一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒

1.本发明涉及一种试剂盒，更具体一点说，涉及一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，属于兽用疫病检测技术领域。


背景技术：

2.猪圆环病毒病(porcine circovirus，pcv)是一种近年来倍受关注的广泛流行于世界各地的疾病,它是由猪圆环病毒型引起的一系列疾病的总称。发现猪圆环病毒属圆环病毒科、圆环病毒属，是已知的最小的动物病毒之一。猪圆环2 型(porcine circovirus type 2，pcv2)具有极高的致病性，目前该病已在我国猪群中广泛流行，给养猪业造成巨大的经济损失，严重危害养猪业发展，需引起高度重视。
3.pcv2的基因组全长为1767-1768bp，含有11个orf,分别编码1.8-35.8kd 的蛋白质，orf1和orf2是pcv2的两个主要开放性阅读框，编码两种蛋白 orf1编码病毒复制相关蛋白(rep)，orf2编码病毒衣壳蛋白(cap)pcv2的基因组非常小，基因组全长为pcv2为1767-1768bp，pcv2含有11个orfs,分别编码1.8-35.8kd的蛋白质，orf1和orf2是pcv2的两个主要开放性阅读框，反向编码两种蛋白orf1编码病毒复制相关蛋白(rep)，orf2编码病毒衣壳蛋白(cap)。orf2编码cap蛋白(又称核衣壳蛋白)，为病毒的主要结构蛋白，包含病毒主要的抗原表位，因此能够用于pcv2病毒的检测。该蛋白由233个氨基酸组成，分子量约为27.2kd。
4.常见的猪圆环病毒2型检测方法有酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法等等。荧光pcr检测方法耗时耗力；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速的检测产品，化学发光法是最好的选择。该技术与荧光pcr检测方法相比，操作简单，反应时间短，该方法敏感性与精确度好，检测范围很广。


技术实现要素：

5.为了解决上述现有技术问题，本发明提供具有能够解决当前市场上pcv2 诊断试剂存在的成本高、耗时长、精度低等问题等技术特点的一种猪圆环病毒2 型化学发光检测试剂盒。
6.为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
7.本发明一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒设有一个盒体，盒体内装有磁微粒偶联的多克隆抗体、吖啶酯标记的单克隆抗体、猪圆环病毒2型抗原干粉、抗原定标品缓冲溶液、清洗液、化学发光预激发液a、化学发光激发液b，还包括反应管槽、操作说明书槽，所述反应管槽内可拆卸放置有多个反应管，所述操作说明书槽内放置有说明书。
8.优选的，单克隆抗体的重链可变区序列为seq id no.1:
9.1 qyqledfsgp glvassqsls itctvsgfsl srymvhwvrq pngkgfsewl gmiwgggsdr ynsalksrls
10.71 igtdnsssqv flksedslqt ddtamyycar dgyydyaidy wgqgtsvtvc ser；
11.单克隆抗体的重链可变区序列为seq id no.2:
12.1 diksqspssm yamlswervt itcassdics ylswyqlkpw kssktldyya tsadgvpsrf sasgsgqdyy
13.71 ltisslmsdd tatyycse。
14.优选的，所述的磁微粒的粒径为0.01-1μm。
15.优选的，所述磁微粒偶联的多克隆抗体是采用磁微粒直接与猪圆环病毒2型多克隆体抗体偶联。
16.优选的，所述吖啶酯标记的单克隆抗体是采用吖啶酯直接与猪圆环病毒2型单克隆体抗体偶联。
17.优选的，所述抗原标准品缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液含有0.5-5.0％的牛血清白蛋白，通过在所述磷酸盐缓冲溶液中添加猪圆环病毒 2型抗原干粉后能够制备系列浓度梯度的校准品溶液。
18.优选的，所述化学发光预激发液a由浓硝酸和双氧水混合组成，其中硝酸浓度为0.05-2.5mol/l，双氧水质量分数为0.05-5％，所述化学发光激发液b由氢氧化钠和曲拉通x-100混合组成，其中氢氧化钠的浓度为0.05-1.0mol/l，曲拉通x-100 的浓度为0.05-2.0mol/l。
19.优选的，所述的清洗液的ph值为7.0-9.0，其中含有浓度为5.0-50.0mmol/l的磷酸缓冲溶液，含有质量分数为0.01-0.25％的吐温20。
20.优选的，所述磁微粒偶联的多克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
21.步骤1)取1mg羧基磁微粒于1.0ml离心管中，加入0.1-0.5ml的0.1mol/l 的mes缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入0.5-1.0ml的mes(ph值为6.0)的缓冲液，涡旋；
22.步骤2)加入15μg的多克隆抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育20min；
23.步骤3)加入10μl浓度为10mg/ml的偶联试剂edc涡旋，旋转反应管，室温孵育2h；
24.步骤4)离心后弃上清液，加入200μl的清洗缓冲液，所述清洗缓冲液包括tbs以及0.05％吐温20，洗涤3次；
25.步骤5)用含1％牛血清白蛋白的缓冲液进行封闭，封闭6h，将该磁微粒重悬后置于于2-8℃保存。
26.优选的，吖啶酯标记的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤：
27.步骤1)称取1.6mg的吖啶酯nsp-dmae-nhs，溶于无水dmso中，配成 6.5mmol/l的母液；
28.步骤2)在避光环境下，将5μl的单克隆抗体与195μl的吖啶酯母液混合，室温下反应1h，加入10g/l赖氨酸100μl，继续反应10min，使标记反应终止；
29.步骤3)将标记后的溶液注入sephadex g-25脱盐柱，用0.1mol/l的pbs 进行洗涤；
30.步骤4)用色谱仪检测蛋白，在280nm下检测蛋白浓度，当色谱仪出现明显的蛋白峰值时，收集流出液；
31.步骤5)流出液中添加1％的牛血清白蛋白后冷冻保存。
32.优选的，猪圆环病毒2型抗原干粉与定标品缓冲溶液混合后配制成标准品，配制方
法包括如下步骤：
33.将试剂盒中猪圆环病毒2型抗原干粉与1ml的定标品缓冲溶液混合后配制成1mg/ml的定标品，将该标准品进行梯度稀释，分别配制成1.0mg/ml、100μ g/ml、10μg/ml、1.0μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1.0ng/ml、0ng/ml 的定标品。
34.有益效果：本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，与现有的猪圆环病毒2型检测技术相比，本发明试剂盒具有灵敏度高、特异性强、反应时间短等优点；本发明使用基因表达的重组蛋白为检测抗原，安全性好、无杂蛋白污染，且具有特异性好、灵敏度高、可大批量检测等优点；本发明的检测时间为25min；本试剂盒的反应管是可以拆卸的，当样品较少时，可以将暂时不用的反应管拆下，以便后续使用，可以进一步降低使用成本和方便终端用户的使用。
附图说明
35.图1是本发明试剂盒结构示意图。
36.图2是本发明检测样本的发光值图。
具体实施方式
37.以下结合说明书附图1-2所示，对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。
38.本发明一种猪圆环病毒2型化学发光检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒设有一个盒体1，盒体1内装有磁微粒偶联的多克隆抗体2、吖啶酯标记的单克隆抗体3、猪圆环病毒2型抗原干粉4、抗原定标品缓冲溶液5、清洗液6、化学发光预激发液a 7、化学发光激发液b 8，还包括反应管槽9、操作说明书槽10，所述反应管槽9内可拆卸放置有多个反应管，所述操作说明书槽10内放置有说明书清洗液的ph值为7.0-9.0，其中含有浓度为5.0-50.0mmol/l的磷酸缓冲溶液，含有质量分数为0.01-0.25％的吐温20，清洗液用于去除反应体系中未结合的组分。磁微粒的粒径为0.01-1μm，所述磁微粒偶联的多克隆抗体是采用磁微粒直接与猪圆环病毒2型多克隆体抗体偶联，所述吖啶酯标记的单克隆抗体是采用吖啶酯直接与猪圆环病毒2型单克隆体抗体偶联，所述抗原标准品缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液含有0.5-5.0％的牛血清白蛋白，通过在所述磷酸盐缓冲溶液中添加猪圆环病毒2型抗原干粉后能够制备系列浓度梯度的校准品溶液。所述化学发光预激发液a由浓硝酸和双氧水混合组成，其中硝酸浓度为 0.05-2.5mol/l，双氧水质量分数为0.05-5％，所述化学发光激发液b由氢氧化钠和曲拉通x-100混合组成，其中氢氧化钠的浓度为0.05-1.0mol/l，曲拉通x-100的浓度为0.05-2.0mol/l。
39.实施例1：磁微粒偶联的多克隆抗体的制备方法：
40.所述的多克隆抗体为猪圆环病毒灭活疫苗购自浙江诗华诺倍威生物三次免疫新西兰大白兔后，从血清中纯化proteing柱制备所得。
41.1.取1mg羧基磁微粒(上海辉质)于0.5ml离心管中，加入一定量0.1mol/l 的mes缓冲液，涡旋混匀，置于磁力架上，静置5min使磁微粒与液体分开，弃去上清，洗涤3次，再加入一定量mesph为6.0缓冲液，涡旋。
42.2.加入15μg的多克隆抗体，涡旋，旋转反应管，室温孵育20min。
43.3.加入10μl浓度为10mg/ml的偶联试剂edc涡旋，旋转反应管，室温孵育2h。
44.4.离心后弃上清液，加入200μl的清洗缓冲液(tbs 0.05％吐温20)，洗涤 3次。
45.5.用含1％牛血清白蛋白缓冲液进行封闭，封闭6h。将该磁微粒重悬后置于2-8℃保存。
46.实施例2：吖啶酯标记的单克隆抗体的制备方法：
47.所述的单克隆抗体为鼠源抗pcv2-cap蛋白的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区序列如seq id no.1所示；所述的单克隆抗体的轻链可变区序列如seq id no.2所示。
48.1.称取1.6mg的吖啶酯nsp-dmae-nhs(购自麦克林)，溶于无水dmso 中，配成6.5mmol/l的母液。
49.2.在避光环境下，将5μl的单克隆抗体与195μl的吖啶酯母液混合，室温下反应1h，加入10g/l赖氨酸100μl，继续反应10min,使标记反应终止。
50.3.将标记后的溶液注入sephadex g-25脱盐柱。用0.1mol/l的pbs进行洗涤。
51.4.用色谱仪检测蛋白，在280nm下检测蛋白浓度。当色谱仪出现明显的蛋白峰值时，收集流出液。
52.5.流出液中添加1％的牛血清白蛋白后冷冻保存。
53.实施例3：定标品配制
54.将试剂盒中抗原干粉制备的pcv2-cap蛋白，冻干后存于-80℃冰箱与1ml 的标准品缓冲溶液含2％bsa、0.5％tween-20、5％海藻糖的pbs缓冲液混合后配制成1mg/ml的定标品，将该定标品进行梯度稀释，分别配制成1.0mg/ml、100 μg/ml、10μg/ml、1.0μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、1.0ng/ml、0ng/ml的定标品。
55.实施例4：试剂盒线性范围：
56.对1.0mg/ml、100μg/ml、10μg/ml、1.0μg/ml、100ng/ml、10ng/ml、 1.0ng/ml、0ng/ml的定标品。如图2所示拟合后的标准曲线，r2为0.9987。该试剂盒在0.25ng/ml-1.0mg/ml浓度范围内具有良好线性。
57.实施例5：试剂盒检测限：
58.对零标准溶液进行20次重复测试，取零定标溶液测定的平均值加上3倍的标准偏差，即为本试剂盒的检测限。本试剂盒的检测限为0.051ng/ml。如表1所示。
59.表1检测限
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与荧光pcr检测法的对比：
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对70例血清样本进行检测，使用本发明中的试剂盒和市售的荧光pcr 试剂盒就像检测，每个样本检测3次。以荧光pcr的结果为标准，化学发光法中的68例样本检测结果与pcr相同，样本符合率97.14％。
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表2化学发光检测法与pcr对比分析
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最后，需要注意的是，本发明不限于以上实施例，还可以有很多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容中直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。