抑制ZD17-JNK相互作用作为急性心肌梗塞的疗法

抑制zd17-jnk相互作用作为急性心肌梗塞的疗法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月12日提交的美国临时专利申请序列号62/899,440的优先权。
技术领域
3.本公开大体涉及心脏保护，并且更具体地涉及使用多肽来治疗急性心肌梗塞。


背景技术：

4.急性心肌梗塞(ami)，通常称为心脏病发作，是一种危及生命的心血管疾病。在ami期间，由于冠状动脉阻塞，心脏的血液供应突然受到限制，这可能对心脏造成严重损害。ami每年在美国造成超过240万人死亡，在欧洲和北亚造成超过400万人死亡，并且在发达国家造成超过三分之一的死亡。(reed,g.w.,rossi,j.e.和cannon,c.p.急性心肌梗塞(acute myocardial infarction).lancet 389,197-210,doi:10.1016/s0140-6736(16)30677-8(2017))
5.据报道，使用当前的药物如阿司匹林、硝酸甘油和他汀类药物有助于降低ami的风险(参见例如ferreira,j.c.和mochly-rosen,d.circ j 76,15-21(2012)；dai,y.和ge,j.thrombosis 2012,245037,doi:10.1155/2012/245037(2012)；fung,v.等人,plos one 13,e0191817,doi:10.1371/journal.pone.0191817(2018))，但不能防止ami后心肌细胞的死亡。类似地，当前的手术方法如经皮冠状动脉介入和冠状动脉搭桥手术(perrier,s.等人,interact cardiovasc thorac surg 17,1015-1019,doi:10.1093/icvts/ivt381(2013))，可以帮助恢复向心脏的血液循环，但尚未报道在ami后具有心脏保护功效。
6.迄今为止，fda尚未批准用于ami的心脏保护药物。例如，环孢素是一种在多种动物ami模型中显示出潜在的心脏保护功效的小分子，但在人类临床试验中失败。(rahman,f.a.等人,环孢素在急性心肌梗塞中的功效和安全性：系统综述和荟萃分析(efficacy and safety of cyclosporine in acute myocardial infarction:a systematic review and meta-analysis).front pharmacol 9,238,doi:10.3389/fphar.2018.00238(2018))
7.尽管迄今为止在心脏保护治疗的发展方面取得了进展，但对于解决现有技术的上述问题和缺点仍有改进的空间。


技术实现要素：

8.本发明的一个目的是消除或减轻现有技术的上述缺点中的至少一个。
9.本发明的另一个目的是提供一种新型心脏保护疗法。
10.因此，在其一个方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中治疗与急性心肌梗塞(ami)相关或作为急性心肌梗塞(ami)的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
11.在其另一个方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中恢复ami后心脏功能的
方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
12.在其另一个方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中减少或预防ami引起的心脏功能丧失的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
13.在其另一个方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中减少ami引起的心脏组织梗塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
14.在其另一个方面，本公开提供了一种在有需要的受试者中保护心肌细胞免受ami引起的功能丧失的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
15.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中治疗与ami相关的疾病或病症的用途。
16.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中恢复ami后心脏功能的用途。
17.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中减少或预防ami引起的心脏功能丧失的用途。
18.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中减少ami引起的心脏组织梗塞的用途。
19.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中保护心肌细胞免受ami引起的功能丧失的用途。
20.在其另一个方面，本公开提供了一种包含nimoesh的多肽，其用于上述用途中的一种或多种。
21.因此，本发明人开发了一种用于受试者的心脏保护的新型疗法。这种心脏保护疗法可以在ami后提供以减少或预防ami引起的对心脏组织的损伤。特别是，通过使用这种疗法，可以保护心肌细胞免受ami引起的细胞死亡或功能丧失。此外，在ami后使用本发明疗法可以至少部分恢复心脏功能。本发明治疗用途可以提供现有药物和非药物治疗选择的替代方案，并且特别是作为ami后心脏保护的潜在疗法。
22.在阅读本说明书后，本发明的其他优点对于本领域技术人员将变得显而易见。
附图说明
23.将参照附图描述本发明的实施方式，其中相同的附图标记表示相同的部件，并且其中：
24.图1说明了nimoesh-tat肽对原代心肌细胞培养物免受h2o2引起的细胞损伤的保护作用。将10μm nimoesh-tat肽(30分钟预处理 12小时后处理)浴施用于经h2o2处理(300μm持续4小时)的原代心肌细胞培养物，并在h2o2处理后12小时使用多种细胞死亡测定来确定其保护功效：(a)mtt测定(对照：n＝3；h2o2：n＝6；h2o2 nimoesh-tat:n＝6；f(2,12)＝10.05，p《0.01)；(b)细胞凋亡测定(对照：n＝3；h2o2：n＝4；h2o2 nimoesh-tat:n＝6；f(2,10)＝56.67，p《0.001)；(c)培养基中的ck活性(对照：n＝3；h2o2：n＝6；h2o2 nimoesh-tat:n＝6；f(2,12)＝20.70，p《0.001)；(d)培养细胞中的mda活性(对照：n＝3；h2o2：n＝6；h2o2 nimoesh-tat:n＝6；f(2,12)＝19.28，p《0.001)；(e)培养基中的ldh活性(对照：n＝3；h2o2：n＝6；h2o2 nimoesh-tat：n＝6；f(2,12)＝16.10，p《0.001)；(f)培养细胞中的sod活性(对
照：n＝3；h2o2：n＝6；h2o2 nimoesh-tat：n＝6；f(2,12)＝13.42，p《0.01)。数据表示为平均值
±
s.e.m。各组间的统计差异由单因素方差分析(one-way anova)、接着lsd事后检验确定。*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001表示显著差异。n.s.表示不显著。
25.图2说明了nimoesh-tat肽对ami引起的心脏组织梗塞的保护作用。(a)新鲜大鼠心脏的ttc染色和(b)定量条形图，显示与生理盐水组相比，nimoesh-tat肽减少了ami后心脏组织梗塞的百分比(生理盐水组：n＝10；nimoesh-tat组：n＝11；t(19)＝3.71，p《0.01)。心脏组织梗塞区域在(a)中由虚线突出显示。对于(c)-(h)中的心脏功能分析：假手术组：n＝8；生理盐水组：n＝7；nimoesh-tat肽组：n＝8。在假手术或ami手术后，假手术组、生理盐水组和nimoesh-tat肽组在(c)心率(f(2,20)＝0.04，p＝0.96)和(d)收缩压(f(2,20)＝1.74，p＝0.20)方面不显示显著差异。与生理盐水组相比，nimoesh-tat肽治疗组有效挽救了ami引起的心脏功能丧失，如以下多种测定所表明：(e)左心室收缩压(f(2,20)＝5.09，p《0.05)；(f)左心室舒张末期压力(f(2,20)＝42.93，p《0.001)；(g) dp/dtmax(f(2,20)＝27.98，p《0.001)；(h)-dp/dtmax(f(2,20)＝7.34，p《0.01)。数据表示为平均值
±
s.e.m。(b)中各组间的统计学差异由非配对t检验确定。(c)-(h)中各组间的统计学差异通过单因素方差分析、接着lsd事后检验确定。**p《0.01和***p《0.001表示显著差异。n.s.表示不显著。
26.图3说明了nimoesh-tat肽对ami引起的心脏损伤和功能丧失的保护作用。与生理盐水对照(n＝5)相比，nimoesh-tat肽(n＝5)在猪中减少了ami引起的(c)每搏输出量(ami后：t(8)＝-7.04，p《0.001)和(d)射血分数(ami后：t(4)＝-4.31，p《0.05)的缺陷，但在(a)舒张末期容积(ami后：t(8)＝-1.71，p＝0.13)和(b)收缩末期容积(ami：t(8)＝1.30，p＝0.23)中并非如此。(e)量化条形图和(f)代表性ttc染色图像显示，与生理盐水相比，nimoesh-tat肽减少了猪中ami引起的心脏梗塞(t(8)＝4.57，p《0.01)。心脏组织梗塞区域在(f)中由虚线突出显示。(g)经nimoesh-tat肽治疗的猪心脏比生理盐水治疗的猪心脏显示更少的纤颤。(g)中的比例尺：200μm。数据表示为平均值
±
s.e.m。各组间的统计学差异通过非配对t检验确定。*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001表示显著差异。n.s.表示不显著。
27.图4说明了无偏倚的治疗和动物选择。在动脉闭塞前、动脉闭塞后和再灌注后，监测心率(a)、心电图(qrs持续时间(b)、qrs电压(c)、t电压(d)和st电压(e))以及体重(f)。病理性q波(b和c)、增加的t电压(d)和增加的st电压(e)表明猪的ami手术成功。两组猪对ami手术的反应几乎相同，表明无偏倚的治疗和动物选择。nimoesh-tat组：n＝5；生理盐水组：n＝5。数据表示为平均值
±
s.e.m。
具体实施方式
28.如本文所用，术语“nimoesh”是指以下氨基酸序列：waayrthsvd[seq id no:1]。
[0029]
本公开涉及在有需要的受试者中治疗作为急性心肌梗塞(ami)或与急性心肌梗塞(ami)相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。在本公开的一个方面，所述疾病或病症是ami。
[0030]
本公开还涉及一种在有需要的受试者中恢复ami后心脏功能的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
[0031]
本公开还涉及一种在有需要的受试者中减少或预防ami引起的心脏功能丧失的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
[0032]
本公开还涉及一种在有需要的受试者中减少ami引起的心脏组织梗塞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
[0033]
本公开还涉及一种在有需要的受试者中保护心肌细胞免受ami引起的功能丧失的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含nimoesh的多肽。
[0034]
本公开还涉及包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中治疗与ami相关的疾病或病症的用途。
[0035]
本公开还涉及包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中恢复ami后心脏功能的用途。
[0036]
本公开还涉及包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中减少或预防ami引起的心脏功能丧失的用途。
[0037]
本公开还涉及包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中减少ami引起的心脏组织梗塞的用途。
[0038]
本公开还涉及包含nimoesh的多肽在有需要的受试者中保护心肌细胞免受ami引起的功能丧失的用途。
[0039]
这些方法和用途的实施方式可以包括任何以下特征中的任何一者或任何两者或更多者的组合：
[0040]
·
所述受试者是人类；
[0041]
·
所述多肽与dat部分缀合；
[0042]
·
所述dat部分是蛋白转导结构域；
[0043]
·
所述蛋白转导结构域是hiv-1tat；
[0044]
·
所述多肽和dat部分一起与seq id no:3的氨基酸序列具有至少约90％、或至少约95％、或至少约99％的同一性，或者所述多肽和dat部分一起具有seq id no:3的氨基酸序列；
[0045]
·
所述多肽与一种或多种其他活性治疗成分共同施用于所述受试者，或者所述多肽是施用于所述受试者的唯一活性治疗成分，或者所述受试者已接受其他心血管药物；
[0046]
·
所述多肽在包含一种或多种赋形剂的药物组合物中施用；
[0047]
·
所述药物组合物用于全身施用；
[0048]
·
所述药物组合物用于静脉内施用。
[0049]
本公开还涉及一种用于上述用途中任一者的包含nimoesh的多肽。
[0050]
如本文所用，“肽”或“多肽”可以互换使用，并且通常是指由至少两个通过肽键或修饰的肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。然而，当参考特定seq id no具体使用时，其意指包含氨基酸序列，例如由seq id no:1或3表示的序列，其中肽具有心脏保护活性。修饰的肽键可以包括例如肽等排体(修饰的肽键)，其可以为肽提供额外的所需特性，例如增加的半衰期。构成本文所述的肽或多肽的氨基酸也可以通过天然过程如翻译后加工或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。修饰可以发生在肽中的任何地方，包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解，相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定肽的若干位点中。
[0051]
氨基酸是含有胺基团、羧酸基团和在不同氨基酸之间变化的侧链的分子。氨基酸可以呈其天然形式，或者其可以是合成氨基酸。氨基酸可以描述为例如极性的、非极性的、
酸性的、碱性的、芳香族的或中性的。极性氨基酸是在生物或接近中性ph值下可通过氢键键合与水相互作用的氨基酸。氨基酸的极性是生物或接近中性ph值下氢键键合程度的指标。极性氨基酸的实例包括丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸。非极性氨基酸的实例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。酸性氨基酸在中性ph值下具有净负电荷。酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸在中性ph值下具有净正电荷。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。芳香族氨基酸通常是非极性的，并且可能参与疏水相互作用。芳香族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸也可以通过芳香族侧链上的羟基基团参与氢键键合。中性脂肪族氨基酸通常是非极性和疏水的。中性氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。一个氨基酸可以用一个以上的描述类别来描述。具有共同描述类别的氨基酸可以在肽中相互取代。根据下表a，氨基酸残基通常可以由单字母或三字母的名称表示，对应于氨基酸的俗名。构成本文所述肽的氨基酸将被理解为呈l-构型或d-构型。本文所述的氨基酸可通过甲基化、酰胺化、乙酰化或用可以改变肽的循环半衰期而不会不利地影响其生物活性的其他化学基团取代来修饰。
[0052]
本领域技术人员理解，本文所述的多肽中的个别氨基酸的方面可以被取代。此外，本领域技术人员理解某些取代更可能导致活性保留。例如，氨基酸可以描述为例如极性的、非极性的、酸性的、碱性的、芳香族的或中性的。极性氨基酸是在生物或接近中性ph值下可通过氢键键合与水相互作用的氨基酸。氨基酸的极性是在生物或接近中性ph值下氢键键合程度的指标。极性氨基酸的实例包括丝氨酸、脯氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和谷氨酸。非极性氨基酸的实例包括甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸和色氨酸。酸性氨基酸在中性ph值下具有净负电荷。酸性氨基酸的实例包括天冬氨酸和谷氨酸。碱性氨基酸在中性ph值下具有净正电荷。碱性氨基酸的实例包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。芳香族氨基酸通常是非极性的，并且可能参与疏水相互作用。芳香族氨基酸的实例包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。酪氨酸也可以通过芳香族侧链上的羟基基团参与氢键键合。中性脂肪族氨基酸通常是非极性和疏水的。中性氨基酸的实例包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸。一个氨基酸可以由一个以上的描述类别来描述。具有共同描述类别的氨基酸可以在肽中相互取代。
[0053]
如本文所用，术语“同一性”是指两个肽之间的序列同一性的量度。同一性可以通过比较出于比较的目的进行比对的每个序列中的位置来确定。例如，同一性可以由当前使用的blast算法确定，并且所述算法最初在altschul等人,(1990)j.mol.biol.215:403-410中描述。blast算法可以与已发布的默认设置一起使用。当比较序列中的一个位置被相同的氨基酸占据时，分子被认为在该位置具有共享同一性。序列之间的同一性程度是序列共享的匹配位置的数目和序列之间的重叠程度的函数。此外，当考虑与seq id no:1或3的同一性程度时，预期将相等数目的氨基酸分别与seq id no:1或3进行比较。当确定与seq id no:1或3的同一性程度时，不打算考虑额外的序列(即除了分别对应于seq id no:1或3的10或21个氨基酸的那些)。给定序列的序列同一性可以在参考序列(即seq id no:1或3)的长度上计算。
[0054]
用于描述肽或多肽的命名法可以遵循常规实践，其中氨基基团呈现于每个氨基酸残基的左侧并且羧基基团呈现于每个氨基酸残基的右侧。在代表本发明的选定的具体实施
方式的序列中，氨基末端和羧基末端基团，尽管没有具体显示，但将被理解为它们在生理ph值下所呈现的形式，除非另有说明。根据下表a，在氨基酸结构式中，每个残基通常可以由单字母或三字母的名称表示，对应于氨基酸的名称。
[0055]
表a.天然存在的肽中常见的20种标准l-氨基酸的命名和缩写
[0056]
全名三字母缩写单字母缩写丙氨酸alaa半胱氨酸cysc天冬氨酸aspd谷氨酸glue苯丙氨酸phef甘氨酸glyg组氨酸hish异亮氨酸ilei赖氨酸lysk亮氨酸leul甲硫氨酸metm天冬酰胺aspn脯氨酸prop谷氨酰胺glnq精氨酸argr丝氨酸sers苏氨酸thrt缬氨酸valv色氨酸trpw酪氨酸tyry
[0057]
肽的一个或两个末端，但通常是一个末端，可以被亲脂基团取代，所述亲脂基团通常是脂肪族或芳烷基基团，其可以包括杂原子。链可以是饱和的或不饱和的。方便地，可以使用市售的脂肪族脂肪酸、醇和胺，例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸和肉豆蔻醇、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸和硬脂胺、油酸、亚油酸、二十二碳六烯酸等。优选的是长度在14-22个碳原子之间的无支链、天然存在的脂肪酸。其他亲脂性分子包括甘油脂质和固醇，例如胆固醇。亲脂性基团可以根据常规方法与寡肽上的适当官能团反应，通常在支撑物上合成期间，取决于寡肽与支撑物的连接位点。脂质附着在可以将寡肽与其他治疗剂一起引入脂质体的内腔时是有用的，用于将肽和药剂施用到宿主中。
[0058]
取决于它们的预期用途，特别是对哺乳动物宿主的施用，主题肽也可以通过连接到其他化合物上进行修饰，目的是并入运载体分子，改变肽的生物利用度，延长或缩短半衰期，控制对各种组织或血流的分布，减少或增强与血液组分的结合等。
[0059]
示例性肽还可包含递送和靶向(dat)部分以帮助示例性肽跨细胞膜转运。如本文所用的术语递送和靶向(dat)部分意在涵盖有助于将本文所述的肽递送和/或靶向至靶细胞或组织或者靶细胞内或者靶组织的细胞内的任何部分。此外，dat部分可以通过促进本文
所述肽的生物学功效来“帮助”递送和/或靶向。能够以合适的方式将生物活性分子递送或靶向到细胞中以提供有效量(例如药理学有效量)的部分是本领域已知的。任选地，递送和靶向(dat)部分可以选自以下中的一种或多种：受体配体、蛋白转导结构域、胶束、脂质体、脂质颗粒、病毒载体、肽运载体、蛋白质片段或抗体。任选地，蛋白转导结构域可以是hiv-1tat的细胞膜转导结构域(demarchi等人,(1996)j virol.70：4427-4437)。此类蛋白转导结构域的其他实例和相关细节已被描述并为本领域技术人员所知。hiv-1tat细胞膜转导结构域可以与本文所述的示例性肽形成融合蛋白(例如，如seq id no:3中)。这些蛋白质可以通过本领域已知的化学合成、重组dna、遗传和分子工程技术产生。
[0060]
在治疗应用中，本文所述的组合物可以施用于患有疾病或病症(例如与急性心肌梗塞(ami)相关的疾病或病症)的一种或多种症状的受试者。本文所述的组合物可以以足以治愈或至少部分预防或阻止疾病或病症和/或其并发症或帮助减轻与其相关的症状的量施用于受试者。足以实现治疗、治愈或预防性治疗的量被定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。对于此用途的有效量将取决于疾病或病症的严重程度、预期用途(治疗、治愈、预防、缓解症状等)和受试者健康的一般状态。根据患者需要和耐受的剂量和频率，可以施用组合物的单次或多次施用。组合物通常会在受试者中提供足够量的活性肽或本文所述的肽以有效治疗(例如，至少改善一种或多种症状)。
[0061]
本文所述的肽的浓度可以广泛变化，并且可以根据所选的特定施用模式和受试者的需要主要基于流体体积、粘度、体重等进行选择。然而，通常选择浓度以提供范围为约0.01或1毫克/千克/天至约50毫克/千克/天并且有时更高的剂量。应当理解，这样的剂量可以改变以优化特定受试者或受试者组中的治疗方案。
[0062]
可以将额外的活性治疗成分与主要活性剂(例如本文所述的示例性肽)一起或先于主要活性剂施用至受试者。示例性肽可以与其他治疗活性剂共同施用以通过递送具有相似或互补活性的第二化合物来增强对靶细胞或组织的治疗效果。在一个实施方案中，此类药剂包括但不限于降低急性心肌梗塞(ami)和/或其并发症的风险的药剂。此类药剂包括但不限于抗凝血剂(例如，醋硝香豆素(acenocoumarol)、香豆四基酯(coumatetralyl)、双香豆素(dicoumarol)、双香豆酸乙酯、苯丙香豆素(phenprocoumon)、华法林(warfarin)、氯茚二酮(clorindione)、二苯茚酮(diphenadione)、苯茚二酮(phenindione)、噻氯香豆醇(tioclomarol)、贝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、达肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞维肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin)、磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux)、达那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮肤素(dermatan sulfate)、阿哌沙班(apixaban)、贝曲西班(betrixaban)、依度沙班(edoxaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、水蛭素(hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(lepirudin)、地西卢定(desirudin)、阿加曲班(argatroban)、达比加群(dabigatran)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、reg1、去纤苷(defibrotide)、拉马曲班(ramatroban)、抗凝血酶iii和屈曲可金α(drotrecogin alfa))、抗血小板药物(例如，阿昔单抗(abciximab)、依替巴肽(eptifibatide)、替罗非班(tirofiban)、氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)、噻氯匹定(ticlopidine)、替格瑞洛(ticagrelor)、贝前列素(beraprost)、前列环素(prostacyclin)、洛前列素
(lloprost)、曲前列素(treprostinil)、乙酰水杨酸/阿司匹林、阿洛昔林(aloxiprin)、卡巴匹林钙(carbasalate calcium)、吲哚布芬(indobufen)、三氟柳(triflusal)、双嘧达莫(dipyridamole)、吡考他胺(picotamide)、特鲁多班(terutroban)、西洛他唑(cilostazol)、双嘧达莫、三氟柳、氯立克美(cloricromen)、地他唑(ditazole))，以及溶栓和纤溶药物(例如，组织纤溶酶原激活剂(tpa)或重组组织纤溶酶原激活剂(rtpa)，例如阿替普酶(alteplase)、瑞替普酶(reteplase)、替奈普酶(tenecteplase)、尿激酶(urokinase)、沙鲁普酶(saruplase)、链激酶(streptokinase)、阿尼替普酶(anistreplase)、蒙特普酶(monteplase)、ancrod、纤溶酶(fibrinolysin)和纤维蛋白酶(brinase))等或与其他心脏保护剂组合。
[0063]
可以以多种方式制备肽。肽的化学合成在本领域是众所周知的。固相合成是常用的，并且可使用各种商业合成装置，例如applied biosystems inc.,foster city,calif.；beckman等的自动合成仪。还可以使用溶液相合成方法，特别是对于大规模生产。
[0064]
肽还可以以盐的形式存在，通常以药学上可接受的盐形式存在。这些包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰等的无机盐。也肽的各种有机盐也可以用包括但不限于乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等制成。先前的实例用作示例并且是非限制性的。
[0065]
实验例
[0066]
将参考以下示例性信息来描述本发明的实施方式，这些示例性信息不应用于限制或解释本文所述的教导。
[0067]
动物
[0068]
幼年sprague dawley大鼠(p1-2)和成年雄性sprague dawley大鼠(180-220g)购自中国的b&k universal ltd。将成年大鼠圈养在塑料笼中，自由获取食物和水，并保持在温度受控的房间(22-25℃)中，光照/黑暗循环为12/12小时。所有实验方案均经第二军医大学(second military medical university)批准，并且方法按照批准的指南和规定进行。尽一切努力尽量减小动物的痛苦并减少使用的动物数量。
[0069]
中国巴马小型猪(chinese bama miniature pig)(2-3个月；7.81-10.43kg)购自吴江市田宇生物科技有限公司(wujiang tianyu biotech)(中国苏州)。将猪圈养在不锈钢笼中，自由获取食物和水，并保持在温度受控的房间(18-26℃)中，光照/黑暗循环为12/12小时。所有实验方案均经合同研究机构joinn实验室(苏州)(中国，http://www.joinn-lab.com/)批准，并且方法按照批准的指南和规定进行。尽一切努力尽量减小动物的痛苦并减少使用的动物数量。
[0070]
化学品和试剂
[0071]
使用以下化学品和试剂：盐酸氯胺酮(福建古田制药(fujian gutian pharmaceutical)，中国，h35020148)、地西泮(diazepam)(河南安阳益康制药(henan anyang yikang pharmaceutical)，中国，h41021491)、生理盐水(山东华鲁制药(shandong hualu pharmaceutical)，中国，h37022749)、2,3,5-三苯基-四唑氯化物(ttc)(生工生物工程(sangon biotech)，中国，ca25ba0012)、乌拉坦(urethane)(国药化学试剂(sinopharm chemical reagent)，中国，20150908)、dmem(hyclone，ab10155403)、fbs(safc biosciences，8j0157)、胰蛋白酶(gibco，1766146)、ii型胶原酶(sigma，234155)、5'-brdu
(生物基础公司(bio basic inc)，mco325b2011z)、mtt(amresco，lj0628a5010j)、膜联蛋白v-fitc细胞毒性试剂盒(beyotime biotechnology，c1063)、肌酸激酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所(nanjing jiancheng bioengineering institute)，20161130)、乳酸脱氢酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，20161206)、丙二醛检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，20161205)、超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，20161205)。
[0072]
如本文所用，术语“nimoesh”是指以下氨基酸序列：waayrthsvd[seq id no:1]。在此处描述的实例中，nimoesh肽(waayrthsvd)与tat蛋白转导结构域(ygrkkrrqrrr；seq id no:2)缀合。nimoesh-tat肽(waayrthsvd-ygrkkrrqrrr；seq id no:3)是在不列颠哥伦比亚大学(university of british columbia)的脑健康中心的肽设施中使用prelude肽合成仪(protein technologies inc.)化学合成的。
[0073]
缓冲液和介质
[0074]
细胞消化缓冲液(不含edta)含有0.05％胰蛋白酶和0.5mg/ml ii型胶原酶。细胞培养基含有15％fbs、1％青霉素-链霉素、1％0.1mm brdu和83％dmem。
[0075]
肽制备和处理
[0076]
在每次使用前通过将干肽粉末溶解到无菌水或生理盐水中来新鲜制备肽溶液。对于细胞培养实验，将肽原液溶解在培养基中至所需浓度。对于动物实验，肽溶液是经静脉内注射的。
[0077]
原代心肌细胞培养
[0078]
从p1-2 sprague dawley大鼠中取出心脏并切成1mm3的立方体。然后将心脏组织在细胞消化缓冲液中于37℃消化4分钟，并以200rpm离心1分钟以去除上清液。将沉淀再次在细胞消化缓冲液中于37℃消化直至其完全消化，然后以200rpm离心1分钟以去除碎片。将样品与fbs混合以中和胰蛋白酶和胶原酶，然后以1000rpm离心5分钟以去除上清液。通过差异粘附从样品中分离心肌细胞，然后在平板中的细胞培养基中培养。原代心肌细胞培养物在37℃温育箱中在95％o2和5％co2保持5天，然后用于实验。
[0079]
细胞死亡测定
[0080]
使用多种测定来测量原代心肌细胞培养物的细胞死亡。使用商业试剂盒并根据制造商的说明测量mtt以及肌酸激酶、乳酸脱氢酶、丙二醛和超氧化物歧化酶的活性。通过用膜联蛋白v-fitc细胞毒性试剂盒处理原代心肌细胞培养物进行细胞凋亡测定，接着通过流式细胞术(bd，facsialibur)确定细胞凋亡百分比。
[0081]
ami大鼠模型
[0082]
如前所述，通过结扎左冠状动脉前降支对大鼠进行ami(yu,j.g.等人,acta pharmacol sin 34,1508-1514,doi:10.1038/aps.2013.147(2013))。简而言之，通过腹膜内注射用100mg/kg盐酸氯胺酮和10mg/kg地西泮麻醉大鼠，然后使用呼吸机(上海奥科特生物科技(shanghai alcott biotech)，中国，alc-v8)在潮气量20ml和呼吸频率60次/分钟下接受人工通气。通过第4肋间使心脏外化，并使用6-0缝合线结扎左冠状动脉前降支。切口闭合后，将大鼠放回其家笼中。除了不结扎冠状动脉外，假手术大鼠接受相同的方案。
[0083]
短暂性ami猪模型
[0084]
通过如前所述暂时闭塞左回旋冠状动脉使猪经受短暂性ami(lchimura,k.等人,
plos one 11,e0162425,doi:10.1371/journal.pone.0162425(2016))。简而言之，用盐酸氯胺酮(10mg/kg，肌肉内)麻醉猪，并使用呼吸机(sn23402，hallowell engineering and manufacturing corporation，美国)用异氟醚维持麻醉状态(潮气量：80ml；呼吸频率：20次/min)。进行了左侧开胸手术，并将气动袖带封堵器放置在左回旋冠状动脉的近端。在切口闭合后将猪放回其家笼中。实验当天，通过向袖带充气将左回旋冠状动脉闭塞60分钟来诱发ami。然后袖带放气并开始血液再灌注。使用夹套式外部遥测(数据科学国际公司(data science international inc.)，美国)来监测猪在动脉闭塞前和直至血液再灌注后10小时的ecg信号。
[0085]
ttc染色和心脏梗塞的测量
[0086]
处死大鼠，取出它们的心脏并在电子秤上称重。在-20℃冰箱中快速冷冻20分钟后，将心脏切成5个相同大小的小块，并在37℃的0.5％ttc溶液中放置5分钟。将鉴定为白色组织的梗塞组织与鉴定为红色组织的健康组织分离。然后在电子秤上对梗塞组织进行称重，并且通过将梗塞组织的重量除以整个心脏的重量来计算心脏梗塞的百分比。
[0087]
处死猪并取出心脏。用生理盐水冲洗后，用37℃1％ttc灌注心脏，然后切成6片(5mm厚度)。将心脏切片置于37℃的1％ttc溶液中持续5-10分钟，然后用10％福尔马林溶液固定。拍摄心脏切片图像，然后使用nih image j软件进行分析。每个切片中的心脏梗塞体积＝(切片一侧的梗塞面积 切片另一侧的梗塞面积)/2
×
厚度(5mm)。通过将梗塞组织的体积除以左心室的体积来计算心脏梗塞百分比。
[0088]
心功能测量
[0089]
如yu等人(acta pharmacol sin 34,1508-1514,doi:10.1038/aps.2013.147(2013))所述进行大鼠的血流动力学评估。简而言之，用1.25g/kg 25％乌拉坦麻醉大鼠，并且将连接到压力传感器(powerlab 30，adinstruments)的聚乙烯导管插入右颈动脉中，然后进入左心室腔。记录平均心率、收缩压、左心室收缩压(lvsp)、左心室舒张末期压力(lvedp)和最大压力上升率( dp/dtmax)和下降率(-dp/dtmax)持续30分钟并且然后进行分析。
[0090]
在用舒泰(telazol)(10mg/kg，肌肉内)和异氟醚麻醉猪后，使用便携式彩色多普勒(s8 exp，深圳市开立科技有限公司(shenzhen sonoscape medical corp)，中国)对猪进行经胸超声心动图检查。记录舒张末期容积(edv)、收缩末期容积(esv)、每搏输出量(sv)和射血分数(ef)。
[0091]
猪心脏的组织学分析
[0092]
处理来自每个猪心脏的第2个切片以用于h&e染色，然后进行组织学分析。心脏病理学水平(心房颤动、坏死、出血、炎症、肉芽肿和心包炎)分为4种类别用于比较：轻度( ；几乎不可见)、轻度( ；可见但非常小)、中度( ；可见且可量化)和重度( ；广泛损害)。
[0093]
统计分析
[0094]
将细胞培养物和动物随机分配到实验处理组中，并使用spss软件分析数据并表示为平均值
±
s.e.m。通过单因素方差分析、接着lsd事后检验或非配对t检验分析数据。*p《0.05、**p《0.01和***p《0.001被视为显著差异。
[0095]
结果
[0096]
nimoesh-tat肽在ami体外模型中的心脏保护功效
[0097]
用300um h2o2处理原代心肌细胞培养物持续4小时以诱导氧化应激。然后，在细胞死亡分析之前，将心肌细胞放回正常培养基中持续12小时。在h2o2处理前30分钟和12小时恢复期间，一些心肌细胞用10um nimoesh-tat肽处理。与未处理的对照相比，h2o2处理诱导细胞死亡，如mtt测定(图1a)和细胞凋亡测定(图1b)所示，增加了心肌细胞损伤标志物的活性，如肌酸激酶(ck，图1c)、丙二醛(mda，图1d)和乳酸脱氢酶(ldh，图1e)的测定所示，并降低了促存活蛋白标志物超氧化物歧化酶(sod)的活性(图1f)。与h2o2组相比，nimoesh-tat肽有效地减少了h2o2诱导的细胞死亡，如图1a-b和图1d-f所示。尽管nimoesh-tat肽不能完全挽救h2o2诱导的ck活性增加，但与h2o2组相比，肽处理组的ck活性有降低的趋势(图1c)。这些结果表明，nimoesh-tat肽对氧化应激诱导的心肌细胞死亡具有心脏保护功效。
[0098]
nimoesh-tat肽在ami后减少大鼠中的心脏损伤并恢复心脏功能
[0099]
研究了nimoesh-tat肽在充分确立的ami大鼠模型中的心脏保护功效(yu,j.g.等人,acta pharmacol sin 34,1508-1514,doi:10.1038/aps.2013.147(2013))。左冠状动脉前降支结扎后立即将20mg/kg nimoesh-tat或生理盐水对照经静脉内(i.v.)注射到大鼠体内。四小时后，取出心脏用于ttc染色和梗塞百分比测量。如图2a-b所示，ami手术在生理盐水处理的大鼠的心脏中引起了严重的组织梗塞，并且这种手术引起的心脏损伤通过nimoesh-tat治疗显著降低，表明nimoesh-tat肽的心脏保护功效。
[0100]
还研究了nimoesh-tat肽针对ami的长期保护作用。结扎左冠状动脉前降支的大鼠在手术后0小时、24小时和48小时接受nimoesh-tat肽(20mg/kg)或生理盐水的3次i.v.注射。接受假手术的大鼠用作对照。在最后一次肽注射后4周，使用若干充分表征的参数测量心脏功能(yu,j.g.等人,acta pharmacol sin 34,1508-1514,doi:10.1038/aps.2013.147(2013))。与假手术组相比，生理盐水或nimoesh-tat肽均未改变ami后大鼠的心率(图2c)和收缩压(图2d)。在ami后，与假手术组相比，生理盐水处理的大鼠显示出降低左心室收缩压(图2e)以及最大压力上升率( dp/dtmax)(图2g)和下降率(-dp/dtmax)(图2h)，并且左心室舒张末期压力增加(图2f)，表明ami后心脏功能受损。与生理盐水组相比，nimoesh-tat肽治疗挽救了ami后的心脏功能(图2e-h)。
[0101]
nimoesh-tat肽在小型猪中在短暂性ami后减少心脏梗塞并恢复心脏功能
[0102]
nimoesh-tat肽的心脏保护功效也在中国巴马小型猪中进行了研究。通过闭塞左回旋冠状动脉1小时，接着再灌注血液，在这些猪中诱发了短暂性ami。在闭塞后40分钟，猪接受了nimoesh-tat肽(2mg/kg)或生理盐水的一次i.v.注射，并且在再灌注后24小时接受了另一次i.v.注射。在将猪处死用于组织学分析之前30天，评估这些猪的心脏功能。两组猪在ami手术期间具有相同水平的动脉闭塞，并且也显示出相同水平的ami后体重恢复(图4)。如图3所示，nimoesh-tat肽挽救了ami引起的每搏输出量(sv，图3c)和射血分数(ef，图3d)的功能缺陷。猪心脏切片的ttc染色还揭示，与生理盐水对照相比，nimoesh-tat肽减少了ami引起的心脏梗塞的体积(图3e和图3f)。这与心脏的组织学研究一致(图3g和表1)，这表明与对照相比，nimoesh-tat肽减少了ami诱导的心脏病理学，例如心房颤动和心包炎。
[0103]
表1
[0104][0105]
表1提供了在显微镜下观察到的病理学总结。与生理盐水对照相比，nimoesh-tat肽治疗的猪显示出小得多的ami诱导的病理学。
[0106]
讨论
[0107]
nimoesh-tat不仅保护心肌细胞免于心肌细胞原代培养物中的细胞死亡，而且还保护大鼠和猪免于ami引起的心脏梗塞和功能丧失。虽然不希望受任何特定理论或作用模式的束缚，但本文所述的结果表明zd17与jnk之间的相互作用可能至少部分地在诱导心脏细胞死亡中发挥作用，并且因此本文所述的nimoesh-tat的心脏保护作用可至少部分地归因于在细胞应激期间zd17与jnk之间的相互作用的阻断。
[0108]
关于肽治疗剂的一个潜在问题可能是它们的半衰期短。一旦进入体内，未经化学修饰的肽很容易被酶消化。这对于例如阿尔茨海默病(alzheimer's disease)、帕金森病(parkinson's disease)和高血压的慢性疾病的治疗可能是个问题，因为患者可能需要每天多次注射。然而，对于急性适应症，少量注射可能足以用于疾病治疗，因此肽的短半衰期不再是问题。本文所述的结果支持了这一点。如图2所示，nimoesh-tat肽的一次i.v.注射足以保护大鼠免受ami引起的心脏组织损伤，并且每天注射一次持续3天足以有效保护心脏免受ami引起的功能丧失。在图3和表1中，nimoesh-tat肽的两次i.v.注射足以诱导在ami后猪
中的心脏保护。
[0109]
尽管已经参考说明性实施方式和实施例描述了本发明，但所述描述并不旨在以限制意义进行解释。因此，本领域技术人员在参考本描述后，对说明性实施方式以及本发明的其他实施方式的各种修改是显而易见的。因此预期权利要求书涵盖任何此类修改或实施方式。
[0110]
在此提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用整体并入，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用整体并入一样。
[0111]
序列表
[0112]
seq id no:1(nimoesh):waayrthsvd
[0113]
seq id no:2(hiv-1tat蛋白转导结构域):ygrkkrrqrrr
[0114]
seq id no:3(nimoesh-tat肽):waayrthsvdygrkkrrqrrr