通过迈克尔型反应(michael type reaction)或通过加成到环羰基上的酰化反应而与氨基反应；(iii)芳基卤化物，例如硝基卤代芳族基团；(iv)烷基卤化物；(v)能够与氨基形成席夫碱(schiff’s base)的醛或酮；(vi)可与氨基、巯基或酚羟基反应的环氧化物，例如，环氧氯丙烷和双环氧乙烷；(vii)含氯均三嗪，其对亲核试剂(诸如氨基、巯基和羟基)具有反应性；(viii)氮丙啶，其通过开环对亲核试剂(诸如氨基)具有反应性；(ix)方酸二乙酯；以及(x)α-卤代烷基醚。
[0348]
氨基反应性酰化基团的实例包括，例如，(i)异氰酸酯和异硫氰酸酯；(ii)磺酰氯；(iii)酰卤；(iv)活性酯，例如硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺酯，或其衍生物(例如，叠氮基-peg
2-peg
40-nhs酯)；(v)酸酐，例如混合的、对称的或n-羧酸酐；(vi)酰叠氮化物；以及(vii)亚胺酯。醛和酮可与胺反应从而形成席夫碱，席夫碱可通过还原胺化来稳定。
[0349]
应当理解，可在反应之前将某些官能团转化成其他官能团，例如，以赋予另外的反应性或选择性。可用于此目的的方法的实例包括使用诸如二元羧酸酐的试剂将胺转化为羧基；使用诸如n-乙酰基同型半胱氨酸硫代内酯、s-乙酰基巯基琥珀酸酐、2-亚氨基硫烷或含硫醇的琥珀酰亚胺基衍生物的试剂将胺转化为硫醇；使用诸如α-卤代乙酸酯的试剂将硫醇转化为羧基；使用诸如乙撑亚胺或2-溴乙胺的试剂将硫醇转化为胺；使用诸如碳二亚胺的试剂将羧基转化为胺，然后再转化为二胺；以及使用诸如甲苯磺酰氯的试剂将醇转化为硫醇，然后用硫代乙酸酯进行酯交换反应，然后用乙酸钠水解为硫醇。
[0350]
在一些实施方案中，本发明的接头(例如，l)(例如，通过任何本文所述的方法)缀合至变体fc结构域单体(例如，e)。在本发明的优选的实施方案中，接头通过以下方式缀合：(a)通过硫脲连键(即，-nh(c＝s)nh-)与e的赖氨酸缀合；(b)通过氨基甲酸酯连键(即，-nh(c＝o)-o)与e的赖氨酸缀合；(c)通过赖氨酸和e之间通过还原胺化的胺连键(即，-nhch2)缀合；(d)通过酰胺(即，-nh-(c＝o)ch2)与e的赖氨酸缀合；(e)通过接头的马来酰亚胺与e的半胱氨酸之间的半胱氨酸-马来酰亚胺缀合物缀合；(f)通过接头和e的碳水化合物(例如，变体fc结构域单体或变体fc结构域的糖基)之间通过还原胺化的胺连键(即，-nhch2)缀合；(g)通过重新桥接的半胱氨酸缀合物缀合，其中接头与e的两个半胱氨酸缀合；(h)通过接头和e的碳水化合物(例如，变体fc结构域单体或变体fc结构域的糖基)之间的肟连键缀合；(i)通过接头和e的氨基酸残基之间的肟连键缀合；(j)通过接头和e之间的叠氮基连键缀合；(k)通过接头对e的直接酰化缀合；或(l)通过接头和e之间的硫醚连键缀合。
[0351]
在一些实施方案中，接头与e缀合，其中连键包括结构-nh(c＝nh)x-，其中x为o、hn或键。在一些实施方案中，接头与e缀合，其中接头的其余部分与e之间的连键包括结构-nh(c＝o)nh-。
[0352]
在一些实施方案中，接头(例如活性酯，例如硝基苯酯或n-羟基琥珀酰亚胺酯或其衍生物(例如，官能化的peg接头(例如，叠氮基-peg
2-peg
40-nhs酯)))与e缀合，其中t(例如，dar)介于0.5和10.0之间，例如为0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8.0、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、
9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0。在这些情况下，e-(peg
2-peg
40
)-叠氮化物可以通过点击缀合与具有末端炔烃接头(例如，l)的被修饰的治疗剂反应。在点击缀合期间，叠氮化物(例如，fc-(peg
2-peg
40
)-叠氮化物)与炔烃(例如，具有末端炔烃接头(例如，l)的被修饰的治疗剂)的铜催化反应形成5元杂原子环。在一些实施方案中，与e缀合的接头是末端炔烃并且与具有末端叠氮基团的被修饰的治疗剂缀合。本领域技术人员将容易地理解来自点击化学缀合的最终产物。
[0353]
v.方法
[0354]
本文所述的方法包括，例如，防御或治疗受试者的本文所述的病状或病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、肌肉病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症或感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染))的方法以及防止、稳定或抑制感染病原体(例如，病毒颗粒、真菌或细菌)的生长的方法。治疗受试者的本文所述的病状或病症(例如，呼吸系统病症、肝病症、中枢神经系统病症、肌肉病症、皮肤病症、眼部病症、血管病症或感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染))的方法包括向受试者施用本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)、本文所述的融合蛋白或其药物组合物。
[0355]
病毒感染
[0356]
本文所述的化合物和药物组合物(例如，本文所述的式(1)的缀合物或融合蛋白)可用于治疗病毒感染(例如，病毒性脑膜炎、单纯疱疹病毒(hsv)1、hsv 2、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘-带状疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、西尼罗河病毒、拉克罗斯病毒、西部马脑炎、东部马脑炎、波瓦桑病毒、狂犬病病毒、呼吸道合胞病毒(rsv)、登革热、β冠状病毒(例如，covid-19)、寨卡病毒或流行性感冒病毒感染，诸如甲型、乙型、丙型流行性感冒或副流感)。
[0357]
病毒感染是指病毒在宿主生物体(例如，人受试者)中的病原性生长。病毒感染可以是一种或多种病毒群体的存在对宿主身体造成损害的任何情况。因此，当受试者的体内或体表上存在过量的病毒群体时，或当一种或多种病毒群体的存在对受试者的细胞或其他组织造成损害时，受试者正患有病毒感染。
[0358]
流行性感冒，通常称为“流感”，是由流行性感冒病毒引起的感染性疾病。症状可以为轻微至严重。最常见的症状包括：高烧、流鼻涕、喉咙痛、肌肉疼痛、头痛、咳嗽以及感到疲倦。这些症状通常在接触病毒两天后开始，并且大多数持续少于一周。然而，咳嗽可持续超过两周。在儿童中可能出现恶心和呕吐，但这些在成人中并不常见。流行性感冒的并发症可包括病毒性肺炎、继发性细菌性肺炎、鼻窦感染和先前的健康问题(诸如哮喘或心力衰竭)的恶化。严重的并发症可发生在免疫系统较弱的受试者，诸如年轻人、老年人、患有减弱免疫系统的疾病的人以及经历导致免疫系统减弱的疗法治疗的人中。
[0359]
三种类型的流行性感冒病毒影响人类受试者，即甲型、乙型和丙型。通常，病毒通过咳嗽或打喷嚏通过空气传播。这被认为主要发生在相对较短的距离中。它也可以通过接触被病毒污染的表面并然后接触嘴或眼睛来传播。人在表现出症状之前和期间可对其他人具有传染性。可通过测试喉咙、痰或鼻子的病毒来确认感染。多个快速测试是可用的；然而，如果结果为阴性，人们仍可能患有感染。一种检测病毒rna的聚合酶链反应可用于诊断流行性感冒感染。
[0360]
病毒感染可指代病毒(例如rsv，诸如rsv a或rsv b)在宿主生物体(例如，人受试
者)中的病原性生长。人呼吸道合胞病毒(rsv)是中等尺寸的(120至200nm)包膜病毒，其含有脂蛋白外壳和线性负义的rna基因组(必须在翻译前转化为正rna)。前者含有病毒编码的f、g和sh脂蛋白。f和g脂蛋白是rsv分离株中仅有的两种靶向细胞膜的脂蛋白并且高度保守。基于病毒与针对附着糖蛋白(g)和融合糖蛋白(f)的单克隆抗体的反应性，将人rsv(hrsv)分成两个抗原亚组a和b。b亚型的特征在于大多数群体经历的无症状病毒株。更严重的临床疾病涉及a亚型株，其趋于在大多数暴发中占主导地位。
[0361]
四种病毒基因编码参与基因组转录、复制和颗粒出芽的细胞内蛋白，即n(核蛋白)、p(磷蛋白)、m(基质蛋白)和l(“大”蛋白，其含有rna聚合酶催化基序)。rsv基因组rna与n蛋白形成螺旋状核糖核蛋白(rnp)复合物，称为核衣壳，其用作病毒聚合酶复合物合成rna的模板。已经以的分辨率确定了与rna结合的rsv核蛋白(n)的十聚体环状核糖核蛋白复合物的三维晶体结构。此复合物模拟病毒螺旋状核衣壳复合物的一圈。其晶体结构与电子显微镜数据相组合，为rsv核衣壳提供详细的模型。
[0362]
病毒感染可以指无菌性脑膜炎(am)，其被定义为蛛网膜下腔的炎症，由脑脊液单核细胞增多和无菌csf(脑脊液或脑脊液)培养来表征。am的主要原因是病毒感染(ravel r:clinical laboratory medicine:clinical application of laboratory data:elsevier health sciences；1994)。病毒性脑膜炎很常见，并且通常没有被报告。非脊髓灰质炎病毒肠道病毒(柯萨奇病毒和艾柯病毒(echovirus))是病因确定的病毒性脑膜炎的80％至90％的病例的原因(atkinson p,sharland m,maguire h:predominant enteroviral serotypes causing meningitis.archives of disease in childhood 1998,78:373-374)。
[0363]
病毒感染可以指单纯疱疹病毒1(hsv 1)或hsv 2。hsv 1是唇部上的感冒疮(唇疱疮(herpes labialis))和眼角膜上的疮(单纯疱疹性角膜炎)的常见原因。hsv 2是生殖器疱疹的常见原因。两者的区别并不是绝对的。生殖器感染有时由hsv 1引起。感染还可以发生在身体的其他部位，诸如大脑(严重的疾病)或胃肠道。在新生儿或免疫系统较弱的人(特别是感染艾滋病的人)中可发生广泛感染。hsv具有很强的传染性,并且即使在看不到疮时也可以通过直接接触疮传播，并且有时通过接触hsv感染者的口腔或生殖器传播。
[0364]
病毒感染可以指柯萨奇病毒。柯萨奇病毒是一些相关的肠道病毒，其属于非包膜、线性、正义、单链rna病毒的小核糖核酸病毒家族，以及还包括脊髓灰质炎病毒和艾柯病毒的肠道病毒属。柯萨奇病毒虽然是无菌性脑膜炎的主要原因之一，但可引起手足口疾病，以及肌肉、肺和心脏疾病。
[0365]
本发明还提供一种防止、稳定或抑制病毒颗粒生长或防止病毒复制和扩散的方法，该方法包括使病毒或易受病毒生长影响的部位与本文所述的缀合物(例如，式(1)中的任一种的缀合物)、本文所述的融合蛋白或其药物组合物接触。在一些实施方案中，病毒是病毒的耐药株。
[0366]
此外，本文所述的方法还包括防御或治疗受试者的病毒感染的方法，其通过向受试者施用本文所述的组合物(例如，式(1)的缀合物)或本文所述的融合蛋白与第二治疗剂(诸如抗病毒剂或抗病毒疫苗)的组合来实现。
[0367]
细菌感染
[0368]
本文所述的化合物和药物组合物(例如，式(1)的缀合物或本文所述的融合蛋白)
可以用于治疗细菌感染。
[0369]
细菌感染是指细菌(例如，不动杆菌种(鲍曼不动杆菌)、吉氏拟杆菌、脆弱拟杆菌、卵形拟杆菌、多形拟杆菌、单形拟杆菌、普通拟杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、柯氏柠檬酸杆菌、梭状芽孢杆菌、产气荚膜梭菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、肠球菌种(对万古霉素敏感和耐药的分离物)、大肠杆菌(包括产生esbl和kpc的分离物)、迟缓真杆菌、梭杆菌种、流感嗜血杆菌(包括β内酰胺酶阳性分离物)、副流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯氏菌(包括产生esbl和kpc的分离物)、产酸克雷伯式菌(包括产生esbl和kpc的分离物)、嗜肺军团菌、卡他莫拉菌、摩氏摩根氏菌、支原体种、消化链球菌种、非解糖卟琳单胞菌、二路普雷沃氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、雷氏普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷菌、咽峡炎链球菌、金黄色葡萄球菌(对甲氧西林敏感和耐药的分离物)、表皮葡萄球菌(对甲氧西林敏感和耐药的分离物)、嗜麦芽窄食单胞菌、无乳链球菌、星座链球菌、肺炎链球菌(对青霉素敏感和耐药的分离物)、化脓性链球菌)在宿主生物体(例如，人受试者)中的病原性生长。细菌感染可以是一种或多种细菌群体的存在对宿主身体造成损害的任何情况。因此，当受试者的体内或体表上存在过量的细菌群体时，或当一种或多种细菌群体的存在对受试者的细胞或其他组织造成损害时，受试者正患有细菌感染。
[0370]
金黄色葡萄球菌是主要的人类病原体，并且估计大约30％的人类是无症状的鼻腔携带者(chambers和deleo 2009.nat.rev.microbiol.7:629-641)。金黄色葡萄球菌引起皮肤、软组织、呼吸系统、骨、关节和血管内疾病。由金黄色葡萄球菌引起的危及生命的病例包括菌血症、心内膜炎、败血症和中毒性休克综合征(lowy1998.n.engl.j.med.339:520-532)。金黄色葡萄球菌的抗生素耐药性正愈发成为紧迫的医学问题。金黄色葡萄球菌的甲氧西林耐药性正在接近流行水平(chambers和deleo，supra；grundmann等人，2006.lancet 368:874-885)。据估计，2005年美国发生了94,360例侵袭性mrsa感染，并且这些感染与18,650例死亡有关(klevens等人，2007.jama 298:1763-1771)。尽管表皮葡萄球菌是正常人类上皮细菌群的一部分，但它会在皮肤或黏膜损伤时引起感染。
[0371]
有效抵抗细菌繁殖并因此可以与本发明的fc变体缀合的示例性治疗剂是：β内酰胺类，诸如青霉素类(penicillins)(例如，青霉素g(penicillin g)、青霉素v(penicillin v)、甲氧西林(methicillin)、苯唑西林(oxacillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、萘夫西林(nafcillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿莫西林(amoxicillin)、羧苄西林(carbenicillin)、替卡西林(ticarcillin)、美洛西林(mezlocillin)、哌拉西林(piperacillin)、阿洛西林(azlocillin)和替莫西林(temocillin))、头孢菌素类(cephalosporins)(例如，cepalothin、头孢匹林(cephapirin)、头孢拉定(cephradine)、头孢噻啶(cephaloridine)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢孟多(cefamandole)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢氨芐(cephalexin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢克洛(cefaclor)、氯碳头孢(loracarbef)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢美唑(cefmetazole)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢克肟(cefixime)、头孢泊肟(cefpodoxime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢地尼(cefdinir)、头孢匹罗(cefpirome)、头孢吡肟(cefepime)、bal5788和bal9141)、碳青霉烯类(例如，亚胺培南(imipenem)、厄他培南(ertapenem)和美罗培南(meropenem))和单内酰环类(monobactams)
(例如，氨曲南(aztreonam))；β内酰胺酶抑制剂(例如，克拉维酸盐(clavulanate)、舒巴坦(sulbactam)和他唑巴坦(tazobactam))；氨基糖苷类(例如，链霉素(streptomycin)、新霉素(neomycin)、卡那霉素(kanamycin)、巴龙霉素(paromomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、庆大霉素(gentamicin)、妥布霉素(tobramycin)、阿米卡星(amikacin)、奈替米星(netilmicin)、奇霉素(spectinomycin)、西索米星(sisomicin)、地贝卡星(dibekalin)和异帕米星(isepamicin))；四环素类(tetracyclines)(例如，四环素(tetracycline)、金霉素(chlortetracycline)、地美环素(demeclocycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素(oxytetracycline)、美他环素(methacycline)和多西环素(doxycycline))；大环内酯类(例如，红霉素(erythromycin)、阿奇霉素(azithromycin)和克拉霉素(clarithromycin))；酮内酯类(例如，泰利霉素(telithromycin)、abt-773)；林可酰胺类(lincosamides)(例如，林可霉素(lincomycin)和克林霉素(clindamycin))；糖肽类(例如，万古霉素、奥利万星(oritavancin)、达巴万星(dalbavancin)和替考拉宁(teicoplanin))；链阳霉素类(streptogramins)(例如，奎奴普汀(quinupristin)和达福普汀(dalfopristin))；磺胺类(例如，磺胺、对氨基苯甲酸、磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑和酞酰磺胺噻唑)；恶唑烷酮类(例如，利奈唑胺(linezolid))；喹诺酮类(quinolones)(例如，萘啶酸、恶喹酸、诺氟沙星(norfloxacin)、培氟沙星(pefloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、环丙沙星(ciprofloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、多氟沙星(fleroxacin)、戈帕沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、克林沙星(clinafloxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)和西他沙星(sitafloxacin))；甲硝唑；达托霉素(daptomycin)；加雷沙星(garenoxacin)；雷莫拉宁(ramoplanin)；法罗培南(faropenem)；多黏菌素(polymyxin)；替加环素(tigecycline)、azd2563；以及甲氧苄啶(trimethoprim)。
[0372]
本文所述的方法包括，例如，防御或治疗受试者中的感染(例如，细菌感染)的方法以及防止、稳定或抑制感染病原体(例如，细菌)的生长的方法。治疗受试者的感染(例如，细菌感染)的方法包括向受试者施用本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)、本文所述的融合蛋白或其药物组合物。在一些实施方案中，细菌感染是由细菌的耐药株引起的。防止、稳定或抑制细菌生长或防止细菌复制和扩散的方法包括使细菌或易受细菌生长影响的部位与本文所述的缀合物(例如，式(1)中的任一种的缀合物)或其药物组合物接触。
[0373]
此外，本文所述的方法还包括防御或治疗受试者的细菌感染的方法，其通过向受试者施用本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)或本文所述的融合蛋白与第二治疗剂(诸如抗细菌剂)的组合来实现。
[0374]
真菌感染
[0375]
本文所述的化合物和药物组合物(例如，式(1)的缀合物或本文所述的融合蛋白)可以用于治疗真菌感染。
[0376]
真菌感染是指真菌(例如，毛癣菌属物种(例如，阿耶洛毛癣菌、同心圆毛癣菌、马毛癣菌、意瑞奈斯毛癣菌、淡黄毛癣菌、光辉毛癣菌、趾间毛癣菌、麦格尼毛癣菌、下颔毛癣菌、豆形毛癣菌、红色毛癣菌、许兰毛癣菌、猴毛癣菌、苏丹奈斯毛癣菌、土毛癣菌、断发毛癣菌、范布鲁西米氏毛癣菌、疣状毛癣菌、紫色毛癣菌或赤非毛癣菌)、表皮癣菌属物种(例如，
絮状表皮癣菌或斯托克表皮癣菌)、念珠菌属物种(例如，白色念珠菌、近平滑念珠菌、克鲁斯念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、葡萄牙念珠菌、乳酒念珠菌、高里念珠菌或都柏林念珠菌)、小孢子菌属物种(例如，犬小孢子菌、石膏样小孢子菌、奥杜盎小孢子菌、鸡小孢子菌、铁锈色小孢子菌、扭曲小孢子菌、矮小小孢子菌、库克小孢子菌或范布瑞西米小孢子菌)、附球菌属物种(例如，黑附球菌)、曲霉属物种(例如，聚多曲霉、土曲霉、黑曲霉、土曲霉、烟曲霉、黄曲霉、棒曲霉、灰带蓝曲霉群、构巢曲霉、米曲霉、土曲霉、焦曲霉或杂色曲霉)、拟青霉属物种(例如，淡紫拟青霉或宛氏拟青霉)、镰刀菌属物种(例如，尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌或半裸镰刀菌)、顶孢霉属物种(例如，枝顶孢霉、a.roseogiseum、瓜顶孢霉、基利顶孢霉、弯曲顶孢霉、a.comptosporum、纸细基孢菌、芳香顶孢霉或小翅孢壳)、毛壳菌属物种(例如，c.atrobrunneum、粪生毛壳菌、球毛壳菌或瘤突毛壳菌)、茎点霉属物种、帚霉属物种(例如，短柄帚霉、念珠帚霉、康氏帚霉、顶孢帚霉、黄帚霉、灰质帚霉、s.trigonospora、布朗氏帚霉、s.chartarum、暗色帚霉或s.asperula)、链格孢属物种(例如，互隔链格孢、纸链格孢、石竹链格孢、a.geophilia、感染链格孢、匍柄链格孢或极细链格孢)以及弯孢霉属物种(例如，短孢弯孢霉、棒状弯孢霉、膝弯孢霉、新月弯孢霉、苍白弯孢霉、塞内加尔弯孢霉或疣状弯孢霉))在宿主生物体(例如，人受试者)中的病原性生长。真菌感染可以是一种或多种真菌群体的存在对宿主身体造成损害的任何情况。因此，当受试者的体内或体表上存在过量的真菌群体时，或当一种或多种真菌群体的存在对受试者的细胞或其他组织造成损害时，受试者正患有真菌感染。
[0377]
真菌引起很多种人类疾病。虽然一些真菌引起的感染仅限于皮肤和毛发的最外层(浅表真菌病)，但其他真菌通过穿透皮肤、毛发和指甲的角化层并触发宿主的病理变化而引起皮肤真菌病。皮下真菌病引起真皮、皮下组织、肌肉和筋膜感染，并且往往是慢性的。全身性真菌病主要起源于肺，并且可引起体内其他器官系统的继发感染。免疫系统有缺陷的患者往往容易患有机会性真菌病。
[0378]
包括红色毛癣菌(trichophyton rubrum)和下颌毛癣菌(trichophyton mentagrophytes)在内的皮癣菌是皮肤真菌感染或一种或多种皮肤癣菌病(皮肤癣菌病)的原因。足癣是皮肤感染，最常出现在脚趾之间，引起受影响的皮肤脱屑、剥落和瘙痒。还可能出现水泡和皮肤破裂，导致原始组织暴露、红斑、疼痛、肿胀和炎症。第二种类型的足癣称为莫卡辛(moccasin)足癣并且特征在于可能无症状或瘙痒(例如，不适、刺激感)的、伴有轻微脱屑至弥漫性角化过度的慢性足底红斑。其他类型包括炎症性/水疱性和溃疡性足癣。感染可扩散至身体的其他部位，并且表现为以下的形式：躯干和手臂以及腿上的具有凸起边缘、脓疱和囊泡的环状鳞状斑块(体癣)、手掌和指蹼的鳞状疹(手癣)、腹股沟和耻区的红斑病变(股癣)、胡须和颈部区域的红斑、脱屑和脓疱(须癣或面癣)或头皮的圆形、秃顶、鳞状斑块(头癣)。花斑癣，也称为花斑糠疹，是常见的皮肤真菌感染，其干扰皮肤的正常色素沉积，导致小而变色的斑块。甲癣是指甲的皮癣菌感染的另一个术语。继发细菌感染可由真菌感染发展而来。
[0379]
癣很常见，尤其是在儿童中，并且可通过皮肤接触传播，以及通过接触诸如发刷的被污染物品或通过与受感染个体使用同一个马桶座圈传播。癣很容易传播，因为那些感染者甚至在出现疾病症状之前就具有传染性。接触性运动(诸如摔跤)的参与者具有通过皮肤接触患上真菌感染的风险。
[0380]
癣具有轻度传染性。癣在家畜，尤其是农场动物、狗和猫以及甚至仓鼠或豚鼠等小型宠物中也是一种常见感染。当人类与这些动物密切接触时，人类会从这些动物中接触到癣(通常也称为“环癣”)。癣也可以通过直接接触和长时间接触脱落的皮肤碎片(例如，来自共用衣服或室内灰尘)从其他人身上感染。
[0381]
人的癣的最知名的迹象是出现一个或多个边缘明确的、红色凸起的瘙痒斑块，与玫瑰糠疹的先兆皮疹相似。这些斑块的中心往往较浅，外表呈环状，周围有由黑色素增加引起的色素沉着过度。如果感染区域涉及头皮或胡须区域，则可能出现清楚的秃斑。受影响的区域可能在一段时间内变得发痒。
[0382]
癣感染有时可能引起远离实际感染的身体部位的皮肤病变。这种病变称为“癣菌疹”。病变本身不含真菌，并且通常在治疗实际感染后消失。最常见的实例是由足部真菌感染导致的手部皮疹。癣菌疹本质上是对真菌的普遍过敏反应。
[0383]
因此，真菌和酵母菌，诸如小孢癣菌种、毛癣菌种、表皮癣菌种和念珠菌种，会引起持续性的且难以治疗的感染。
[0384]
小孢癣菌种包括犬小孢子菌和石膏样小孢子菌。小孢癣菌是引起皮肤癣菌病的若干真菌属之一。皮肤癣菌病是用于定义由任何皮癣菌种引起的毛发、皮肤或指甲感染的通用术语。与其他皮癣菌类似，小孢癣菌具有降解角蛋白的能力，并因此可以驻留在皮肤及其附属物上并且保持非侵袭性。值得注意的是，小孢癣菌种主要感染毛发和皮肤。犬小孢子菌是狗猫的环癣的主要原因，并且是引起人类散发性皮肤癣菌病(尤其是具有猫和狗在的儿童的头癣)的嗜动物真菌物种。
[0385]
毛癣菌种引起的皮肤感染主要发生在颈后部、头皮或胡须上。毛癣菌种感染的症状包括发炎的头皮病变、发炎的颈部病变、发炎的胡须病变、疤痕和永久性脱发。毛癣菌种的实例包括红色毛癣菌、断发毛癣菌和下颌毛癣菌。
[0386]
断发毛癣菌是在欧洲、南美和美国引起流行性皮肤癣菌病的嗜人发内真菌物种。它感染一些动物并且需要硫胺素才能生长。它是美国头癣最常见的原因，在皮肤表面的毛发脱落处形成黑点。红色毛癣菌是真菌，它是足癣(“运动员脚”)、股癣和癣(环癣)的最常见原因。红色毛癣菌是引起手指甲真菌感染的最常见的皮癣菌。大多数真菌性皮肤感染具有刺激性并难以治疗，有报道称真菌感染会导致死亡。具体地，下颌毛癣菌皮肤感染迁移到淋巴结、睾丸、脊椎和cns。使用灰黄霉素(griseofulvin)、两性霉素b(amphotericin b)、克霉唑(clotrimazole)和转移因子治疗失败，最终导致受试者死亡(hironaga等人，j.clin.microbiol.,2003；5298-5301.)。下颌毛癣菌是由皮癣菌群引起的真菌性指甲感染的第二常见的来源。
[0387]
表皮癣菌属含有两个物种：絮状表皮癣菌和斯托克表皮癣菌。已知斯托克表皮癣菌是非病原性的，因此絮状表皮癣菌是引起人类感染的唯一物种。絮状表皮癣菌是其他健康个体的皮肤癣菌病的常见原因之一。它感染皮肤(体癣、股癣、足癣)和指甲(甲癣)。由于真菌缺乏穿透具有免疫活性的宿主的活组织的能力，因此感染仅限于表皮的无生命角质层。由于感染仅限于角化组织，因此由任何皮癣菌引起的播散性感染都不太可能发生。
[0388]
然而，有报告称患有白塞氏综合征(behcet's syndrome)的免疫失能的患者中出现了侵袭性絮状表皮癣菌感染。与所有形式的皮肤癣菌病一样，絮状表皮癣菌感染具有传染性并通常通过接触传播，特别是在常见的淋浴间和健身设施中传播。
[0389]
念珠菌种包括白色念珠菌、近平滑念珠菌和克氏念珠菌。患有慢性皮肤黏膜念珠菌病的患者可能发生指甲念珠菌感染。念珠菌种可侵入先前因感染或创伤而受损的指甲，并引起甲周区域和甲床下方的感染。甲襞出现红斑、肿胀和压痛，偶尔有分泌物。该疾病引起角质层丧失、指甲营养不良和甲剥离，外侧甲襞周围变色。在所有形式的甲癣中，指甲都会变得各种变形和歪曲。
[0390]
本文所述的方法还包括防御或治疗受试者的真菌感染的方法，其通过向受试者施用本文所述的组合物(例如，式(1)的缀合物)或本文所述的融合蛋白与抗病毒剂的组合来实现。
[0391]
vi.药物组合物
[0392]
可以将包含变体fc结构域(例如，本文所述的缀合物或融合蛋白)的组合物配制在药物组合物中以用于本文所述的方法。在一些实施方案中，可仅将本文所述的缀合物或融合蛋白配制在药物组合物中。在一些实施方案中，可将本文所述的缀合物或融合蛋白与抗病毒剂、抗病毒疫苗、抗真菌剂、抗细菌剂或用于治疗病症的治疗剂组合配制在药物组合物中。在一些实施方案中，药物组合物包括本文所述的缀合物(例如，式(1)所述的缀合物)或本文所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体和赋形剂。
[0393]
药物组合物中的可接受的载体和赋形剂在采用的剂量和浓度下对接受者无毒。可接受的载体和赋形剂可包括：缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐、hepes和tae；抗氧化剂，诸如抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂，诸如氯化六烃季铵、十八烷基二甲基苄基氯化铵、间苯二酚和苯扎氯铵；蛋白质，诸如人血清白蛋白、明胶、葡聚糖和免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸残基，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、组氨酸和赖氨酸；以及碳水化合物，诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖和山梨醇。
[0394]
其他赋形剂的实例包括但不限于：抗粘附剂、粘合剂、包衣剂、压缩助剂、崩解剂、染料、润肤剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣剂、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、吸附剂、悬浮剂或分散剂或甜味剂。示例性赋形剂包括但不限于：丁基化羟基甲苯(bht)、碳酸钙、磷酸钙(二元)、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸丙酯、棕榈酸视黄酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、淀粉乙醇酸钠、山梨醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、硬脂酸、蔗糖、滑石粉、二氧化钛、维生素a、维生素e、维生素c和木糖醇。
[0395]
本文所述的缀合物或融合蛋白可具有可电离的基团，以便能够被制备为药学上可接受的盐。这些盐可以是涉及无机或有机酸的酸加成盐，或者在酸性形式的本文的缀合物的情况下所述盐可由无机或有机碱制备。经常将所述缀合物或融合蛋白制备为或用作作为药学上可接受的酸或碱的加成产物制备的药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的酸和碱是本领域众所周知的，诸如用于形成酸加成盐的盐酸、硫酸、氢溴酸、乙酸、乳酸、柠檬酸或酒石酸，以及用于形成碱性盐的氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化铵、咖啡因、各种胺等。用于制备适当的盐的方法在本领域中确立已久。
[0396]
代表性的酸加成盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、
环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括但不限于：钠、锂、钾、钙和镁，以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺。
[0397]
根据施用途径和剂量，用于本文所述的方法的本文的缀合物或其药物组合物将被配制成合适的药物组合物，以允许容易递送。缀合物(例如，式(1)的缀合物)或其药物组合物可被配制成通过肌肉内施用、静脉内施用(例如，作为无菌溶液并且以适合于静脉内使用的溶剂体系)、真皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病灶内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用(topically)、肿瘤内施用、腹膜施用、皮下施用、结膜下施用、囊内施用(intravesicularlly)、黏膜施用、心包内施用、脐内施用、眼内施用、经口施用(例如，片剂、胶囊、囊片、胶囊锭(gelcap)或糖浆)、表面施用(topically)(例如，作为霜剂、凝胶、洗剂(lotion)或膏剂)、局部施用(locally)、通过吸入施用、通过注射施用或通过输注施用(例如，连续输注、直接浸润靶细胞的局部灌注、导管、灌洗、以膏药(cremes)或脂质组合物)。根据施用途径，本文所述的缀合物或其药物组合物可以是例如片剂、胶囊、药丸、粉剂、颗粒、混悬液、乳剂、溶液、包括水凝胶的凝胶、糊剂、膏剂、霜剂、膏药(plaster)、药膏(drench)、渗透递送装置、栓剂、灌肠剂、注射剂、植入物、喷雾剂、适合于离子电渗递送的制备物(preparation)，或气雾剂的形式。可根据常规医药实践来配制组合物。
[0398]
本文所述的组合物可以以本领域已知的多种方式配制。为了用作人和动物受试者的治疗剂，本文所述的缀合物可以被配制为药物或兽药组合物。根据待治疗的受试者(例如，人受试者)、施用模式和期望的治疗类型(例如，预防或治疗)，以与这些参数相符的方式配制本文所述的缀合物。此类技术的总结可见于remington:the science and practice of pharmacy,22nd edition,lippincott williams&wilkins(2012)；和encyclopedia of pharmaceutical technology,4th edition,j.swarbrick和j.c.boylan,marcel dekker,new york(2013)，所述文献各自以引用方式并入本文。
[0399]
可以适合于全身施用或表面(topical)或局部(local)施用的方式制备制剂。全身性制剂包括被设计用于注射(例如，肌肉内、静脉内或皮下注射)的那些制剂，或者可以被制备成用于经皮、透粘膜或经口施用。所述制剂将一般包括稀释剂，以及在一些情况下，佐剂、缓冲液和防腐剂。所述缀合物也可以以脂质体组合物的形式或作为微乳剂施用。全身性施用也可包括相对无创的方法，诸如使用栓剂、透皮贴剂、透粘膜递送和鼻内施用。经口施用也适用于本文的缀合物。如本领域所理解的，合适的形式包括糖浆、胶囊和片剂。
[0400]
所述药物组合物可以以可注射制剂的形式肠胃外施用。用于注射的药物组合物可以使用无菌溶液或任何药学上可接受的液体作为媒介物来配制。制剂可被制备为适合于在注射之前在液体中溶解或悬浮的固体形式，或者可被制备为乳剂。药学上可接受的媒介物包括但不限于无菌水、生理盐水和细胞培养基(例如，dulbecco's改良eagle培养基(dmem)、
α-改良eagles培养基(α-mem)、f-12培养基)。此类可注射的组合物还可含有一定量的无毒辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、ph缓冲剂，诸如乙酸钠和脱水山梨糖醇单月桂酸酯。配制方法是本领域已知的，参见，例如，pharmaceutical preformulation and formulation,2nd edition,m.gibson,taylor&francis group,crc press(2009)。
[0401]
所述药物组合物可以以经口制剂的形式制备。用于经口使用的制剂包括含有与无毒的药学上可接受的赋形剂混合的一种或多种活性成分的片剂。这些赋形剂可以是例如惰性稀释剂或填充剂(例如，蔗糖、山梨醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包括马铃薯淀粉的淀粉、碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠)；制粒剂和崩解剂(例如，包括微晶纤维素的纤维素衍生物、包括马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、藻酸盐或藻酸)；粘合剂(例如，蔗糖、葡萄糖、山梨醇、阿拉伯胶、海藻酸、藻酸钠、明胶、淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、硅酸铝镁、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇)；以及润滑剂、助流剂和抗粘剂(例如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。用于经口使用的制剂还可作为以下提供：可咀嚼片剂；或硬质明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合在一起；或软质明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合在一起。粉剂、颗粒剂和球剂(pellet)可使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥装备来制备。
[0402]
用于经口制剂的其他药学上可接受的赋形剂包括但不限于着色剂、调味剂、增塑剂、保湿剂和缓冲剂。用于经口使用的制剂还可作为以下提供：可咀嚼片剂；或硬质明胶胶囊，其中活性成分与惰性固体稀释剂(例如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合在一起；或软质明胶胶囊，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合在一起。粉剂、颗粒剂和球剂(pellet)可使用上文在片剂或胶囊下提到的成分以常规方式使用例如混合器、流化床设备或喷雾干燥装备来制备。
[0403]
本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)或其药物组合物的溶出或扩散受控释放可以通过对缀合物的片剂、胶囊、球剂或颗粒制剂进行适当地包衣，或通过将缀合物掺入到适当的基质中来实现。受控释放包衣可包括一种或多种上文提到的包衣物质和/或例如虫胶、蜂蜡、糖蜡(glycowax)、蓖麻蜡、巴西棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油酯、二硬脂酸甘油酯、棕榈硬脂酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸纤维素、聚氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯、聚甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸甲酯、2-羟基甲基丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1,3-丁二醇、甲基丙烯酸乙二醇酯和/或聚乙二醇。在受控释放基质制剂中，基质材料还可包括例如水合的甲基纤维素、巴西棕榈蜡和硬脂醇、卡波姆934(carbopol 934)、硅酮、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯、聚乙烯和/或卤代碳氟化合物。
[0404]
所述药物组合物可根据需要以单位剂型形成。包括在所述药物组合物中的活性组分(例如，本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物))的量使得提供了在指定范围内的合适剂量(例如，在0.01至100mg/kg体重范围内的剂量)。
[0405]
vii.施用途径和剂量
[0406]
在本文所述的任何方法中，本文所述的组合物可通过用于治疗或防御感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染)，或用于防止、稳定或抑制感染(例如，病毒感染、真菌感染
或细菌感染)的增殖或扩散的任何适当的途径来施用。本文所述的组合物可与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起施用给人、家养宠物、牲畜或其他动物。在一些实施方案中，施用包括以以下方式施用本文所述的任何缀合物(例如，式(1)的缀合物)或组合物：肌肉内施用、静脉内施用(例如，作为无菌溶液并且以适合于静脉内使用的溶剂体系)、真皮内施用、动脉内施用、腹膜内施用、病灶内施用、颅内施用、关节内施用、前列腺内施用、胸膜内施用、气管内施用、鼻内施用、玻璃体内施用、阴道内施用、直肠内施用、表面施用(topically)、肿瘤内施用、腹膜施用、皮下施用、结膜下施用、囊内施用(intravesicularlly)、黏膜施用、心包内施用、脐内施用、眼内施用、经口施用(例如，片剂、胶囊、囊片、胶囊锭(gelcap)或糖浆)、表面施用(topically)(例如，作为霜剂、凝胶、洗剂(lotion)或膏剂)、局部施用(locally)、通过吸入施用、通过注射施用或通过输注施用(例如，连续输注、直接浸润靶细胞的局部灌注、导管、灌洗、以膏药(cremes)或脂质组合物)。在一些实施方案中，如果除了本文所述的缀合物之外还施用第二治疗剂，诸如抗病毒剂，则抗病毒剂或其药物组合物也可以以本文所述的任何施用途径施用。
[0407]
本文所述的组合物(例如，式(1)的缀合物)或其药物组合物的剂量取决于包括以下的因素：施用途径、待治疗的疾病(例如，感染(例如，病毒感染、真菌感染或细菌感染)的程度和/或病状)以及受试者的身体特征，例如，年龄、体重、一般健康状况。通常，单次剂量中含有的活性物质的量可以是有效防止、延迟或治疗病症而不引起显著毒性的量。药物组合物可包括剂量范围为0.01至500mg/kg(例如，0.01、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、150、200、250、300、350、400、450或500mg/kg)的本文所述的缀合物，并且在更具体的实施方案中，约0.1至约30mg/kg的本文所述的缀合物，并且在更具体的实施方案中，约1至约30mg/kg的本文所述的缀合物。在一些实施方案中，当将本文所述的缀合物(例如，式(1)的缀合物)与抗病毒剂或抗病毒疫苗组合施用(例如，基本上同时地以同一或分开的药物组合物施用，或分开地在同一个治疗方案中施用)时，本文所述的缀合物所需的剂量可比在治疗方案中仅使用所述缀合物的情况下所述缀合物所需的剂量少。
[0408]
可将本文所述的组合物(例如，式(1)的缀合物)或其药物组合物例如每日、每周、每月、每半年、每年一次或多次(例如，1至10次或更多次；1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次)或按医疗必要施用给有需要的受试者。剂量可以以单次或多次剂量方案提供。施用之间间隔的时间可随着医疗状况的改善而减少，或随着患者健康状况的衰退而增加。施用的剂量和频率可由医生根据常规因素(诸如感染的程度和受试者的不同参数)来调整。
[0409]
viii.组合疗法
[0410]
还应理解，本公开的缀合物、融合蛋白和组合物可以被配制在组合疗法中以及以组合疗法使用，即，缀合物、融合蛋白和药物组合物可以与一种或多种其他的期望的治疗剂或医疗程序一起配制，或者与所述一种或多种其他的期望的治疗剂或医疗程序同时施用、在此之前施用或在此之后施用。组合方案中所采用的疗法(治疗剂或程序)的特定组合将考虑到期望治疗剂和/或程序的相容性以及待实现的期望治疗效果。还应理解，所采用的疗法可能会对同一种病症达到期望效果，或者它们可能会达到不同的效果(例如，控制任何不利作用)。在优选的实施方案中，所述缀合物或融合蛋白与一种或多种其他的期望治疗剂被配制成分开的药物组合物(例如，被配制用于不同的施用途径)。在一些实施方案中，所述缀合
物或融合蛋白与一种或多种其他的期望治疗剂同时施用(例如，在基本上相同的时间，例如在5分钟内、30分钟内、1至6小时内、1至12小时内或1天内施用)或者顺序施用(例如，在不同的时间施用，诸如间隔超过1天)。如果顺序施用一种或多种其他的期望治疗剂与所述缀合物或融合蛋白，则所述一种或多种其他的期望治疗剂在施用所述缀合物或融合蛋白后被施用1至50次(例如，1至15次、10至25次、20至35次、30至45次或35至50次)(例如，在所述缀合物和融合蛋白后被施用1天、2天、5天、1周、2周、3周、1个月、2个月、6个月或12个月或更久)。
[0411]
抗病毒剂
[0412]
在一些实施方案中，一种或多种抗病毒剂可与本文所述的缀合物(例如，式(1)中的任一种的缀合物)或本文所述的融合蛋白组合施用。
[0413]
在一些实施方案中，抗病毒剂选自由以下组成的组：阿糖腺苷(vidarabine)、阿昔洛韦(acyclovir)、更昔洛韦(gancyclovir)、缬更昔洛韦(valgancyclovir)、核苷类似物逆转录酶抑制剂(例如，azt(齐多夫定(zidovudine))、ddi(地达诺新(didanosine))、ddc(扎西他滨(zalcitabine))、d4t(司他夫定(stavudine))或3tc(拉米夫定(lamivudine)))、非核苷逆转录酶抑制剂(例如，奈韦拉平(nevirapine)或地拉韦啶(delavirdine)、蛋白酶抑制剂(沙奎那维(saquinavir)、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)或奈非那韦(nelfinavir)、三氮唑核苷或干扰素)。前述清单意在举例说明本领域技术人员已知的用于治疗感染的抗病毒剂，而不意在限制本发明的范围。
[0414]
抗病毒疫苗
[0415]
在一些实施方案中，本文所述缀合物中的任一种(例如，式(1)的缀合物)与抗病毒疫苗(例如，引发受试者的直接针对病毒的免疫响应的组合物)组合施用。
[0416]
在一些实施方案中，病毒疫苗包括引发受试者的针对甲型、乙型、丙型流行性感冒病毒或副流感病毒的免疫响应的免疫原。在一些实施方案中，免疫原是灭活病毒(例如，疫苗是三价流行性感冒疫苗，其含有纯化的且灭活的材料甲型、乙型、丙型流行性感冒病毒或副流感病毒或它们的任何组合)。在一些实施方案中，疫苗作为肌内注射给予。在一些实施方案中，疫苗是含有已减毒(减弱)的活病毒的活病毒疫苗。在一些实施方案中，疫苗作为鼻喷剂施用。
[0417]
抗细菌剂
[0418]
在一些实施方案中，一种或多种抗细菌剂可与本文所述的缀合物(例如，式(1)中的任一种的缀合物)或本文所述的融合蛋白组合施用。
[0419]
抗细菌剂可选自由以下组成的组：阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、妥布霉素(tobramycin)、巴龙霉素(paromomycin)、链霉素(streptomycin)、奇霉素(spectinomycin)、格尔德霉素(geldanamycin)、除莠霉素(herbimycin)、利福昔明(rifaximin)、氯碳头孢(loracarbef)、厄他培南(ertapenem)、多尼培南(doripenem)、亚胺培南/西司他丁(imipenem/cilastatin)、美罗培南(meropenem)、头孢羟氨苄(cefadroxil)、头孢唑啉(cefazolin)、头孢噻吩(cefalotin)、头孢氨芐(cefalexin)、头孢克洛(cefaclor)、头孢孟多(cefamandole)、头孢西丁(cefoxitin)、头孢丙烯(cefprozil)、头孢呋辛(cefuroxime)、头孢克肟(cefixime)、头孢地尼(cefdinir)、头孢托仑(cefditoren)、头孢哌酮(cefoperazone)、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢泊肟
(cefpodoxime)、头孢他啶(ceftazidime)、头孢布烯(ceftibuten)、头孢唑肟(ceftizoxime)、头孢曲松(ceftriaxone)、头孢吡肟(cefepime)、头孢洛林(ceftaroline fosamil)、头孢比普(ceftobiprole)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、替拉万星(telavancin)、达巴万星(dalbavancin)、奥利万星(oritavancin)、克林霉素(clindamycin)、林可霉素(lincomycin)、达托霉素(daptomycin)、阿奇霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、泰利霉素(telithromycin)、螺旋霉素(spiramycin)、氨曲南(aztreonam)、呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、利奈唑胺(linezolid)、泊唑利德(posizolid)、雷得唑来(radezolid)、特地唑胺(torezolid)、阿莫西林(amoxicillin)、氨苄西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、甲氧西林(methicillin)、萘夫西林(nafcillin)、苯唑西林(oxacillin)、青霉素g(penicillin g)、青霉素v(penicillin v)、哌拉西林(piperacillin)、青霉素g(penicillin g)、替莫西林(temocillin)、替卡西林(ticarcillin)、阿莫西林克拉维酸盐(amoxicillin clavulanate)、氨苄西林/舒巴坦(ampicillin/sulbactam)、哌拉西林/他唑巴坦(piperacillin/tazobactam)、替卡西林/克拉维酸盐(ticarcillin/clavulanate)、杆菌肽(bacitracin)、黏菌素(colistin)、多黏菌素b(polymyxin b)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、吉米沙星(gemifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、萘啶酸(nalidixic acid)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、戈帕沙星(grepafloxacin)、司帕沙星(sparfloxacin)、替马沙星(temafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺嘧啶(sulfadiazine)、磺胺嘧啶银(silver sulfadiazine)、磺胺二甲氧嘧啶(sulfadimethoxine)、磺胺甲噻二唑(sulfamethizole)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、磺胺(sulfanilimide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异恶唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(trimethoprim-sulfamethoxazole(tmp-smx))、2,4-二氨基偶氮苯-4-磺酰胺(sulfonamidochrysoidine)、地美环素(demeclocycline)、多西环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、土霉素(oxytetracycline)、四环素(tetracycline)、氯法齐明(clofazimine)、氨苯砜(dapsone)、卷曲霉素(capreomycin)、环丝氨酸(cycloserine)、乙胺丁醇(ethambutol(bs))、乙硫异烟胺(ethionamide)、异烟肼(isoniazid)、吡嗪酰胺(pyrazinamide)、利福平(rifampicin)、利福布汀(rifabutin)、利福喷丁(rifapentine)、链霉素(streptomycin)、洒尔佛散(arsphenamine)、氯霉素(chloramphenicol)、磷霉素(fosfomycin)、夫西地酸(fusidic acid)、甲硝唑(metronidazole)、莫匹罗星(mupirocin)、平板霉素(platensimycin)、奎奴普汀/达福普汀(quinupristin/dalfopristin)、甲砜霉素(thiamphenicol)、替加环素(tigecycline)、替硝唑(tinidazole)以及甲氧苄啶(trimethoprim)。前述列表意在举例说明本领域技术人员已知的用于治疗感染的抗细菌剂，而不意在限制本发明的范围。
[0420]
抗真菌剂
[0421]
在一些实施方案中，一种或多种抗真菌剂可与本文所述的缀合物(例如，式(1)中的任一种的缀合物)或本文所述的融合蛋白组合施用。
[0422]
在上述用于治疗有需要的受试者的感染的组合疗法的一些实施方案中，抗真菌剂选自由以下组成的组：瑞沙芬净(rezafungin)、两性霉素b(amphotericin b)、杀念菌素(candicidin)、菲律平(filipin)、哈霉素(hamycin)、纳他霉素(natamycin)、制霉菌素(nystatin)、龟裂杀菌素(rimocidin)、联苯苄唑(bifonazole)、布康唑(butoconazole)、克霉唑(clotrimazole)、益康唑(econazole)、芬替康唑(fenticonazole)、异康唑(isoconazole)、酮康唑(ketoconazole)、卢立康唑(luliconazole)、咪康唑(miconazole)、奥莫康唑(omoconazole)、奥昔康唑(oxiconazole)、舍他康唑(sertaconazole)、硫康唑(sulconazole)、噻康唑(tioconazole)、三唑(triazoles)、阿巴康唑(albaconazole)、艾非康唑(efinaconazole)、氟环唑(epoxiconazole)、氟康唑(fluconazole)、艾沙康唑(isavuconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(posaconazole)、丙环唑(propiconazole)、拉伏康唑(ravuconazole)、特康唑(terconazole)、伏立康唑(voriconazole)、噻唑(thiazoles)、阿巴芬净(abafungin)、阿莫罗芬(amorolfin)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)、阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)、环吡酮(ciclopirox)、氟胞嘧啶(flucytosine)、灰黄霉素(griseofulvin)、托萘酯(tolnaftate)以及十一碳烯酸(undecylenic acid)。前述清单意在举例说明本领域的技术人员已知的用于治疗感染的抗真菌剂，而不意在限制本发明的范围。
[0423]
实施例
[0424]
提出以下实施例以便为本领域的普通技术人员提供本文所述的组合物和方法可如何使用、制备和评价的描述，并且意图纯粹是对本发明的举例说明且不意图限制本发明人所认定的发明范围。
[0425]
实施例1.合成叠氮基-fc的一般程序
[0426]
在dmf/pbs中制备peg4-叠氮基nhs酯溶液(0.050m)：在0℃下将16.75mgpeg4-叠氮基nhs酯溶解在0.100ml的dmf中，并通过在0℃下添加pbs 1x缓冲液稀释至0.837ml。通过调整此peg4-叠氮基nhs酯pbs溶液的当量，使用此溶液制备具有各种dar值的其他peg4-叠氮基fc。
[0427]
预处理h-igg1 fc(107.2mg在8.800ml的ph 7.4pbs中，mw～57891da，1.852μmol)：将fc溶液转移到四个离心浓缩器(30,000mwco，15ml)中并使用pbs x1缓冲液稀释至15ml并浓缩至～1.5ml的体积。将残余物在pbs ph7.4中以1:10稀释，并再次浓缩。将此洗涤程序重复总共四次，然后稀释至8.80ml。
[0428]
制备peg4-叠氮基fc：将0.050m的peg4-叠氮基nhs酯pbs缓冲溶液(0.593ml，29.6μmol，16当量)添加到上面的h-igg1 fc溶液(seq id no:21；c末端lys在表达后被蛋白水解切割，并且混合物在环境温度下被旋转摇动2小时)中。通过使用四个离心浓缩器(30,000mwco，15ml)将溶液浓缩至～1.5ml的体积。将粗混合物在pbs ph 7.4中以1:10稀释，并再次浓缩。将此洗涤程序重复总共三次。将浓缩的fc-peg4-叠氮化物用ph 7.4pbs缓冲液稀释至8.80ml，并准备用于点击缀合。使用nanodrop
tm uv可见分光光度计(使用基于h-igg1的氨基酸序列的计算的消光系数)对纯化的材料进行量化。纯化后的产量是定量的。
[0429]
实施例2.缀合物1(包括c220s/m252y/s254t/t256e突变的fc结构域)的合成
[0430]
制备点击试剂溶液：0.0050m在pbs缓冲溶液中的cuso4：将10.0mg cuso4溶解在12.53ml pbs中，然后取5.00ml的该cuso4溶液并添加43.1mg bttaa(cas#1334179-85-9)和247.5mg抗坏血酸钠，从而得到点击试剂溶液(0.0050m cuso4，0.020m bttaa和0.25m抗坏血酸钠)。
[0431]
向15ml离心管中的叠氮基官能化fc溶液(实施例1；65.5mg，10.0ml，1.13μmol，叠氮基dar～5.9，seq id no:10)中加入炔烃衍生的小分子病毒抑制剂(每个fc叠氮基22.7mg，15.2μmol，3.0当量)。轻轻搅拌以溶解所有固体后，用点击试剂溶液(1.80ml)处理混合物。将所得混合物在环境温度下旋转12小时。通过对蛋白a柱进行亲和色谱法来纯化混合物，然后进行尺寸排阻色谱法。纯化的最终产物的maldi tof分析得到的平均质量为66,420da(dar＝5.8)。产量为57mg，纯度为98％。
[0432]
实施例3.缀合物2(包括c220s突变的fc结构域)的合成
[0433]
通过peg4-叠氮基-fc(seq id no:21，如实施例1中制备)和小分子病毒抑制剂以与制备缀合物1(实施例2)的方式类似的方式制备此缀合物。纯化的最终产物的maldi tof分析得到的平均质量为62,927da(dar＝4.2)。
[0434]
实施例4.静脉施用缀合物1和缀合物2后30天的比较性非人灵长类动物pk研究
[0435]
使用5至9岁、体重范围为3.5至8.5kg的雄性和雌性食蟹猕猴通过bts研究(san diego,ca)执行非人灵长类(nhp)pk研究。给nhp静脉内注射2mg/kg的测试制品(0.4ml/kg剂量体积)。将动物在iacuc批准的标准饲养条件下饲养。在适当的时间对动物进行非终末采血(通过股静脉或头静脉)，将血液收集在k2edta管中以防止凝固。将收集的血液离心(2,000x g，10分钟)并取出血浆，以用于分析测试制品随时间推移的浓度。通过夹心elisa测量每个时间点时缀合物1(c220s/m252y/s254t/t256e)和缀合物2(c220s)的血浆浓度。简而言之，将测试制品捕获在fc包被的板上，然后使用hrp缀合的抗人igg-fc抗体进行检测。使用缀合物1或缀合物2标准曲线的4pl非线性回归在graphpad prism中计算蛋白质浓度。比较缀合物1和缀合物2的曲线在图1中示出。与缀合物2的～10天的终末半衰期相比，缀合物1表现出显著改善的～45天的终末半衰期。缀合物1的auc比缀合物2的auc大2倍(表2)。
[0436]
表1.猕猴pk，缀合物1与缀合物2
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实施例5.缀合物2的血浆和上皮内衬液(elf)浓度的14天小鼠pk研究
[0440]
在研究开始前，允许来自charles river laboratories的雌性balb/c小鼠适应5天。每笼饲养3至6只动物，让其自由进食和饮水。按照neosome iacuc政策和指南执行所有程序。给小鼠皮下(sc)注射20mg/kg的测试制品(10ml/kg剂量体积)。在选定的时间点，通过吸入co2对3只小鼠实施安乐死。通过心脏穿刺将血液收集到k2edta管中以用于保存血浆。采血后，通过暴露气管、插入23g管连接头(tubing adaptor)并使用无菌1x pbs ph 7.4执行2x0.5ml冲洗来执行支气管肺泡灌洗(bal)。记录并保留回收的液体体积。一旦bal程序完成，就将肺去除、称重并在-80℃下储存。在-80℃储存样品之前，倾析出血浆和bal液体(balf)的等分试样以用于尿素定量分析。将收集的balf在室温下以12,000rpm离心5分钟以沉淀肺泡巨噬细胞，将沉淀和上清液均在-80℃下储存，直到运送给赞助商。如上文详细描述的那样通过间接elisa测量缀合物2在每个时间点的血浆浓度。简而言之，将缀合物2分子捕获在小分子病毒靶点包被的板上，然后使用hrp缀合的抗人igg fcγ特异性f(ab')2进行检测。对如上所述的那样收获的balf执行相同的elisa。使用缀合物2标准曲线的4pl非线性回归在graphpad prism中计算缀合物2血浆浓度。如前所述的那样，使用尿素作为稀释标记物来检测elf体积和elf中的缀合物2浓度(rennard等人，1986 j appl physiol 60:532-538)。比较缀合物2与elf水平的曲线在图2中示出。注射后2小时，缀合物2上皮内衬液(elf)水平为跨越剩余的时间过程的血浆暴露水平(auc)的～60％，这表明缀合物2几乎立即从血浆分配到肺中的elf(图2，表2)。
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表2. 2周中小鼠的缀合物2血浆和elf水平。
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实施例6.比较缀合物1和缀合物2的皮下施用的7天小鼠pk研究
[0444]
使用6周龄的雄性cd-1小鼠执行小鼠pk研究。小鼠用10mg/kg的测试制品(10ml/kg剂量体积)皮下注射。将动物在iacuc批准的标准饲养条件下饲养。在适当的时间对动物进行非终末采血(眼眶后、颊或尾静脉)，将血液收集在k2edta管中以防止凝结。将收集的血液离心(2,000x g，10分钟)并取出血浆，以用于分析测试制品随时间推移的浓度。如上文详细描述的那样通过间接elisa测量缀合物2在每个时间点的血浆浓度。简而言之，将缀合物2分子捕获在小分子病毒靶点包被的板上，然后使用hrp缀合的抗人igg fcγ特异性f(ab')2进行检测。使用缀合物2标准曲线的4pl非线性回归在graphpad prism中计算蛋白质浓度。比较缀合物2和缀合物1的7天pk特性的曲线在图3中示出。缀合物2(c220s)的血浆暴露水平比缀合物1(c220s/m252y/s254t/t256e)的血浆暴露水平大大约50％。与野生型人igg1相比，已知人igg1 yte fc变体的半衰期在小鼠中减少，这是由于在中性ph下小鼠fcrn结合增强，这否定了在酸性ph下与小鼠fcrn结合的改善(dall'acqua等人2002j immunol 169:5171-5180)。
[0445]
实施例7.比较具有不同分子量的fc的静脉施用的7天小鼠pk研究
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使用6周龄的雄性cd-1小鼠执行小鼠pk研究。给小鼠通过尾静脉静脉内(iv)注射5mg/kg的测试制品(5ml/kg剂量体积)。将动物在iacuc批准的标准饲养条件下饲养。在适当的时间对动物进行非终末采血(眼眶后、颊或尾静脉)，将血液收集在k2edta管中以防止凝结。将收集的血液离心(2,000x g，10分钟)并取出血浆，以用于分析测试制品随时间推移的浓度。如下通过fc捕获elisa来测量每个时间点的fc血浆浓度。在4℃下，将nunc maxisorp96孔板(目录号12-565-136，fisher scientific)用0.1μg/100μl/孔的在碳酸盐缓冲液(目录号c3041，milliporesigma)中的山羊抗人igg(fcγ片段特异性；目录号109-005-098，jackson immunoresearch)包被过夜。将板用300μl/孔的pbst洗涤5次，并在室温下用200μl/孔5％的在pbst中的脱脂奶粉(目录号9999s，cell signaling)在摇动下封闭1
小时。将血浆样品的三倍系列稀释液以100μl/孔铺板，并在室温下在摇动下孵育2小时(样品稀释剂：2.5％的在pbs中的脱脂奶粉，0.025％tween 20 幼稚小鼠血浆，最终浓度为1:900)。在每个板上一式两份运行0.03至55ng/ml的fc标准曲线。孵育2小时后，用300μl/孔的pbst洗涤板5次。然后使用100μl/孔的在样品稀释剂中以1:2000稀释的hrp缀合的抗人igg fc f(ab’)2(目录号709-036-098，jackson immunoresearch)在室温下在摇动下探测与板上的捕获抗体结合的测试制品(fc)1小时。然后将板在300μl/孔的pbst中洗涤8次，并用100μl/孔的tmb底物试剂(目录号555214，bd)显色7至8分钟。使用100μl/孔的1n h2so4终止反应，并使用enspire多模式读板仪(perkinelmer)在450nm处读取吸光度。在标准曲线的非线性回归分析(s型，4pl分析)之后，使用graphpad prism第8版对血浆样品中的测试制品进行插值。然后使用得到的平均血浆浓度来计算每个血浆浓度-时间曲线图的总auc。
[0447]
执行小鼠pk研究，以基于fc结构域单体的长度和分子量优化pk(通过减少清除来优化)(表3和表4以及图4和图5)。对于含有包含非种系氨基酸和c末端亲和标签的延长的n末端的更长的fc结构域(seq id no:53的fc结构域同源二聚体，mw：58,272da)，观察到更慢的清除。从fc结构域单体(seq id no:54的fc结构域同源二聚体，mw：53,743da)中去除潜在的免疫原性n末端延伸和c末端延伸导致更小的fc结构域，其可能通过肾过滤从小鼠血浆中被更快速地清除。为了改善pk参数以使其与在具有非内源性n末端和c末端延伸的更大的fc结构域中见到的参数更高度相似，将来自内源性igg1序列的6个氨基酸残基纳入在表现出改善的fc结构域pk参数(即，降低的清除)的fc结构域单体(seq id no:55的fc结构域同源二聚体，mw：55,031da)的n终端上，但fc n末端的伸长无法将pk值恢复到在纳入不期望的n末端标签和c末端标签的fc结构域(seq id no:53的fc结构域同源二聚体)中见到的值(数据在表3和图4中示出)。
[0448]
表3. 7天小鼠pk#19
[0449][0450]
seq id no:53：成熟人fc igg1，添加的n末端isamvrs氨基酸残基(斜体)，c末端g4s接头(斜体)，c末端myc标签(带下划线)，同种异型g1m(f)(粗斜体)
[0451][0452]
seq id no:54：成熟人fc igg1，添加的n末端isamvrs氨基酸残基(斜体)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)
[0453][0454]
seq id no:55：成熟人fc igg1，添加的n末端氨基酸残基(斜体)，铰链残基(斜体)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)
[0455][0456]
为了开发与具有与seq id no:53的fc的pk参数类似的pk参数的内源性igg1结构域更高度相似的新fc结构域，使用在n终端上纳入延伸到抗体的fab区中的内源性氨基酸的fc结构域单体(seq id no:56的fc结构域同源二聚体，mw：58,154da)来执行进一步的小鼠pk研究。研究证明，包括延伸到抗体的fab区中的氨基酸残基的fc结构域单体表现出令人惊讶的pk参数的改善(数据在表4和图5中示出)。总体而言，随着分子量增加，观察到血浆暴露水平的改善。具体而言，分子量为55,031da的fc结构域(seq id no:55的同源二聚体)的auc大于分子量为53,743da的fc结构域(seq id no:54的同源二聚体)。进一步地，添加产生分子量为58,154da的fc结构域(seq id no:56)的n末端fab残基进一步改善了fc结构域的auc。在fc结构域单体的n终端上纳入另外的fab残基被认为会引入不期望的特性(包括未配对的半胱氨酸、疏水区以及内源性fab区的二级结构)，这些可能对溶液性质造成负面影响并促进聚集，而不显著降低从血浆的清除。
[0457]
表4. 7天小鼠pk#22
[0458][0459]
seq id no:56：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0460]
seq id no:58：成熟人igg1 fc，cys至ser的取代(#)，m428l、n434s(粗体/带下划线)，同种异型g1m(fa)(粗斜体)，n末端fab残基带下划线，铰链残基为斜体
[0461]
再多了解一些
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