一种延龄草中皂苷的提取及转化方法与流程

1.本发明属于天然植物活性成分提取分离转化技术领域，具体涉及一种延龄草中皂苷的提取及转化方法。


背景技术：

2.延龄草，顾名思义，能延长寿命的草药，是土家族四大神药之一，也是我国三级保护植物。延龄草为百合科(亦有认为是藜芦科)延龄草属。延龄草属全世界大约有50多种，我国仅3种，依次为延龄草 (trillium tschonoskii maxim.)、吉林延龄草(trilliumcamschatcense ker gawl.)和西藏延龄草(trillium govanianumwall.ex d.don)，主要分布于西南、西北和东北等地，福建地区以延龄草(trillium tschonoskii maxim)为主。延龄草含有一些特殊的次级代谢产物，包括皂苷、黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷等化合物[i]。其中，甾体皂苷被认为是延龄草主要功效成分，其生理活性有抗肿瘤、抗炎、镇痛等[1]。从延龄草中已分离鉴定出多种的甾体皂苷，主要有偏诺皂苷元-3-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)-β-d-葡萄糖苷、偏诺皂苷元-3-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
4)-[α-l-吡喃鼠李糖基-(1
ꢀ→
2)]-β-d-葡萄糖苷(2)、偏诺皂苷元-3-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
ꢀ→
4)-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
4)-[α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)]-β
ꢀ‑
d-葡萄糖苷[ii]，薯蓣皂苷-3-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)-β-d-葡萄糖苷、薯蓣皂苷-3-o-α-l-吡喃鼠李糖基-(1
→
2)-[o-α-l
‑ꢀ
呋喃阿拉伯糖基-(1
→
4)]-β-d-葡萄糖苷[iii]。
[0003]
延龄草皂苷种类多且苷元的结构较为相似高，这给延龄草皂苷的纯化造成一定困难。中国专利cn201911385676.6公开了延龄草总皂苷的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：取延龄草干燥后粉碎，用乙醇浸泡数小时后，回流提取，减压浓缩提取液，冷冻干燥，得到延龄草总提物；将延龄草总提物加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩，冷冻干燥，得到萃取物用大孔吸附树脂分离，甲醇洗脱、浓缩干燥，即为延龄草总皂苷。该工艺流程相对复杂，且最终产物为皂苷混合物。中国专利cn201611025739.3采用醇提、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取、硅胶柱层析、ods柱色谱分离等工艺方法，从延龄草根茎中分离出一种新皂苷。以上方法流程长、步骤繁琐、工艺成本也高昂。
[0004]
延龄草提取物具有一定的毒性。《吉林中草药》在头顶一颗珠(延龄草的别名)注释说明，“本品有毒，用时注意。《中华本草》在该植物的性味定位为：甘、微辛、温、有小毒。发明人在对延龄草的醇提物进行生物活性测试时，发现其具有很强的细胞毒性，进一步测试发现该毒性主要来源于醇提物中的皂苷类成分。
[0005]
因此，在业界如何将延龄草中种类繁多的皂苷转化为以偏诺皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖和薯蓣皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖，并使上述皂苷结晶从而得到高纯度皂苷，简化了延龄草皂苷的分离纯化工艺，同时也降低了其细胞毒性一直是有待解决的问题。


技术实现要素：

[0006]
针对以上问题，本发明提供了一种延龄草中皂苷的提取及转化方法。
[0007]
为实现上发明目的，本发明采用如下技术方案：
[0008]
一种延龄草中皂苷的提取及转化方法，包含以下工艺步骤：
[0009]
(1)提取
[0010]
将延龄草根粉碎至10目以下或切片；用30％～95％乙醇作溶剂，料液比1:2～1:30、浸提温度50℃～90℃、浸提时间0.5h～6h、浸提次数为1～3次；合并浸提液，真空浓缩至无乙醇味；
[0011]
(2)酶解
[0012]
往浓缩液中加水至呈非膏状，再按0.01％～5％比例加入糖苷水解酶，在适合的温度下酶解，至酶解液变浑浊；
[0013]
(3)降温结晶
[0014]
将酶解液冷却并保持1～72h，有沉淀继续析出；过滤或离心，收集沉淀物s1；
[0015]
(4)重结晶
[0016]
将沉淀物s1用10％～50％乙醇加热溶解，趁热过滤，滤液自然冷却有沉淀物析出，过滤或离心，收集沉淀物s2。
[0017]
进一步，沉淀物s2用40％以上的乙醇溶解，注入制备柱分离系统，用60％
→
70％乙醇梯度洗脱，设置紫外检测器波长，并根据谱图分别收集到两流份，真空浓缩除去收集液中的乙醇即有固体析出，经过滤、真空干燥后得到粉末m1、m2。
[0018]
进一步，步骤(2)所用的糖苷水解酶为鼠李糖苷酶或柚苷酶。
[0019]
进一步，步骤(2)所用的糖苷水解酶的添加量为浓缩液质量的 0.01％～5％，温度为40～60℃；酶解时间为8～72h。
[0020]
进一步，步骤(3)冷却结晶温度为0～25℃。
[0021]
进一步，步骤(4)所得到的产物s2为偏诺皂苷元-葡萄糖苷
‑ꢀ
鼠李糖和薯蓣皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖混合物。
[0022]
进一步，所得到的粉末m1、m2为偏诺皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖和薯蓣皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖。
[0023]
进一步，步骤(2)所用的糖苷水解酶的添加量为浓缩液质量的 1％，温度为50℃；酶解时间为36h。
[0024]
进一步，步骤(3)冷却结晶温度为5℃。
[0025]
采用上述技术方案，本发明属于天然植物活性成分提取分离技术领域，具体涉及一种延龄草中皂苷的提取及转化方法。通过酶解法将延龄草中种类繁多的皂苷转化为以偏诺皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖和薯蓣皂苷元-葡萄糖苷-鼠李糖，并通过降温法使上述皂苷结晶从而得到高纯度皂苷，简化了延龄草皂苷的分离纯化工艺，同时也降低了其细胞毒性。
附图说明：
[0026]
图1延龄草提取液的液相色谱图(205nm)；
[0027]
图2延龄草酶解液的液相色谱图(205nm，2h)；
[0028]
图3沉淀物s2的液相色谱图(205nm)；
[0029]
图4产物m1的液相色谱图(205nm)；
[0030]
图5产物m2的液相色谱图(205nm)；
[0031]
图6延龄草提取液的总离子色谱图(正离子)；
[0032]
图7沉淀物s2的总离子色谱图(正离子)；
[0033]
图8峰(rt＝6.46min)的质谱图pennogenin glc rha rha；
[0034]
图9峰(rt＝17.71min)的质谱图pennogenin glc rha；
[0035]
图10峰(rt＝17.98min)的质谱图diosgenin glc rha rha；
[0036]
图11峰(rt＝min)的质谱图diosgenin glc rha；
[0037]
图12nih/3t3细胞毒性测试。
具体实施方式
[0038]
以下通过附图1-12及具体实施方式对本发明做进一步解释说明，所描述的仅是本发明的部分实施实例，不对本发明的内容有所限制。本领域相关研究人员在没有做出任何创新性贡献的前提下所进行的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0039]
一种延龄草中皂苷的提取及转化方法，包含以下工艺步骤：
[0040]
(1)提取
[0041]
将延龄草根粉碎至10目以下或切片；用30％～95％乙醇作溶剂，料液比1:2～1:30、浸提温度50℃～90℃、浸提时间0.5h～6h、浸提次数为1～3次；合并浸提液，真空浓缩至无乙醇味；
[0042]
(2)酶解
[0043]
往浓缩液中加水至呈非膏状，再按0.01％～5％比例加入糖苷水解酶，在适合的温度下酶解，至酶解液变浑浊；
[0044]
(3)降温结晶
[0045]
将酶解液冷却并保持1～72h，有沉淀继续析出；过滤或离心，收集沉淀物s1；
[0046]
(4)重结晶
[0047]
将沉淀物s1用10％～50％乙醇加热溶解，趁热过滤，滤液自然冷却有沉淀物析出，过滤或离心，收集沉淀物s2。
[0048]
进一步，沉淀物s2用40％以上的乙醇溶解，注入制备柱分离系统，用60％
→
70％乙醇梯度洗脱，设置紫外检测器波长，并根据谱图分别收集到两流份，真空浓缩除去收集液中的乙醇即有固体析出，经过滤、真空干燥后得到粉末m1、m2。
[0049]
具体以下述实施例为例进一步说明：
[0050]
实施方式1
[0051]
(1)浸提
[0052]
取1kg延龄草根粉碎至10目以下，用75％乙醇作溶剂，料液比 1:10、浸提温度75℃、浸提时间3h、浸提次数为2次；合并浸提液，真空浓缩回收乙醇，得1.5kg浓缩液。
[0053]
(2)酶解
[0054]
称取30g鼠李糖苷酶(盛夏)用2kg纯水溶解的酶溶液，将酶溶液加入到浓缩液中，在50℃保温酶解48h，溶液不断变浑浊。
[0055]
(3)降温结晶
[0056]
将酶解液冷却至5℃并保持24h，有大量沉淀析出；趁冷将酶解液经3000g离心15min，弃上清液得沉淀物。
[0057]
(4)重结晶
[0058]
将沉淀物用200ml 40％乙醇加热溶解，趁热过滤得滤液，滤液经真空旋蒸回收部分酒精，然后自然冷却至室温并保持12h，有大量沉淀物析出，3000g离心15min，收集沉淀物。
[0059]
(5)干燥
[0060]
沉淀物经真空干燥，得到类白色粉末12.7g。
[0061]
实施方式2
[0062]
(1)浸提
[0063]
取100g延龄草根粉碎至10目以下，用70％乙醇浸提两次，浸提温度75℃、浸提时间2h、70％乙醇用量为1l；合并浸提液，真空浓缩回收乙醇，得200ml浓缩液。
[0064]
(2)酶解
[0065]
称取50g柚苷酶(博皓)用500ml纯水溶解的酶溶液，将酶溶液加入到浓缩液中，在50℃保温酶解24h，溶液不断变浑浊。
[0066]
(3)降温结晶
[0067]
将酶解液冷却至5℃并保持24h，有大量沉淀析出；趁冷将酶解液经3000g离心15min，弃上清液得沉淀物。
[0068]
(4)重结晶
[0069]
将沉淀物用20ml 30％乙醇加热溶解，趁热过滤得滤液，往滤液中加入50ml热水并于冰箱冷藏24h，有大量沉淀物析出，3000g离心 15min，收集沉淀物。
[0070]
(5)c18制备色谱柱分离
[0071]
沉淀物用20ml60％乙醇溶解，过滤后注入c18制备柱分离系统，用80％
→
90％乙醇梯度洗脱，设置紫外检测器波长为205nm，并根据谱图可分别收集到两流份，旋蒸除去大部分乙醇后立即有固体析出，经过滤、真空干燥后分别得到两白色固体粉末0.36g(m1)和0.49g(m2)。
[0072]
实施方式3
[0073]
(1)提取
[0074]
取10kg延龄草根用切片机切成薄片，投入提取釜内，再投入60％乙醇70kg作溶剂，设置浸提温度为70℃、浸提时间为3h，浸提2次；浸提完成后，将料液经800目的滤网抽至浓缩釜，真空浓缩回收乙醇，得浓缩液约30kg。
[0075]
(2)酵解
[0076]
将菌种鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)先用mrs液体培养基活化2～3代，再用柚皮苷替换mrs液体培养基中的部分葡萄糖驯化3～5代，最后利用驯化好的菌种发酵提取液。将mrs液体培养基按2:1与浓缩液混合，并接种经驯化菌种，发酵温度为35℃，发酵时间为5～7天。
[0077]
(3)沉淀
[0078]
将发酵液加热至95℃并保温1h灭活，再加入沉淀剂聚合氯化铝 0.5kg，自然冷却后弃上清液得沉淀物。
[0079]
(4)结晶
[0080]
将沉淀物用5kg 50％乙醇加热至70℃并搅拌分散，趁热过滤得滤液，滤液减压浓
of trillium tschonoskii maxim.[j]. biochemical systematics&ecology,2012,44(none):112-116.