Tacr2的激动剂

tacr2的激动剂
发明领域
1.本公开涉及tacr2的激动剂，例如tacr2的肽激动剂，以及将其用于治疗肥胖症和/或糖尿病的方法。所述公开还涉及所述tacr2的激动剂用于增加个体的葡萄糖和能量消耗的用途。
2.发明背景
3.世界上大约有20亿超重或肥胖个体和3.5亿糖尿病个体(根据世界卫生组织)，尽管持续在进行研究，但仍然需要有效的治疗方法。
4.所研究的治疗策略之一是激活棕色脂肪组织(brown adipose tissue)和米色脂肪组织(beige/brite adipose tissue)。去甲肾上腺素(ne)对棕色和米色脂肪组织的经典激活作用会通过β-肾上腺素能受体(beta-adrenergic receptor，β3ar)增加这些细胞的能量消耗(cannon and nedergaard,2004)。这种棕色和米色脂肪能量消耗的主要效应物之一是解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，ucp1)，该蛋白利用质子梯度来产生热量而不是用于atp生成。除了棕色和米色脂肪组织的激活之外，冷暴露也会引发棕色和米色脂肪贮库(depot)的扩增。棕色和米色脂肪组织的扩增和激活对于治疗肥胖症和糖尿病具有重要意义，因为这能够消耗大量的脂质和葡萄糖。目前认为ne是棕色和米色脂肪扩增和激活的主要神经递质和效应物。不幸的是，ne不能用于治疗肥胖症和糖尿病，因为它会导致血压和心率升高。
5.目前没有用于治疗肥胖症和/或糖尿病的棕色和米色脂肪组织激活剂。在肾上腺素能激活剂(adrenergic activator)中，批准用于治疗膀胱过度活动症(overactive bladder)的药物mirabegron(myrbetriq,astellas pharma,inc.)已在概念验证研究中显示可激活人棕色脂肪(cypess et al.,2015)。然而，这种药物会导致血压和心率升高，这对潜在的肥胖患者来说是不希望的副作用，降低了人们对这种治疗途径的热情。
6.因此，需要能更特异性地激活棕色和米色脂肪贮库而不需要全身施用肾上腺素能激活剂的手段(means)。


技术实现要素：

7.本公开涉及tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，用于治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症。发明人已经发现，tacr2的激动剂，尤其是tacr2的肽激动剂，能够独立于去甲肾上腺素(ne)/β-肾上腺素能受体信号传导而激活棕色和米色脂肪组织。本发明公开了向个体施用tacr2的激动剂对棕色和米色脂肪细胞具有多重作用，这有利于肥胖症和糖尿病的治疗。具体地，tacr2的激动剂导致棕色和米色脂肪细胞的耗氧率(oxygen consumption rate)增加，并且还优选导致棕色和米色脂肪细胞的葡萄糖吸收、耗氧率、能量消耗和热量产生的增加。优选地，tacr2的激动剂，尤其是tacr2的肽激动剂，会导致棕色脂肪组织的激活，而不引起有害的副作用如血压和心率升高。
8.本公开的一个方面涉及tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂，用于治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症。
9.本公开的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含如本文所定义tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂，用于治疗有此需要的个体的肥胖症和/或糖尿病。
10.本公开的另一个方面涉及tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂在制备用于治疗糖尿病和/或肥胖症的药物中的用途。
11.本公开的另一个方面涉及一种治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂。
12.本公开的另一个方面涉及一种治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法，其中所述方法包括通过向所述个体施用治疗有效量的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂，来增强所述个体中棕色脂肪组织细胞的活性。
附图说明
13.图1：棕色和白色脂肪组织中nka/tacr2的表达和功能表征。相对于热中性(thermoneutrality)，c57bi/6小鼠在冷诱导的(a)肩胛间棕色脂肪组织(interscapular brown adipose tissue，ibat)、(b)腹股沟白色脂肪组织(inguinal white adipose tissue，iwat)和(c)附睾白色脂肪组织(epididymal white adipose tissue，ewat)中的tacr2表达谱。数据显示了n＝5的平均值和sem。
14.图2：(a)测定了热中性适应的或冷激发的小鼠的ibat的成熟脂肪细胞和基质血管部分(stromal vascular fraction)中tacr2 mrna表达水平。(b)来自喂食普通饮食(chow diet)或60％高脂肪饮食(hfd)的12周的c57bi/6小鼠的ibat中的tacr2 mrna表达。数据显示了n＝8的平均值和sem。(c)
15.图3：(a)用tacr2或载体对照转染的原代棕色脂肪细胞中的nka介导的ip3产生。(b)已用nka或媒介物处理72小时的原代棕色脂肪细胞中的耗氧率(ocr)，由seahorse bioscience analyzer测定。测定基础呼吸之后是ne(5μm)、寡霉素(1μm)、fccp(1μm)以及鱼藤酮(rotenone)和抗霉素a(各1μm)。数据显示了n＝8的平均值和sem。
16.图4：(a)在连续9天的光照期期间，每天两次向小鼠注射1mg/kg nka(灰色)或媒介物(黑色)，用箭头标记。使用phenomaster每5分钟测定一次耗氧。数据代表所有天数并显示了n＝6的平均值
±
sem。(b)在整个实验期间，每天测定体重。数据显示了n＝6-7的平均值
±
sem，*p《0.05，**p《0.01，使用双侧anova和sidak多重比较。(c)在治疗后第一天对禁食3小时的小鼠进行胰岛素耐受试验，小鼠腹膜内接受1ui胰岛素/kg瘦体重。数据显示了n＝6-7的平均值
±
sem，*p《0.05，**p《0.01，使用双侧anova和sidak多重比较。(d)在实验终止时收获三种主要脂肪组织并称重。数据显示了n＝6-7的平均值
±
sem，*p《0.05，使用未配对的学生t检验。
17.图5：体重减轻；b)食物摄入；c)用媒介物(黑色)或[lys2-γ-glu-c16]nka(灰色)治疗的小鼠的卡路里燃烧(calorie burning)。数据显示了n＝6的平均值 /-sem。
[0018]
发明详述
[0019]
定义
[0020]
如本文所用，术语“激动剂”涉及tacr2的激动剂，除非另有特别说明。本文所定义
的tacr2的激动剂是指包含可结合tacr2从而增强其活性的肽的化合物或由可结合tacr2从而增强其活性的肽组成的化合物。
[0021]
如本文所用，术语“棕色和/或米色脂肪组织细胞的活性”如“棕色和/或米色脂肪细胞的活性”是指棕色和米色脂肪组织的细胞典型的多个生物化学参数，其可以响应于tacr2与激动剂之间的相互作用而改变。定义棕色和/或米色脂肪细胞活性的参数的一些示例是基础耗氧率(ocr)、去甲肾上腺素(ne)诱导的ocr、最大呼吸、葡萄糖摄取/吸收、脂质摄取/吸收、热量产生。
[0022]
蛋白性“氨基酸”(proteinogenic“amino acid”)在本文中使用其单字母代码(根据iupac的建议，例如参见http://www.chem.qmw.ac.uk/iupac)来命名。如果没有其他说明，则氨基酸可以是d型或l型。
[0023]
如本文所用，术语“c
min”是指化合物的最低血液浓度。因此，涉及施用胰岛素后血液葡萄糖水平的c
min
是在所述施用后观察到的最低血液葡萄糖浓度。通常，涉及血液葡萄糖水平的c
min
是在胰岛素给药间隔内观察到的最低血液葡萄糖浓度。
[0024]
如本文所用，术语“功能类似物”是指以与参考化合物类似的方式起作用的化合物。因此，tacr2的肽激动剂的功能类似物如同tacr2的肽激动剂那样起作用。功能类似物可以是例如包含肽的化合物，其中所述肽可以用不一定由氨基酸残基组成的部分来修饰，所述部分可以结合tacr2从而增强其活性。
[0025]“非标准氨基酸”是不由任何生物体的遗传密码编码的氨基酸残基。非标准氨基酸残基可以天然存在于生物体中。非标准氨基酸的非限制性示例是：d构象的天然氨基酸、β氨基酸、γ氨基酸和非蛋白氨基酸(non-proteinogenic amino acid)。
[0026]
术语“peg”、聚乙二醇是指乙二醇的聚合物，化学式是c
2nh4n 2on 1
，且具有以下重复结构：
[0027][0028]
如本文所用，术语“肽”是至少2个通过酰胺键连接的氨基酸残基的序列。
[0029]
除非另有特别说明，否则术语“肽激动剂”是指tacr2的化合物激动剂。本文所定义的tacr2的肽激动剂是指包含能够结合tacr2从而增强其活性的肽的化合物或由能够结合tacr2从而增强其活性的肽组成的化合物。tacr2的肽激动剂可以由肽和缀合部分组成。缀合部分可以是例如糖、脂质、第二肽或技术人员会认为有益的任何其他化学基团。
[0030]
如本文所用，术语“序列同一性”是指根据比对的候选序列和参考序列之间相同氨基酸或核苷酸的百分比。因此，与参考序列有80％氨基酸同一性的候选序列要求根据比对，候选序列中80％的氨基酸与参考序列中的相应氨基酸相同。本发明的同一性借助计算机分析确定，所述计算机分析例如但不限于用于比对多肽序列的clustal omega计算机比对程序(sievers et al.(2011 october 11)molecular systems biology 7:539,pmid:21988835；li et al.(2015 april 06)nucleic acids research 43(w1):w580-4 pmid:25845596；mcwilliam et al.,(2013 may 13)nucleic acids research 41(web server issue):w597-600 pmid:23671338)，以及其中建议的默认参数。clustal omega软件可以从embl-ebi于https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/获得。使用该程序及其默认设
置，将查询和参考多肽的成熟(生物活性)部分进行比对。对完全保守的残基的数量进行计数，并除以参考多肽的长度。muscle或mafft算法可用于核苷酸序列的比对。序列同一性可以以与氨基酸序列所述相似的方式计算。因此，本文提供的序列同一性是在参考序列的整个长度上计算的。
[0031]
如本文所用，术语“治疗”是指出于对抗病况、疾病或病症的目的而对患者进行管理和护理。所述术语旨在包括针对患者所遭受的给定病况的全方位治疗，例如出于以下目的而施用活性化合物：减轻或缓解症状或并发症；延迟病况、疾病或病症的发展；改善、治愈或消除病况、疾病或病症；和/或预防病况、疾病或病症。待治疗的患者优选是哺乳动物，尤其是人。待治疗的患者可以是不同年龄。
[0032]
tacr2的激动剂
[0033]
本公开的一个方面涉及tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，尤其是tacr2的肽激动剂，用于治疗肥胖症和/或糖尿病。tacr2的激动剂可以是任何能够结合tacr2并增强其活性的化合物。在一些实施方案中，tacr2的激动剂是肽激动剂。所述tacr2的肽激动剂可以包含肽和任选的缀合部分或由肽和任选的缀合部分组成，如下文“肽激动剂”和“缀合部分”部分中的详细描述。
[0034]
优选地，tacr2的激动剂能够增强tacr2的活性，如通过任何合适的测定法测定的，尤其是通过可以测定tacr2活性(例如ca
2
动员测定法(ca
2 -mobilization assay))或3-磷酸肌醇(ip3)的产生的细胞功能测定法，两者均由ablas j.et al.(1995)描述。技术人员可以选择放射性配体测定法或其他测定法如功能性“单受体”生物测定法(functional
‘
monoreceptorial’bioassay)作为测定tacr2活性的合适手段。因此，tacr2的激动剂可以是任何化合物，例如肽激动剂，如通过任意上述测定法所测定，其能够增强tacr2的活性，优选能够使tacr2的活性增强至少20％，例如至少30％，例如至少40％。
[0035]
在一些实施方案中，激动剂活性通过测定表达tacr2的细胞中的ip3产生来测定。优选地，tacr2的激动剂是一种化合物，其在与此类细胞接触后导致ip3的产生增加。因此，可以通过包括以下步骤的方法来确定化合物是否是tacr2的激动剂：
[0036]
·
提供表达tacr2的细胞，
[0037]
·
使所述细胞与肌醇(myo-inositol)和作为tacr2的假定激动剂的化合物接触，
[0038]
·
在tacr2的所述假定激动剂不存在和存在的情况下，测定所述细胞中的ip3产生，
[0039]
其中在所述化合物存在的情况下ip3产生增加则表明，所述化合物是tacr2的激动剂。
[0040]
细胞可以内源性表达tacr2或者它们可以是经重组操作而表达tacr2的细胞，例如，所述细胞可以是包含编码tacr2的异源核酸的cos-7或hek 293细胞。ip3的产生可以以剂量-反应曲线的方式测定。
[0041]
细胞也可以是原代棕色脂肪细胞(primary brown adipocyte)，例如包含编码tacr2的异源核酸的原代棕色脂肪细胞。因此，可优选的是，tacr2的激动剂是在如实施例2所述进行的测定中诱导ip3产生的化合物。优选地，所述激动剂是以与nka相似的方式诱导ip3产生或与nka相比诱导至少80％的ip3产生的化合物(在如实施例2中所述来测定时)。
[0042]
因此，tacr2的激动剂可以是一种如使用上述监测ip3产生的测定法所测定的使
tacr2的活性增强至少20％的化合物。tacr2的激动剂也可以是一种如使用上述监测ip3产生的测定法所测定的使tacr2的活性增强至少30％的化合物。
[0043]
tacr2的激动剂也可以是一种如使用上述监测ip3产生的测定法所测定的使tacr2的活性增强至少40％的化合物。
[0044]
tacr2的激动剂优选对tacr2具有高亲和力。化合物对受体的亲和力，即化合物对tacr2的亲和力，可以通过不同的测定法测定，并因此产生如表1所示的不同的亲和力单位，如下所述：
[0045]-pic
50
是激动剂的ic
50
的以10为底的负对数，在此ic
50
是一个以多种方式使用的术语，它尤其可以是将放射性配体的结合抑制50％的未标记激动剂的摩尔浓度；应给出放射性配体的浓度；本公开中ic
50
的单位是m(摩尔)，除非另有说明；
[0046]-pec
50
是激动剂的ec
50
的以10为底的负对数，其中ec
50
是激动剂产生最大可能效果的50％的摩尔浓度，其使用本节中在上文定义的合适测定法来测定。可以例举其他百分比值(ec
20
、ec
40
等)；本公开中ec
50
的单位是m(摩尔)，除非另有说明；
[0047]-pkd是kd的以10为底的负对数，其中kd是指在使用标记形式的激动剂的结合测定中直接测定的激动剂的平衡解离常数；
[0048]-pki是ki的以10为底的负对数，其中ki是指在抑制研究中确定的配体的平衡解离常数。给定配体的ki通常(但不一必然)在竞争性放射性配体结合研究中通过测定平衡条件下感兴趣的竞争性配体对参考放射性配体结合的抑制来确定。
[0049]
特别地，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是pec
50
为8至10的化合物，如在例如bellucci f.et al.(2002)中所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中测定。
[0050]
在一些实施方案中，肽激动剂可以是如实施例7中所述测定时对鼠受体的pec
50
在6.7至9.5范围内的化合物。
[0051]
例如，肽激动剂可以是对鼠受体的pec
50
为至少6.8，例如pec
50
为至少7，优选pec
50
为至少7.5，例如pec
50
为至少8，例如pec
50
为至少8.5，优选pec
50
为至少9的化合物。
[0052]
在一些实施方案中，肽激动剂可以是如实施例7中所述测定时对人受体的pec
50
在7.2至9.5范围内的化合物。
[0053]
例如，肽激动剂可以是对人受体的pec
50
为至少7.5，例如pec
50
为至少7.8，优选pec
50
为至少8，例如pec
50
为至少8.5，例如pec
50
为至少9的化合物。
[0054]
特别地，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是pkd为6至10的化合物，如例如在bellucci f.et al.(2002)中所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中测定。
[0055]
特别地，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是pki为5至10的化合物，如例如在bellucci f.et al.(2002)中所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中测定。
[0056]
还可以使用本节开头所述的测定tacr2活性的测定法，来确定潜在的激动剂是否对tacr2具有高亲和力。激动剂是那些导致tacr2活性增加如ca
2
动员或肌醇积累增加的化合物，优选肽激动剂。优选地，本公开的肽激动剂的特征还在于对tacr2的亲和力高于对tacr1的亲和力。它们对tacr1的亲和力可能很低或忽略不计。它们也可能能够结合tacr1，
但它们对tacr2的亲和力高于对tacr1的亲和力。因此，优选地，tacr2的激动剂如tacr2的肽激动剂对tacr2的亲和力是对tacr1的亲和力的至少2倍，优选至少5倍。
[0057]
tacr2的激动剂既可以是天然存在的化合物和人工化合物。在人(homo sapiens,hs)、大鼠(rattus norvegicus,rn)和豚鼠(cavia porcellus,cp)中发现的tacr2的天然激动剂的非限制性示例列表及其对tacr2的亲和力列于表1中(douglas s.d.,et al.2015)。
[0058]
表1：tacr2的激动剂及其对受体的亲和力。
[0059]
[0060][0061]
tacr2的激动剂如肽激动剂可以是具有高功效的化合物，其可以在例如bellucci f.et al.(2002)所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中测定，其中最高值显示了所测激动剂的功效，且最高值和最低值之间的差值表示所测值的功效跨度(efficacy span)。
[0062]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是具有尽可能高功效的化合物。所述功效可以获自例如bellucci f.et al.(2002)所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中获得的最高值。
[0063]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是在如实施例7中所述测定时对鼠受体具有至少1260个相对单位，例如至少1300个相对单位，例如至少1400个相对单位，例如至少1500个相对单位，例如至少1600个相对单位，例如至少1700个相对单位，例如至少1800个相对单位，例如至少1900个相对单位，例如至少2000个相对单位，例如至少2400个相对单位，例如至少2700个相对单位的功效的化合物。
[0064]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是在如实施例7中所述测定时对人受体具有至少2000个相对单位，例如至少2200个相对单位，例如至少2400个相对单位，例如至少2600个相对单位，例如至少2800个相对单位，例如至少3000个相对单位的功效的化合物。
[0065]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是具有尽可能大的功效跨度的化合物。所述功效跨度可以是通过将在例如bellucci f.et al.(2002)所述的放射性配体结合测定或“单受体”生物测定等试验中获得的最高值减去最低值来确定。
[0066]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是在如实施例7中所述测定时具有的与鼠受体相关的功效跨度为至少1100个相对单位，例如至少1300个相对单位，例如至少1400个相对单位，例如至少1500个相对单位，例如至少1600个相对单位，例如至少1700个相对单位，例如至少1800个相对单位，例如至少1900个相对单位，例如至少2000个相对单位，例如至少2400个相对单位，例如至少2700个相对单位的化合物。
[0067]
在本公开的一个实施方案中，tacr2的激动剂如肽激动剂可以是在如实施例7中所述测定时具有的与人受体相关的功效跨度为至少1700个相对单位，例如至少2000个相对单位，例如至少2200个相对单位，例如至少2400个相对单位，例如至少2600个相对单位，例如至少2800个相对单位，例如至少3000个相对单位的化合物。
[0068]
肽激动剂
[0069]
本公开的一个方面涉及tacr2的肽激动剂或其药学上可接受的盐，用于治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症，其中所述肽激动剂包含肽或由肽组成。如下文“缀合部分”部分中所述，当tacr2的肽激动剂包含肽时，所述肽可与缀合部分共价连接。优选地，肽激动剂能够在表达tacr2的细胞中结合tacr2并导致ca
2
动员或肌醇积累增加。如上文“tacr2的激动剂”部分中所述，肽激动剂的特征在于对tacr2具有高亲和力。tacr2的肽激动剂的一些示例及其亲和力列于表1中。
[0070]
在一个实施方案中，肽激动剂包含神经激肽a(neurokinin a)或其功能类似物或由神经激肽a或其功能类似物组成。神经激肽a，也称为k物质，是一种从前原速激肽基因(pre-protachykinin gene)翻译而来的肽。神经激肽a可以通过选择性剪接从前原速激肽基因的不同同工型(isoform)翻译而来。在人，编码神经激肽a的基因存在两种同工型，并因此存在两种前体蛋白，即原速激肽-1同工型β前体(seq id no:12)和原速激肽-1同工型γ前体(seq id no:13)。类似地，小鼠中也存在编码神经激肽a的基因的两种同工型，并因此存在两种前体蛋白，称为原速激肽-1同工型2前体(seq id no:14)和原速激肽-1同工型1前体(seq id no:15)。
[0071]
在一些实施方案中，tacr2的肽激动剂包含神经激肽a的前体蛋白或其片段，或由神经激肽a的前体蛋白或其片段组成。因此，在一些实施方案中，肽激动剂包含seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的神经激肽a的前体蛋白或与其具有至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性的其功能类似物。优选地，肽激动剂包含人原速激肽-1同工型β前体或其片段，或由人原速激肽-1同工型β前体或其片段组成。更优选地，肽激动剂包含人原速激肽-1同工型γ前体或其片段，或由人原速激肽-1同工型γ前体或其片段组成。更优选地，肽激动剂包含鼠原速激肽-1同工型2前体或其片段，或由鼠原速激肽-1同工型2前体或其片段组成。更优选地，肽激动剂包
含鼠原速激肽-1同工型1前体或其片段，或由鼠原速激肽-1同工型1前体或其片段组成。
[0072]
在一些实施方案中，肽激动剂包含seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的神经激肽a的前体蛋白的片段或与其具有至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性的其功能类似物。因此，在一些实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的至多130个氨基酸残基的连续序列组成，或任意前述的与其具有至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性的功能类似物。例如，在一些实施方案中，肽激动剂可以由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15的至多130个氨基酸残基的连续序列组成，或任意前述的与其具有至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性的功能类似物，其中所述肽包含seq id no:16和/或seq id no:30的序列。
[0073]
优选地，tacr2的肽激动剂是神经激肽a的功能类似物。在一些实施方案中，tacr2的肽激动剂包含共有序列x6x1fx2x3x4x5[seq id no:30]或由其组成，并且其中
[0074]
x6＝天冬氨酸(e)或谷氨酸(d)；
[0075]
x1＝丝氨酸(s)或赖氨酸(k)；
[0076]
x2＝缬氨酸(v)或色氨酸(w)；
[0077]
x3＝甘氨酸(g)，β-丙氨酸(β-ala)；
[0078]
x4＝甲基-亮氨酸(me-leu)，l，γ-内酰胺-亮氨酸(γ-lactam-leu)；
[0079]
x5＝正亮氨酸(nle)，甲硫氨酸(m)。
[0080]
甚至更优选地，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由至少7个氨基酸且至多130个氨基酸的序列组成，其中所述序列包含seq id no:30。
[0081]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含seq id no：30的序列的至少7个且至多130个氨基酸残基组成。优选地，所述肽由包含seq id no:30的序列的至少7个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含seq id no:30的序列的至少7个且至多70个氨基酸残基，例如包含seq id no:30的序列的至少7个且至多50个氨基酸残基，例如包含seq id no:30的序列的至少7个且至多30个氨基酸残基，例如包含seq id no:30的序列的至少7个且至多20个氨基酸残基，例如包含seq id no:30的序列的至少7个且至多15个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，肽激动剂由seq id no:30的7个氨基酸残基组成。
[0082]
优选地，tacr2的肽激动剂是神经激肽a的功能类似物。在一些实施方案中，tacr2的肽激动剂包含共有序列dx1fx2x3x4x5[seq id no:16]或由其组成，并且其中
[0083]
x1＝丝氨酸(s)或赖氨酸(k)；
[0084]
x2＝缬氨酸(v)或色氨酸(w)；
[0085]
x3＝甘氨酸(g)，β-丙氨酸(β-ala)；
[0086]
x4＝甲基-亮氨酸(me-leu)，l，γ-内酰胺-亮氨酸(γ-lactam-leu)；
[0087]
x5＝正亮氨酸(nle)，甲硫氨酸(m)。
[0088]
甚至更优选地，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由至少7个氨基酸且至多130个氨基酸的序列组成，其中所述序列包含seq id no:16。
[0089]
在一些实施方案中，肽激动剂可包含非标准氨基酸残基，例如d-γ-内酰胺、β-丙氨酸、γ-内酰胺-亮氨酸、甲基-亮氨酸、正亮氨酸或可提高肽激动剂对tacr2的亲和力或其激动性行为的其他氨基酸。
[0090]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含seq id no:16的序列的至少7个且至多130个氨基酸残基组成。优选地，所述肽由包含seq id no:16的序列的至少7个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含seq id no:16的序列的至少7个且至多70个氨基酸残基，例如包含seq id no:16的序列的至少7个且至多50个氨基酸残基，例如包含seq id no:16的序列的至少7个且至多30个氨基酸残基，例如包含seq id no:16的序列的至少7个且至多20个氨基酸残基，例如包含seq id no:16的序列的至少7个且至多15个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，肽激动剂由seq id no:16的7个氨基酸残基组成。
[0091]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27以及其中至多2个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸的任何前述序列。
[0092]
特别地，tacr2的肽激动剂可以包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27以及其中至多1个氨基酸已被替换的任何前述序列。更优选地，tacr2的肽激动剂包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8,seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27。
[0093]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含选自以下的序列的至少7个且至多130个氨基酸残基组成：seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27以及其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸的任何前述序列。特别地，tacr2的肽激动剂可以由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少7个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少7个且至多70个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、
seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少7个且至多50个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少7个且至多30个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少7个且至多15个氨基酸残基。
[0094]
因此，在一些实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14或seq id no:15或任何前述的片段的7至130个氨基酸范围内，例如7至100个连续氨基酸范围内，例如7至50个连续氨基酸范围内，例如7至15个连续氨基酸范围内的连续序列，或任何前述的与其具有至少75％，例如至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％的序列同一性的功能类似物，其中所述肽包含选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8,seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列。
[0095]
在一个优选的实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由选自seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27的序列组成。
[0096]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含序列seq id no:2的至少7个且至多130个氨基酸残基组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。特别地，tacr2的肽激动剂可以由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含序列seq id no:2的至少7个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含序列seq id no:2的至少7个且至多70个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:2的至少7个且至多50个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:2的至少7个且至多30个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:2的至少7个且至多15个氨基酸残基。
[0097]
因此，在一些实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由seq id no:2的7至130个氨基酸范围内，例如7至100个连续氨基酸范围内，例如7至50个连续氨基酸范围内，例如7至15个连续氨基酸范围内的连续序列组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。
[0098]
在一个优选的实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由序列seq id no:2组成。
[0099]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含序列seq id no:1的至少10个且至多130个氨基酸残基组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。特别地，tacr2的肽激动剂可以由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含序列seq id no:1的至少10个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含序列seq id no:1的至少10个且至多70个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:1的至少10个且至多50个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:1的至少10
个且至多30个氨基酸残基，例如包含序列seq id no:1的至少10个且至多15个氨基酸残基。
[0100]
因此，在一些实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由seq id no:1的10至130个氨基酸范围内，例如10至100个连续氨基酸范围内，例如10至50个连续氨基酸范围内，例如10至15个连续氨基酸范围内的连续序列组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。
[0101]
在一个优选的实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由序列seq id no:1组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换。在一个优选的实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由序列seq id no:1组成。
[0102]
在一些实施方案中，肽激动剂包含序列dsfvglm(seq id no:2)或由其组成。优选地，肽激动剂包含神经激肽a(seq id no:1)或由其组成。优选地，肽激动剂是神经激肽a(seq id no:1)。
[0103]
在另一个实施方案中，tacr2的肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多130个氨基酸残基组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。特别地，tacr2的肽激动剂可以由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多100个氨基酸残基组成，例如包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多70个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多50个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多30个氨基酸残基，例如包含选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的至少10个且至多15个氨基酸残基。
[0104]
因此，在一些实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列的10至130个氨基酸范围内，例如10至100个连续氨基酸范围内，例如10至50个连续氨基酸范围内，例如10至15个连续氨基酸范围内的连续序列组成，其中至多2个例如至多1个氨基酸已被替换为标准或非标准氨基酸。
[0105]
在一个优选的实施方案中，肽激动剂由任选地与缀合部分连接的肽组成，其中所述肽由选自seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26和seq id no:27的序列组成。
[0106]
在一些实施方案中，肽激动剂包含选自以下的序列或由选自以下的序列组成：sktdsfvglm(seq id no:21)、hktdsfvglx(seq id no:22)、hktesfvglm(seq id no:23)、hktesfvglx(seq id no:24)、ktdsfvglm(seq id no:25)、kdsfvglm(seq id no:26)、kesfvglm(seq id no:27)。
[0107]
缀合部分(conjugated moiety)
id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9、seq id no:16、seq id no:21、seq id no:22、seq id no:23、seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27和seq id no:30。
[0123]
在一些实施方案中，缀合部分与如本文定义的肽激动剂的非末端氨基酸的侧链的氨基结合，例如与赖氨酸或精氨酸的γ-n结合。
[0124]
在一些实施方案中，缀合部分是脂质，并且它直接或通过另外的氨基酸与肽激动剂结合。在一个实施方案中，缀合部分是脂肪酸，例如缀合部分可以是c
6-40-亚烷基-cooh，例如c
8-30-亚烷基-cooh，例如c
10-25-亚烷基-cooh。在一个实施方案中，脂质选自癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸和花生酸。
[0125]
在一些实施方案中，缀合部分是与氨基酸连接的脂肪酸，例如缀合部分可以是-naa-c
6-40-亚烷基-cooh，例如
–
naa-c
8-30-亚烷基-cooh，例如
–
naa-c
10-25-亚烷基-cooh，其中naa可以是任何氨基酸，例如任何蛋白氨基酸，例如glu或asp。
[0126]
在一些实施方案中，缀合部分是-naa-肉豆蔻酸，并且它与肽激动剂的非末端赖氨酸的γ-氨基结合。例如，在一个实施方案中，缀合的肽激动剂是seq id no:1的肽，其中谷氨酸(glutamate)与seq id no:1的位置2处的赖氨酸的侧链的γ-n连接，并且其中肉豆蔻酸与所述谷氨酸(glutamate)的氨基连接。
[0127]
在一些实施方案中，缀合部分是-naa-棕榈酸，并且其与肽激动剂的非末端赖氨酸的γ-氨基结合。例如，在一个实施方案中，缀合的肽激动剂是seq id no:1的肽，其中谷氨酸(glutamate)与seq id no:1的位置2处的赖氨酸的侧链的γ-n连接，并且其中棕榈酸与所述谷氨酸(glutamate)的氨基连接。
[0128]
在一些实施方案中，缀合部分是-naa-硬脂酸，并且其与肽激动剂的非末端赖氨酸的γ-氨基结合。例如，在一个实施方案中，缀合的肽激动剂是seq id no:1的肽，其中谷氨酸(glutamate)与seq id no:1的位置2处的赖氨酸的侧链的γ-n连接，并且其中硬脂酸与所述谷氨酸(glutamate)的氨基连接。
[0129]
在一些实施方案中，缀合部分是棕榈酸，并且其与肽激动剂的n-末端氨基酸的氨基结合。例如，在一个实施方案中，缀合的肽激动剂是seq id no:1的肽，其中棕榈酸与所述肽的n-末端氨基酸的氨基连接。
[0130]
tacr2
[0131]
激动剂的特征在于对速激肽受体2(tachykinin receptor 2，tacr2)具有高亲和力并且是所述受体的激动剂。tacr2是一种g蛋白偶联受体(gpcr)，发明人发现其在冷暴露后在棕色和米色脂肪组织中被诱导。发明人发现，增加tacr2在棕色和米色脂肪细胞膜上的表达和存在，以及通过肽激动剂与tacr2的相互作用增加其活性，会导致棕色和米色脂肪细胞中的基础耗氧率(ocr)、去甲肾上腺素(ne)诱导的ocr以及最大呼吸增加。棕色和米色脂肪细胞在被ne激活后消耗脂肪和葡萄糖以产生热量。
[0132]
本发明的tacr2的激动剂可以与由seq id no:10组成的人tacr2和由seq id no:11组成的鼠tacr2相互作用。
[0133]
药物组合物
[0134]
本公开的一个方面涉及一种药物组合物，并且尤其涉及一种包含如本文所定义的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐的药物组合物，用于治疗有此需要的个体的肥胖症
和/或糖尿病。
[0135]
如上文“tacr2的激动剂”部分中定义的激动剂或其药学上可接受的盐可以是药物组合物的一部分并因此施用给受肥胖症和/或糖尿病影响的个体，如下文“治疗糖尿病和/或肥胖症的方法”部分中所述。
[0136]
本公开的另一个方面涉及如上文部分所定义的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐在制备用于治疗糖尿病和/或肥胖症的药物中的用途。
[0137]
尽管本发明的化合物或盐有可能作为未加工的肽激动剂被施用，但它们优选以药物制剂的形式呈现。因此，本发明进一步提供了药物制剂，其包含本文所定义的本发明的化合物或其药学上可接受的盐或酯，以及用于其的药学上可接受的载体。药物制剂可以通过常规技术制备，例如如remington(2005)所述。
[0138]
药物组合物可以包含如上文定义的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体和/或稀释剂。药学上可接受的载体和/或稀释剂是本领域技术人员熟知的。对于配制为液体溶液的组合物，可接受的载体和/或稀释剂包括盐水和无菌水，并且可以任选地包括抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和其他常用添加剂。
[0139]
尤其可以将包含本发明的tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐的药物组合物配制为胃肠外施用。因此，可以将本发明的药物组合物配制成多种用于胃肠外施用的制剂。
[0140]
对于注射和输注，制剂可以采用例如油性或水性媒介物中的悬浮剂、溶液或乳剂的形式，例如水性聚乙二醇中的溶液。或者，活性成分可以是粉末形式，通过无菌固体的无菌分离或通过从溶液中冻干获得，以便在使用前用合适的媒介物如无菌、无热原水进行重构。制剂可以呈现在单位剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿瓶、小瓶、预装注射器、输注袋，或者可以储存在冷冻干燥(冻干)条件下，只需要在紧接使用前添加用于注射的无菌液体赋形剂，例如水。即用注射溶液和悬浮剂可以由无菌粉末、颗粒和片剂制备。
[0141]
油性或非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物的示例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油和可注射有机酯，并且可以含有配制用剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂或悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。
[0142]
可以将药物组合物配制为用于任何类型的胃肠外施用。在优选的实施方案中，可以将药物组合物制备为用于向有此需要的个体进行皮下注射。
[0143]
治疗胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法
[0144]
本公开的一个方面涉及一种治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中所定义的tacr2的激动剂。本发明还提供了tacr2的激动剂，用于此类方法中，例如用于本部分中描述的方法中。
[0145]
本公开的另一个方面涉及一种治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法，其中所述方法包括通过向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中所定义的tacr2的激动剂来增强所述个体中棕色脂肪组织细胞的活性。
[0146]
本公开的另一个方面涉及一种诱导有此需要的个体的体重减轻的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中所定义的tacr2的激动剂。
[0147]
本公开的另一个方面涉及一种诱导有此需要的个体的体重减轻的方法，其中所述
方法包括通过向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中所定义的tacr2的激动剂来增强所述个体中棕色脂肪组织细胞的活性。
[0148]
在一些实施方案中，激动剂以如“药物组合物”部分所定义的药物组合物的形式施用。通常，激动剂是胃肠外施用的。例如，激动剂可以通过注射施用。激动剂可以通过皮下注射施用。
[0149]
在一些实施方案中，所施用的激动剂与棕色和米色脂肪细胞中的tacr2结合。
[0150]
所施用的激动剂可以对tacr2有多重作用。因此，优选地，它刺激棕色和米色脂肪细胞的tacr2表达和tacr2在细胞膜上的定位。它还优选地可以增加葡萄糖摄取，尤其是棕色脂肪细胞的葡萄糖摄取。它还优选地可以增加脂质摄取，尤其是棕色脂肪细胞的脂质摄取。它还优选地可以增加能量消耗，尤其是棕色脂肪细胞的能量消耗。它还优选地可以增加耗氧，尤其是棕色脂肪细胞中的耗氧。它还优选地可以增加热量产生，尤其是棕色脂肪细胞中的热量产生。这些作用有利于治疗肥胖症和/或糖尿病。
[0151]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加原代棕色脂肪细胞中的基础耗氧率。脂肪细胞中的耗氧可以使用本领域已知的方法测定，例如使用seahorse xf-96通量分析仪(seahorse xf-96flux analyzer)测定，也在实施例2中有描述。治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法还可以包括增加原代棕色脂肪细胞中的去甲肾上腺素诱导的耗氧率。治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法还可以包括增加原代棕色脂肪细胞中的最大耗氧率。
[0152]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加棕色和米色脂肪细胞中葡萄糖的吸收/摄取。因此，所述方法可导致血液葡萄糖水平降低。血液葡萄糖水平可以使用本领域已知的方法来评估。例如，葡萄糖耐受试验(glucose tolerance test，gtt)(也在实施例4中描述)，或口服葡萄糖激发试验(oral glucose challenge test，ogct)或技术人员认为合适的其他试验。
[0153]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加棕色和米色脂肪细胞的能量消耗。用于测定细胞的能量消耗的测定法是本领域中容易获得的，例如，能量消耗可以通过在代谢笼中对活体动物的间接量热法(即，o2消耗/co2产生)来测定，例如如实施例5中所述。能量耗费也可以通过植入动物组织中的温度计来测定，所述温度计记录动物核心和棕色脂肪温度响应于神经激肽a的升高。
[0154]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法包括通过施用如本文所公开的tacr2的激动剂来增加棕色和米色脂肪细胞的能量消耗，而不使所述棕色和米色脂肪细胞对所述tacr2的激动剂脱敏。
[0155]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法包括刺激棕色和米色脂肪细胞中内源性神经激肽a的释放。
[0156]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加棕色和米色脂肪细胞的tacr2表达并因此增加其在细胞膜上的定位。
[0157]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法包括诱导所述个体的体重减轻。
[0158]
在一些实施方案中，所述诱导的体重减轻对应于白色脂肪组织的减少。
[0159]
在一些实施方案中，所述诱导的体重减轻不对应于棕色和米色脂肪组织的减少。
[0160]
tacr2的激动剂的剂量可以取决于具体的激动剂和个体。在一些实施方案中，tacr2的激动剂，尤其是tacr2的激动剂可以例如以低于2μg/kg体重的剂量向人个体施用。在一些实施方案中，激动剂可以例如以0.05到2μg/kg体重之间，例如0.1到2μg/kg体重之间，例如0.5到2μg/kg体重之间，例如1到2μg/kg体重之间，例如0.1到1.5μg/kg体重之间，例如0.1到1μg/kg体重之间，例如0.1到0.5μg/kg体重之间的剂量向人个体施用。
[0161]
在一些实施方案中，有此需要的个体受肥胖症和/或糖尿病影响。所述个体可以是任何个体，例如所述个体可以是哺乳动物，尤其是人。
[0162]
在一个实施方案中，本发明涉及治疗糖尿病的方法，其中所述糖尿病例如选自1型糖尿病、2型糖尿病和妊娠糖尿病。所述糖尿病尤其可以是与胰岛素抵抗有关的糖尿病。
[0163]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加所述个体的胰岛素敏感性。胰岛素敏感性可以使用本领域已知的方法来测定，例如实施例4和5中描述的胰岛素耐受试验(itt)。
[0164]
在一些实施方案中，本发明提供了增加胰岛素敏感性和/或治疗胰岛素抵抗的方法。胰岛素抵抗可能是2型糖尿病的前兆，或者它可能与2型糖尿病有关。因此，治疗糖尿病和/或肥胖症的方法可以包括增加所述个体的胰岛素敏感性。测定胰岛素敏感性的方法是本领域已知的，并且可以是例如胰岛素耐受试验(itt)，其中在施用胰岛素后测定血液葡萄糖水平。可用的itt在实施例4和5中描述，并且技术人员将能够使其中描述的方法适用于其他哺乳动物，例如人。在一个实施方案中，胰岛素抵抗通过使用高胰岛素-正葡萄糖钳夹(hyperinsulinemic-euglycemic clamp)测定全身葡萄糖清除速率(gdr)来确定。gdr反映了完全补偿高胰岛素血症所需的外源葡萄糖量。可以例如如tam et al.,diabetes care.2012jul；35(7):1605-10.doi:10.2337/dc11-2339中所述来确定具体个体是否患有胰岛素抵抗。
[0165]
通常，血液葡萄糖水平由于施用胰岛素而降低，并达到c
min
。一段时间后，血液葡萄糖水平通常会再次升高，以回到施用胰岛素前所记录的水平。患有胰岛素抵抗的个体以不同的方式响应于胰岛素的施用，并且具体地，他们的响应具有以下特征：
[0166]-c
min
高于未患有胰岛素抵抗的个体的c
min
；和/或
[0167]-与未患有胰岛素抵抗的个体相比，达到c
min
和回到“胰岛素前葡萄糖水平”之间的时间间隔较短，所述“胰岛素前葡萄糖水平”是在施用胰岛素之前记录的血液葡萄糖水平。
[0168]
根据本公开的方法，施用tacr2的激动剂以治疗有此需要的个体的胰岛素抵抗、糖尿病和/或肥胖症，例如施用给患有或怀疑患有胰岛素抵抗的个体。患有或怀疑患有胰岛素抵抗并且根据本公开的方法(即通过施用tacr2的激动剂)来治疗的个体响应于胰岛素施用的方式不同于患有或怀疑患有胰岛素抵抗但未被施用如本文所公开的tacr2的激动剂的个体。具体地，已接受如本文所述的tacr2的激动剂的施用的个体具有特征在于以下的响应：
[0169]-c
min
较低；和/或
[0170]-达到c
min
和回到胰岛素前葡萄糖水平之间的时间间隔较长。
[0171]
所述响应可以与患有或怀疑患有胰岛素抗性但未被施用如本文所公开的tacr2的激动剂的个体相比，或与治疗前的相同个体相比。
[0172]
因此，在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法包括降低血液葡萄糖c
min
。
[0173]
在一些实施方案中，治疗有此需要的个体的糖尿病和/或肥胖症的方法包括增加响应于胰岛素而达到血液葡萄糖c
min
和回到胰岛素前葡萄糖水平(即，在施用胰岛素前记录的血液葡萄糖水平)之间的时间间隔，其中所述胰岛素是内源性或外源性的。
[0174]
在一些实施方案中，本公开涉及一种治疗有此需要的个体的肥胖症和/或肥胖相关疾病的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中定义的tacr2的激动剂。
[0175]
在其他实施方案中，本公开涉及一种治疗有此需要的个体的肥胖症和肥胖相关疾病的方法，其中所述方法包括通过向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中定义的tacr2的激动剂来增强所述个体中棕色脂肪组织细胞的活性。
[0176]
在进一步的实施方案中，本公开涉及一种诱导体重减轻的方法，其中所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中定义的tacr2的激动剂。
[0177]
在其他的实施方案中，本公开涉及一种诱导有此需要的个体的体重减轻的方法，其中所述方法包括通过向所述个体施用治疗有效量的如“tacr2的激动剂”部分中定义的tacr2的激动剂来增强所述个体中棕色脂肪组织细胞的活性。
[0178]
在一些实施方案中，肥胖症和/或肥胖相关病症通过将有此需要的个体的体重减少至少5％，例如至少6％，例如至少7％，例如至少8％，例如10％或更多来治疗。
[0179]
因此，在本公开的一些实施方案中，向患有或怀疑患有肥胖症和/或肥胖相关疾病的个体施用tacr2的激动剂或其药学上可接受的盐，并导致所述个体的体重减少至少5％，例如至少6％，例如至少7％，例如至少8％，例如10％或更多。
[0180]
在一个实施方案中，需要治疗的个体是患有超重、肥胖症和/或肥胖相关疾病如糖尿病或心脏病的个体。
[0181]
在一个实施方案中，需要治疗的个体的bmi为25或更高，例如30或更高，例如35或更高，例如40或更高。在另一个实施方案中，需要治疗的个体的腰/臀比为至少0.80，例如0.80-0.84，例如至少0.85(女性)，或至少0.90，例如0.9-0.99，例如高于1.00(男性)。在进一步的实施方案中，需要治疗的个体的空腹血液葡萄糖为至少6.1mmol/l，例如至少7.0mmol/l。在更进一步的实施方案中，需要治疗的个体的糖化血红蛋白水平为至少42mmol/mol，例如42至46mmol/mol，例如至少48mmol/mol。
[0182]
需要由所公开方法提供治疗的个体可表现出一种或多种以下症状：
[0183]
·
升高的血压：≥140/90mmhg；
[0184]
·
血脂异常(dyslipidemia)：甘油三酯(tg)：≥1.695mmol/l，以及高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)≤0.9mmol/l(男性)，≤1.0mmol/l(女性)；
[0185]
·
向心性肥胖(central obesity)：腰臀比》0.90(男性)；》0.85(女性)，或体重指数》30kg/m2；
[0186]
·
微量白蛋白尿(microalbuminuria)：尿白蛋白排泄率≥20μg/min或白蛋白:肌酐比≥30mg/g；
[0187]
·
高血糖症(hyperglycemia)：血糖水平高于11.1mmol/l(200mg/dl)或慢性糖水平(chronic sugar level)为5.6-7mmol/l(100-126mg/dl)。
[0188]
因此，肥胖相关疾病可以是与上述症状相关的疾病。
[0189]
序列
[0190]
[0191]
[0192]
[0193]
[0194]
实施例
[0195]
实施例1：响应于冷暴露和高脂肪饮食的脂肪组织中的tacr2表达
[0196]
动物
[0197]
所有动物实验均根据丹麦动物法规进行，可自由获取食物和水，并具有12小时明暗循环。雄性c57bl/6小鼠在4周龄时购自taconic(丹麦)，并在实验前适应1周。对于冷暴露研究，根据mri扫描(echomri，tx，usa)测定的小鼠体重和身体组成对小鼠进行随机分组，然后在冷暴露前在热中性(约28℃)下单屋饲养至少三周。对于高脂肪饮食研究，将雄性c57bl/6小鼠在室温下饲养并喂食60％高脂肪饮食(research diets，d12492，丹麦)7周。
[0198]
脂肪细胞分离(adipocyte fractionation)
[0199]
将来自饲养于热中性或冷条件下的4周龄雄性c57bl/6小鼠的肩胛间bat用ii型胶
原酶(sigma-aldrich，丹麦)于37℃下在水平振荡水浴中消化30分钟，并且每10分钟涡旋一次。通过离心分离基质血管部分(svf)和脂肪细胞部分。
[0200]
rna提取
[0201]
将组织用tri-reagent(invitrogen,丹麦)裂解，并用tissue lyser(thermo,丹麦)进行匀浆。根据制造商的方案，用qiagen rneasy mini kit(德国)提取rna。
[0202]
qpcr
[0203]
根据制造商的方案，使用ab高容量cdna逆转录试剂盒(applied biosystems，丹麦)制备互补dna，并使用sybr green(primer design，uk)在roche lc480(roche，瑞士)上进行qpcr。引物购自tag copenhagen(丹麦)，参见表2：
[0204]
表2：用于qpcr的引物
[0205]
引物序列36b4 fwdtcatccagcaggtgtttgaca36b4 revggcaccgaggcaacagtttacr2 fwdgcctccccacaatgtttctatacr2 revtgaggacaaacaccaccaga
[0206]
结果
[0207]
体内实验表明，与热中性(30℃)相比，在冷暴露(4℃)后肩胛间棕色脂肪组织(ibat)和腹股沟白色脂肪组织(iwat)中的tacr2被显著诱导。值得注意的是，在ibat和iwat中的冷诱导的tacr2表达在1周冷暴露结束时仍然被显著诱导，而不发生褐变(browning)或不引起明显的能量消耗的附睾白色脂肪组织(ewat)在冷激发下不会诱导tacr2表达(图1a-c)。在bat中的冷介导的tacr2诱导发生在成熟脂肪细胞和前脂肪细胞干细胞两者中(图2a-b)。此外，60％的高脂肪饮食激发增加了棕色脂肪细胞中的tacr2表达水平，这表明向肥胖个体施用tacr2激动剂如nka的治疗致敏(图2c)。
[0208]
结果：棕色脂肪细胞、前脂肪细胞干细胞和iwat中的tacr2表达响应于冷暴露而被诱导。棕色脂肪细胞中的tacr2表达水平也响应于高脂肪饮食而增加。
[0209]
实施例2：用nka处理的原代棕色脂肪细胞中的3-磷酸肌醇(ip3)水平和o2消耗
[0210]
原代脂肪细胞的分离、分化和培养
[0211]
通过使用1型胶原酶(worthington,nj,usa)于37℃下在水平振荡水浴中消化50分钟，并且每10分钟涡旋一次，来从肩胛间棕色脂肪垫中分离原代棕色前脂肪细胞。将胶原酶用不含游离脂肪酸的bsa(sigma-aldrich，丹麦)以1:10的比例在krb中稀释。通过添加生长培养基停止酶促反应，将细胞悬浮液沉淀，重悬于生长培养基中，然后通过40μm尼龙网(vwr，丹麦)过滤以避免组织团块。在补充有10％胎牛血清(invitrogen,丹麦)以及1％青霉素和链霉素(lonza,丹麦)的dmem(gibco,丹麦)中扩增前脂肪细胞，直至达到汇合。达到汇合后第一天，使用由胰岛素(0.5mg/ml)、罗格列酮(rosiglitazone)(1mm)、地塞米松(dexamethasone)(100μm)、ibmx(50mm)和t3(1μm)组成的混合物将原代棕色前脂肪细胞分化两天，此后在整个实验期间将细胞维持在含有胰岛素和t3的生长培养基中。维持培养基每两天更换一次。细胞在37℃和10％co2下生长。
[0212]
瞬时转染和处理
[0213]
在分化的第三天，细胞通过电穿孔瞬时转染或重新接种以进行实验。对于瞬时转
染，使用来自lonza(丹麦)的电穿孔机器程序a34和试剂盒，将含有小鼠tacr2编码序列的或空的pcdna3.1(genscript,nj,usa)电穿孔至脂肪细胞中。将脂肪细胞用神经激肽a(10-7m)处理指定时间。
[0214]
ip3测定
[0215]
在电穿孔后第一天，原代棕色脂肪细胞在完全维持培养基中加载5μci肌醇(myo-[3h]inositol)(perkin elmer，丹麦)，并孵育过夜。将细胞在补充有10mm licl的hbss中于37℃下用nka处理90分钟。处理后，用10mm甲酸提取细胞，并使用包被有聚l-赖氨酸的spa珠子(perkin elmer，丹麦)捕获细胞膜，并在top counter(perkin elmer，丹麦)上进行分析。
[0216]
氧消耗
[0217]
使用seahorse xf-96通量分析仪(seahorse bioscience，丹麦)测定氧消耗。在电穿孔后第一天，将原代棕色脂肪细胞接种在seahorse 96孔细胞培养板(seahorse biosciences，丹麦)中的完全维持培养基中，并在实验前培养额外四天。允许细胞在flux培养基中进行平衡，所述flux培养基由补充有0.5％不含游离脂肪酸的bsa(sigma-aldrich，丹麦)、25mm葡萄糖和1mm丙酮酸盐(company，country)的不含酚红的无缓冲dmem(sigma-aldrich，丹麦)组成，且ph调至7.4。所有读数均在两分钟内进行，并且混合进行三分钟。在ip3测定前24小时和在开始测定氧消耗前72小时(图3b的时间0)，将含有c-末端酰胺化的seq id no:1的神经激肽a(nka)添加到细胞中。将化合物在flux培养基中稀释，并在图3b所示的时间注射到细胞培养物中，以达到以下的最终浓度：去甲肾上腺素(5μm)、寡霉素(1μm)、fccp(1μm)、抗霉素a(1μm)和鱼藤酮(1μm)。实验是在暴露于nka 72小时的原代脂肪细胞上进行的(图3b)。
[0218]
结果：
[0219]
体外实验表明，24小时的nka处理增加了过表达tacr2的原代棕色脂肪细胞中的ip3水平(图3a)。实验还表明，72小时的nka处理在未用tacr2转染的原代棕色脂肪细胞中也会增加耗氧率(ocr)(图3b)。
[0220]
氧消耗增加表明棕色脂肪细胞响应于nka而能量消耗增加。
[0221]
实施例3
[0222]
在tacr2功能丧失研究中，使用条件性的和全身敲除的小鼠，在施用含有c-末端酰胺化的seq id no:1的神经激肽a(nka)或媒介物后，对原代棕色和米色脂肪细胞进行葡萄糖摄取研究。此外，还测试了nka介导的对人棕色和米色脂肪细胞呼吸能力的激动作用。能量消耗通过pet扫描来评估。
[0223]
实施例4：tacr2的激动作用对产热以及对肥胖和糖尿病相关并发症逆转的影响
[0224]
高脂肪饮食(hfd)
[0225]
向五周龄雄性c57bl/6小鼠喂食其中60％能量来自脂肪的hfd，直至小鼠变得肥胖(50g)且葡萄糖不耐受，作为2型糖尿病(t2d)的模型。
[0226]
瘦素缺乏(ob/ob)小鼠
[0227]
向ob/ob小鼠喂食普通饮食，直至小鼠变得肥胖且葡萄糖不耐受，作为t2d的遗传模型。
[0228]
多各低剂量链脲佐菌素(multiple low-dose streptozotocin，mlds)
[0229]
向喂食普通饮食的7周龄雄性c57bl/6小鼠每天施用链脲佐菌素注射(35mg/kg)，
连续5天(hansen jb et al.2012)，作为1型糖尿病(t1d)模型。
[0230]
胰岛素耐受试验(itt)
[0231]
向肥胖小鼠腹膜内(i.p.)注射胰岛素，并在两小时内评估葡萄糖水平。
[0232]
葡萄糖耐受试验(gtt)
[0233]
向肥胖小鼠腹膜内注射葡萄糖或给予口部强饲葡萄糖，并在两小时内评估葡萄糖水平。
[0234]
体重和身体组成
[0235]
在整个实验过程中监测体重和身体组成(通过mri扫描)。
[0236]
能量消耗
[0237]
在使用nka/媒介物进行处理的整个过程中，将小鼠饲养在tse间接量热系统中，以测定小鼠的食物和水摄入、体力活动、o2消耗和co2产生。
[0238]
实施例5
[0239]
动物
[0240]
所有动物实验均根据丹麦动物法规进行，可自由获取食物和水，并具有12小时明暗循环。雄性c57bl/6小鼠在4周龄时购自janvier(丹麦)，并在实验前适应1周。对于高脂肪饮食研究，将雄性c57bl/6小鼠在室温下饲养，并喂食60％高脂肪饮食(research diets，d12492，丹麦)18周。被喂食这种饮食后，小鼠变得高度肥胖，通常体重在42至45克之间。这些小鼠也可称为饮食诱导的肥胖(dio)小鼠。根据mri扫描(echomri,tx,usa)测定的小鼠体重和身体组成对小鼠进行随机分组，然后在治疗前单屋饲养至少一周。使用phenomaster(tse-systems,德国)测定氧气消耗和呼吸功能速率(respiratory efficiency rate，rer)。每隔一天人工评估食物消耗。
[0241]
神经激肽a处理(治疗)
[0242]
seq id no:1的神经激肽a(nka)由almac group(uk)定制合成并溶解在无菌盐水溶液中。对于处理，在皮下注射之前，将nka在(b.braun,dk)中稀释。每天对小鼠进行两次处理，持续9天。
[0243]
胰岛素耐受试验
[0244]
在腹膜内胰岛素耐受试验(ipitt)之前，将小鼠禁食3小时。胰岛素(actrapid，novo nordisk，dk)以治疗前测定的每kg瘦体重1iu的剂量给药。使用来自roche的血糖仪测定血液葡萄糖。较低的血液葡萄糖水平表明较高的胰岛素敏感性。
[0245]
结果
[0246]
神经激肽a治疗增加了饮食诱导的肥胖(dio)小鼠的卡路里燃烧(图4a)，并改善了其代谢参数。有趣的是，卡路里燃烧并不伴随着对nka的脱敏，事实上，图4a中显示的结果代表了连续9天的处理。还观察到体重显著降低(图4b)，这归因于白色脂肪组织的减少而不是棕色脂肪的减少，如图4d所示。此外，itt显示，经治疗的小鼠在胰岛素治疗后具有显著较低的血液葡萄糖水平，并因此具有高于对照小鼠的胰岛素敏感性。有趣的是，血液葡萄糖水平不仅较低，而且在达到c
min
后，还会以较慢的速度回到基础水平。
[0247]
实施例6
[0248]
肽设计与合成
[0249]
将nka设计为通过n-末端的脂肪酸酰化结合白蛋白或使白蛋白与lys2上的γ-glu
结合。将肽用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)或硬脂酸(c18)标记。还使用与ser残基偶联的甘露糖将nka糖基化。
[0250]
肽由almac group(苏格兰)使用树脂合成而合成，并通过rp-hplc纯化。肽通过hplc和质谱进行分析。
[0251]
实施例7
[0252]
ip3测定
[0253]
使用lipofectamine 2000(thermo fisher,丹麦)，用编码人或小鼠tacr1-3的质粒(pcdna3.1,genscript,nj,usa)瞬时转染hek293细胞。转染6小时后，细胞在完全维持条件下加载5μci肌醇(myo-[3h]inositol)(perkin elmer，丹麦)并培养过夜。将细胞在补充有10mm licl的hbss中于37℃下用nka类似物处理90分钟。处理后，用10mm甲酸提取细胞，并使用包被有聚l-赖氨酸的spa珠子(perkin elmer，丹麦)捕获细胞膜，并在top counter(perkin elmer，丹麦)上进行分析。
[0254]
将nka类似物溶解在dmso中，并在含有0.2％或2％w/v不含游离脂肪酸(ffa)的牛血清白蛋白(bsa)(sigma,丹麦)的pbs中稀释。
[0255]
使用graphpad prism 7(graphpad,ca,usa)分析数据，使用4参数逻辑曲线拟合。数据分析包括计算最高值、最低值、坡斜率(hill slope)以及logec50。
[0256]
体重减轻
[0257]
如上文实施例5中所述地制备饮食诱导的肥胖(dio)小鼠。每天一次地用1mg/kg[lys2-γ-glu-c16]nka或媒介物(含有3％w/v不含ffa的bsa和1.25％dmso的无菌过滤盐水溶液)的皮下注射(s.c.)处理dio小鼠，连续三天，然后是清洗期(washout period)和额外四次处理。在处理后监测小鼠以观察处理的持续效果。使用phenomaster(tse-systems，德国)监测食物摄入和卡路里燃烧。
[0258]
结果：ip3测定的结果表明，nka和nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)、硬脂酸(c18)或甘露糖标记)在鼠和人受体的情况下均对tacr2受体具有特异性；参见表3、4和5。
[0259]
表3：相对于tacr1，nka、sp、nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)、硬脂酸(c18)或甘露糖标记)和稳定的nka类似物(seq id no:2、5以及22至27)的tacr1激活数据。
[0260]
[0261][0262]
表4：相对于tacr2，nka、nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)、硬脂酸(c18)或甘露糖标记)和稳定的nka类似物(seq id no:2、5以及22至27)的
tacr2激活数据。
[0263]
[0264][0265]
表5：相对于tacr3，nka、nkb、nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)、硬脂酸(c18)或甘露糖标记)和稳定的nka类似物(seq id no:2、5以及22至27)的tacr3激活数据。
[0266]
[0267][0268]
ip3测定的结果表明，稳定的nka类似物(seq id no:2、5以及22至27)在鼠受体和人受体的情况下均对tacr2受体具有特异性；参见表4。
[0269]
nka和nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕榈酸(c16)或硬脂酸(c18)标记)具有低bsa结合亲和力，表明它们对tacr2具有特异性，如表5所示。
[0270]
表5：bsa的tcar2激活。nka和nka类似物(seq id no:1和21，用肉豆蔻酸(c14)、棕
榈酸(c16)或硬脂酸(c18)标记)的bsa结合
[0271][0272]
作为用[lys2-γ-glu-c16]nka处理的结果，观察到体重显著降低(图5a)，这归因于白色脂肪组织减少而不是棕色脂肪减少。当用[lys2-γ-glu-c16]nka处理小鼠时，食物摄入显著降低。用[lys2-γ-glu-c16]nka处理还增加了卡路里燃烧，如饮食诱导的肥胖(dio)小鼠的体重减轻(图5c)和代谢参数改善所示。
[0273]
参考文献
[0274]
ablas j.,van etten i.khanum a.et al.,1995.c-terminal truncation of the neurokinin-2 receptor causes enhanced and sustained agonist-induced signalling.the journal of biological chemistry,270,8944-8951.
[0275]
bellucci f,carini f,catalani c,cucchi p,lecci a,meini s,patacchini r,quartara l,ricci r,tramontana m,giuliani s,maggi ca.(2002)pharmacological profile of the novel mammalian tachykinin,hemokinin 1.br j pharmacol,135:266-274.
[0276]
bellucci f.et al.2002.pharmacological profile of the novel mammalian tachykinin,hemokinin 1,british journal of pharmacology 135:266-274.
[0277]
cannon and nedergaard,2004.brown adipose tissue:function and physiological significance.physiol.rev.,84(1):277-359.
[0278]
cypess a.m.,weiner l.s.,roberts-toler c.,franquet el
í
a e.,kessler s.h.,kahn p.a.,english j.,chatman k.,trauger s.a.,doria a.,kolodny g.m.,2015.activation of human brown adipose tissue by aβ3-adrenergic receptor agonist.cell metabolism,21(1):33-8.
[0279]
deal mj,hagan rm,ireland sj,jordan cc,mcelroy ab,porter b,ross bc,stephens-smith m,ward p.(1992)conformationally constrained tachykinin analogues:potent and highly selective neurokinin nk-2 receptor agonists.j.med.chem.,35(22):4195-204.
[0280]
d'orl
é
ans-juste p,dion s,drapeau g,regoli d.(1986)different receptors are involved in the endothelium-mediated relaxation and the smooth muscle contraction of the rabbit pulmonary artery in response to substance p and related neurokinins.eur.j.pharmacol.,125(1):37-44.
[0281]
douglas s.d.,leeman s.e.,barrett j.,dombrowsky e.,heyward c.y.,remeshwar p.tachykinin receptors:nk2 receptor.last modified on 02/04/2015.accessed on 17/03/2016.iuphar/bps guide to pharmacology,http://www.guidetopharmacology.org/grac/objectdisplayforward？objectid＝361.
[0282]
emonds-alt x,golliot f,pointeau p,le fur g,breliere jc.(1993)characterization of the binding sites of[3h]sr 48968,a potent nonpeptide radioligand antagonist of the neurokinin-2 receptor.biochem biophys res commun,191:1172-1177.
[0283]
hansen jb,tonnesen mf,madsen an,hagedorn ph,friberg j,grunnet lg,heller rs,nielsenj,baeyens l,anker-kitai l,qvortrup k,bouwens l,efrat s,aalund m,andrews nc,billestrup n,karlsen ae,holst b,pociot f,mandrup-poulsen t.(2012).divalent metal transporter 1 regulates iron-mediated ros and pancreaticβcell fate in response to cytokines.cell metab.16(4):449-61.
[0284]
matuszek ma,zeng xp,strigas j,burcher e.(1998)an investigation of tachykinin nk2 receptor subtypes in the rat.eur.j.pharmacol.,352(1):103-9.
[0285]
remington:the science and practice of pharmacy 2005,lippincott,williams&wilkins.
[0286]
sarau hm,griswold de,potts w,foley jj,schmidt db,webb ef,martin ld,brawner me,elshourbagy na,medhurst ad,giardina ga,hay dw.(1997)nonpeptide tachykinin receptor antagonists:i.pharmacological and pharmacokinetic characterization of sb 223412,a novel,potent and selective neurokinin-3 receptor antagonist.j pharmacol exp ther,281:1303-1311.
[0287]
van giersbergen pl,shatzer sa,burcher e,buck sh.(1992)comparison of the effects of neuropeptide k and neuropeptide gamma with neurokinin a at nk2 receptors in the hamster urinary bladder.naunyn schmiedebergs arch.pharmacol.,345(1):51-6.
[0288]
warner fj,comis a,miller rc,burcher e.(1999)characterization of the
[125i]-neurokinin a binding site in the circular muscle of human colon.br.j.pharmacol.,127(5):1105-10.
[0289]
warner fj,mack p,comis a,miller rc,burcher e.(2001)structure-activity relationships of neurokinin a(4-10)at the human tachykinin nk(2)receptor:the role of natural residues and their chirality.biochem pharmacol,61:55-60.