中药水莴苣抗心衰新用途

1.本发明涉及中医药领域，具体涉及中药水莴苣抗心衰的新用途。


背景技术：

2.心衰，即心力衰竭，是指在适量静脉回流的情况下，由于心肌舒张或/和收缩功能障碍，心排血量不足以维持组织代谢需要而引起的以循环功能障碍为主的综合征。临床症状通常为呼吸困难、体液潴留(肺淤血、体循环淤血及外周水肿)、运动耐受性降低和生存时间明显缩短。心衰多发于有基础性心脏疾病的患者，比如高血压、心律失常等，是各种心血管疾病的严重阶段或终末阶段主要病因为由原发性心肌损害或心脏长期容量和(或)压力负荷过重，导致心肌功能由代偿发展为失代偿，该病不能治愈且患病率、住院率和死亡率高，治疗目标是为了防止和延缓心衰的发生发展，缓解临床症状，提高生活质量，改善长期预后，降低病死率与住院率。
3.中医学并没有“心衰”这一病名，但根据心衰的症状及体征，其相当于中医学“心悸”“心水”“水肿”等疾病。目前西药治疗心衰，主要以利尿剂、肾素-血管紧张素系统抑制剂、醛固酮受体拮抗剂、正性肌力药、扩血管药物等治疗为主。但长期服西药副作用大，疗效不甚理想。而中医药具有多途径、多靶点、副作用小、受众广等优点，近年来，中医药联合西药常规治疗心衰的优势渐显，如芪苈强心胶囊。
4.因此本领域迫切需要研发一种有效抗心衰的药物。而水莴苣(veronica anagallis-aquatica)，逐渐引起本发明人的注意。水莴苣为玄参科植物北水苦荬的别称，又可称水菠菜、大仙桃草、水仙桃草、接骨桃、水波浪、无风自动草等等，目前尚无水莴苣应用在抗心衰方面的用途。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于研发一种能有效治疗心衰的药物，具体地，本发明涉及研发水莴苣及其提取物在抗心衰方面的新用途。
6.在本发明的第一方面，提供了一种中草药水莴苣的用途，用于制备一种组合物或制剂，所述复方或制剂用于抗心衰。
7.在另一优选例中，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种应用：
8.(i)减少心肌细胞损伤，提高心肌细胞存活率；
9.(ii)降低心肌细胞活性氧的生成；
10.(iii)改善心功能；
11.(iv)减少心肌纤维化。
12.在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、膳食补充剂、食品组合物、保健品组合物。
13.在另一优选例中，所述组合物或制剂包含：
14.(a)作为活性成分的水莴苣提取物；
15.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
16.在另一优选例中，所述提取物为选自下组水莴苣部位的提取物：全草、根、茎、叶、花、或其组合。
17.在另一优选例中，所述提取物为水提取物或有机溶剂提取物。
18.在另一优选例中，所述提取物为水莴苣全草的75％乙醇提取物。
19.在另一优选例中，所述组合物或制剂含有制备分离水莴苣提取物得到的组分作为活性成分。
20.在另一优选例中，所述提取物为选自下组水莴苣部位的提取物：全草、根、茎、叶、花、或其组合。
21.在另一优选例中，所述提取物为水提取物或有机溶剂提取物。
22.在另一优选例中，所述制备分离采用spe固体萃取技术进行。
23.在另一优选例中，所述药物组合物为注射用药或口服药物。
24.在另一优选例中，所述药物组合物的形式选自下组：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂、或其组合。
25.在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物和/或保健品组合物和/或产品，包含：
26.(a1)选自下组的水莴苣不同部位的提取物作为抗心衰的活性成分：全草、根、茎、叶、花、或其组合。
27.(a2)选自下组的其他抗心衰活成分：人参皂苷、槲皮素、芹菜素、木犀草素、大黄酚、齐墩果酸、原儿茶醛、异黄酮、卡托普利、依那普利、贝那普利、福辛普利、坎地沙坦、缬沙坦、氯沙坦、螺内酯、依普利酮、呋塞米、氢氯噻嗪、阿米洛利、托伐普坦、比索洛尔、卡维地洛、美托洛尔、地高辛、多巴胺、米力农、左西孟旦、或其组合；
28.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
29.在另一优选例中，所述提取物为水提取物或有机溶剂提取物。
30.在本发明的第三方面，提供了一种抗心衰方法，给有需要的对象施用医学有效量的选自下组的水莴苣不同部位的提取物作为抗心衰活性成分：全草、根、茎、叶、花、或其组合。
31.在另一优选例中，所述对象为心衰患者。
32.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
33.图1显示了在实施例2中，水莴苣提取物和活性分段e0-e7的色谱图。
34.图2显示了在实施例3中，结晶紫染色的结果以及染色面积定量结果。
35.图3显示了在实施例3中，活性氧生成检测的结果。
36.图4显示了在实施例3中，ldh释放检测的结果。
37.图5显示了在实施例4中，鬼笔环肽染色的结果。
38.图6显示了在实施例6中，cck8检测原代心肌细胞存活率的结果。
39.图7显示了在实施例8中，小鼠心脏超声的结果。
40.图8显示了在实施例8中，小鼠心脏切片染色的结果以及纤维化面积定量结果。
具体实施方式
41.本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现中药水莴苣的提取物能有效抗心衰，在此基础上完成了本发明。
42.具体地，本发明发现水莴苣的全根、茎、叶、花的提取物，包括其水提取物和有机溶剂提取物，具有有效的抗心衰的效果，可以用于制备抗心衰的药物。本发明实验表明水莴苣提取物可以降低心肌细胞损伤、降低心肌细胞活性氧的生成、改善左心室心功能、减少心肌纤维化。并且水莴苣提取物在抗心衰的同时心脏毒性低，具有极好的临床价值。
43.术语
44.如本文所用，“本发明的化合物”指的是水莴苣的提取物，或含有一段或多段制备分离水莴苣提取物所得的组分，具有良好的抗心衰功能。
45.水莴苣
46.水莴苣为多年生水生或沼生草本，具根状茎，花序腋生，蒴果呈卵圆形。花期6～8月份，果期7～9月份。适生于水边湿地及浅水沟中，广布于长江以北及西南各省区，夏季采收。全草可入药，临床上主治清热利湿，止血化瘀，治感冒，喉痛，痨伤咳血，痢疾，血淋，月经不调，疝气，疔疮，跌打损伤，并且于《救荒本草》中记载：“救饥採苗葉煠熟水淘净油鹽调食”，水莴苣为可食用的药材。目前未见水莴苣有心衰相关的研究。
47.药物组合物及施用方法
48.本发明还提供了含有本发明活性成分的组合物或制剂或产品，所述组合物或制剂或产品可用于抗心衰。代表性的组合物或制剂或产品包括抗衰老的药物、保健品、和化妆品。
49.一种优选的组合物是药物组合物，包含：
50.(a1)选自下组的水莴苣不同部位的提取物作为抗心衰的活性成分：全草、根、茎、叶、花、或其组合。
51.(a2)选自下组的其他抗心衰活成分：人参皂苷、槲皮素、芹菜素、木犀草素、大黄酚、齐墩果酸、原儿茶醛、异黄酮、卡托普利、依那普利、贝那普利、福辛普利、坎地沙坦、缬沙坦、氯沙坦、螺内酯、依普利酮、呋塞米、氢氯噻嗪、阿米洛利、托伐普坦、比索洛尔、卡维地洛、美托洛尔、地高辛、多巴胺、米力农、左西孟旦、或其组合；
52.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
53.本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
54.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用
率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
55.典型地，当以口服方式给予本发明的活性成分，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。
56.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
57.心衰
58.心力衰竭，简称心衰，是心脏收缩和/或舒张功能受损、射血及充盈能力减退导致组织灌注不足的一组临床疾病，早已成为全球流行性疾病，其住院率、相关死亡人数以及治疗护理费用都在不断的增加。心衰是一种复杂的临床综合征，是许多心血管疾病的“最后共同通路”，其中冠状动脉疾病(如心肌梗死、心肌缺血)、高血压是最主要的病因。除此之外，一些非心源性的全身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮)和恶性肿瘤等也会导致心衰。
59.心衰的诊断一般通过病史和体格检查、胸片、心电图、血生化及生物标志物检查等来进行。心衰患者的症状和体征根据心衰的代偿程度和受累的心室不同存在着较大的个体差异，代偿良好的患者可以无症状和体征，因此早期发现与诊断困难。其中一些经典的患者自述症状包括疲劳，静息或运动时气短，呼吸急促/困难，咳嗽，运动耐量减退，端坐呼吸，阵发性夜间呼吸困难，夜尿，体重增加/减轻，水肿，腰围增加，腹痛(尤其右上腹)，胃食欲缺乏，易饱，睡觉时有陈氏呼吸，嗜睡且精神差等。并且心衰患者往往伴随有糖尿病、高血压、房性/室性心动过速、脑血管意外、高血脂、肝脏疾病、慢性肾功能不全、慢性阻塞性肺病等并发症。
60.心衰的治疗分为药物治疗、冠脉搭桥术、瓣膜修复或置换术、心脏移植等。其中药物治疗包括血管紧张素转化酶抑制剂/血管紧张素ⅱ受体抑制剂(acei/arb)、醛固酮受体拮抗剂、β-受体阻滞剂、利尿剂、钙通道阻滞剂、强心苷类、中药/中成药等。
61.本发明的主要优点包括：
62.(a)首次发现，本发明的活性成分能有效抗心衰。
63.(b)本发明的活性成分来源于药食同源的中药，安全性佳，在有效抗心衰的同时对心脏的毒性较小，具有极好的临床推广价值。
64.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
65.实施例1：水莴苣提取物的制备
66.将水莴苣植物全株自然阴干，称取105g，粉碎到30目，用75％乙醇在95℃条件下回流提3次，每次2h，提取液合并，减压浓缩提取液得浸膏24.8g，计算得率为23.6％。
67.实施例2：水莴苣提取物活性分段的制备
68.采用spe固体萃取技术进行水莴苣提取物的进一步分离制备。取c18(7mm)填料10g，装入50ml萃取柱，依次使用50ml甲醇活化萃取柱，30ml 5％甲醇平衡。用纯水溶解经实例1制备得到的水莴苣提取物，配制溶液浓度约40mg/ml，每次上样5ml，5.依次使用30ml 5％甲醇、30ml 15％甲醇，30ml 30％甲醇和30ml 100％甲醇洗脱，收集馏分，冻干。
69.共收集到8个馏分，依次编号为e0-e7。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在90％乙腈，10％水，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对各馏分进行色谱分析，结果如图1所示。
70.实施例3：水莴苣提取物在体外氧糖剥夺模型下对h9c2(2-1)细胞的保护作用
71.3.1方法
72.将培养好的大鼠心肌细胞h9c2(2-1)消化计数后按80000/孔的数量接种至12孔板中，待细胞长至70-80％密度后，用培养基将水莴苣提取物母液稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，12小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度水莴苣提取物的pbs，并将孔板置于缺氧小室中，n2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养6小时。对照组细胞继续放在细胞培养箱中正常培养。
73.3.2结果
74.3.2.1结晶紫染色
75.结晶紫染色液是一种可以把细胞核染成深紫色的染色液。染色结果可以表征细胞数量。在造模6小时后按试剂盒操作方法对细胞进行染色，染色完成后在显微镜下进行观察与拍摄，并用image j软件对染色部分进行定量，用graph pad 7.00软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。
76.如图2所示，模型组的染色面积相较于对照组明显减少，而水莴苣提取物处理组的染色面积相较于模型组增多，且呈现浓度依赖性，水莴苣提取物400μg/ml处理组的细胞数量最多，即对细胞的保护作用最显著。误差棒标识的是平均数标准误差(sem)，
#
：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
77.3.2.2细胞活性氧检测
78.已有研究表明过多的活性氧对心肌细胞有显著的损伤，减少氧糖剥夺模型下产生的活性氧可对细胞起到保护作用。可利用荧光探针dcfh-da进行活性氧检测。在造模6小时后按活性氧检测试剂盒操作方法进行操作并于荧光显微镜下进行观察与拍摄。
79.如图3所示，对照组细胞基本没有活性氧生成，而经过氧糖剥夺处理的细胞均有活性氧产生，200μg/ml和400μg/ml水莴苣提取物处理组细胞产生的活性氧较模型组显著减少，尤其400μg/ml水莴苣提取物处理组，表明水莴苣提取物可通过减少活性氧的产生来发挥细胞保护作用。
80.3.2.3细胞ldh释放检测
81.ldh为乳酸脱氢酶，心肌细胞中含量较高。当心肌细胞受损时，ldh会通过受损的细胞膜漏出到培养基中，因此检测培养基中ldh的含量可用来表征心肌细胞的损伤程度。在造模6小时后，取各组细胞的培养基按ldh检测试剂盒的操作步骤进行检测，酶标仪于490nm下检测吸光值，用graph pad 7.00软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。
82.如图4所示，氧糖剥夺处理后模型组ldh的释放量显著增加，而400μg/ml水莴苣提取物处理使得ldh释放量较模型组有所下降，体现了对心肌细胞的保护作用。误差棒标识的是平均数标准误差(sem)，
#
：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
83.实施例4：水莴苣提取物在体外氧糖剥夺模型下对大鼠心肌细胞的形态维持作用
84.心肌细胞在体外氧糖剥夺模型下处于饥饿状态，细胞皱缩，细胞大小相较于正常细胞减小。ifluor
tm 647标记的鬼笔环肽选择性结合于丝状肌动蛋白f-actin，可用来标记细胞中的f-actin从而呈现出细胞形态。
85.4.1方法
86.将培养好的大鼠心肌细胞h9c2(2-1)消化计数后按50000/ml的密度接种至20mm共聚焦小皿中，待细胞长至40-50％密度后，用培养基将水莴苣提取物母液稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，15小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度水莴苣提取物的pbs，并将孔板置于缺氧小室中，n2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养3小时。在造模3小时后按试剂盒操作方法对细胞进行染色，并用dapi对细胞核进行复染，并于共聚焦显微镜下进行观察与拍摄。
87.4.2结果
88.如图5所示，氧糖剥夺处理后模型组细胞呈现出不舒展的皱缩状态且细胞表面积缩小，丝状肌动蛋白纹理模糊，400μg/ml水莴苣提取物处理后的细胞仍呈现出与对照组相当的典型形态，丝状肌动蛋白纹理清晰，表明水莴苣提取物对心肌细胞氧糖剥夺损伤状态下的细胞形态有较好的维持作用。
89.实施例5：新生sd大鼠原代心肌细胞提取
90.心肌细胞具有不可心肌细胞具有不能增殖的特性，原代心肌细胞较细胞系h9c2(2-1)，体现了这一特性，可以避免因测试药物对细胞系的促细胞增殖带来的假阳性。
91.我们从出生1-3天的新生sd大鼠中取出心脏，用pbs(磷酸缓冲盐)冲洗血迹。用眼科剪将心脏剪成糜状组织块，再用pbs冲洗，除去残余血迹，吸走pbs，加入1％ii型胶原酶，移至15ml离心管中，37℃水浴消化10分钟，用移液枪反复吹打5分钟，再继续37℃水浴消化，重复三次，组织块消化完全后过200目筛网，细胞液1000rpm离心5分钟，弃上清，用心肌细胞专用培养基将细胞重悬，转移至10cm培养皿中于37℃培养箱内培养30分钟，吸取悬液重新接种于另一培养皿中，加入0.1mm的5-brdu后继续于37℃培养箱内培养。每48小时换一次液。
92.实施例6：水莴苣提取物在体外氧糖剥夺模型下对原代大鼠心肌细胞的保护作用
93.6.1方法
94.实施例5中提取得到的原代心肌细胞培养一段时间后，消化计数按10000/孔的密度接种至96孔板中。24小时后，用培养基将水莴苣提取物母液稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，6小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度水莴苣提取物的pbs，并将孔板置于缺氧小室中，n2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养3小时。对照组细胞继续放在细胞培养箱中正常培养。结束缺氧培养后，将孔板从缺氧小室中取出，所有孔板吸除培养液，每孔加入100μl含10％cck检测试剂的培养基，放回培养箱中孵育。2小时后，用酶标仪检测450nm波长下的吸光度。用graph pad 7.00软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。
95.6.2结果
96.如图6所示，经3小时氧糖剥夺损伤后，模型组的细胞存活率降至46.2％，200μg/ml水莴苣提取物处理后，同样的损伤条件下，细胞存活率升高至77.6％，表现出显著的原代心肌细胞保护。lcz696是美国诺华制药研发的一种治疗心衰药物,是双效血管紧张素受体/脑啡肽酶抑制剂，作为阳性对照化合物。误差棒标识的是平均数标准误差(sem)。*：显著性差异相对于模型组。
97.实施例7：水莴苣提取物herg心脏毒性评估
98.检测化合物对herg钾通道的作用是临床前评价化合物心脏安全性的关键步骤，通过对herg抑制作用的检测，评估了水莴苣提取物的心脏毒性。
99.7.1方法
100.cho-herg细胞培养于175cm2培养瓶中，待细胞密度生长到60～80％，加入detachin消化，待消化完全后加入培养液中和，然后离心，吸走上清液，培养液重悬，以确保细胞密度为2～5
×
106/ml。配制细胞外液用于化合物稀释，最高浓度设置为1.6mg/ml，半数稀释至0.05mg/ml。实验由qpatch仪器自动完成，在获得全细胞记录模式后，细胞钳制在-80毫伏，在给予一个5秒的 40毫伏去极化刺激前，先给予一个50毫秒的-50毫伏前置电压，然后复极化到-50毫伏维持5秒，再回到-80毫伏。每15秒施加此电压刺激，记录2分钟后给予细胞外液记录5分钟，然后开始给药过程，化合物浓度从最低测试浓度开始，每个测试浓度给予2.5分钟，连续给完所有浓度后，给予阳性对照化合物3μm西沙必利。用graph pad 7.00软件进行数据处理。
101.7.2结果
102.如表1所示，水莴苣提取物在最高测试浓度下对herg的抑制率为39.8％，ic
50
》1.6mg/ml，表明其在高浓度下herg抑制活性弱，心脏毒性小，具有较好的心脏安全性。
103.表1 herg毒性检测结果
104.化合物最高浓度抑制率最高测试浓度ic
50
水莴苣提取物39.8％1.6mg/ml》1.6mg/ml西沙必利cisapride97.2％3μm0.036μm
105.注：西沙必利为herg测试的阳性对照化合物
106.实施例8：水莴苣提取物体内抗心衰作用
107.体内动物实验采用的是盐酸异丙肾上腺素诱导模型，给小鼠注射盐酸异丙肾上腺素会使小鼠心率加快、心肌持续强烈收缩，使心肌耗氧量增大，加重心脏负荷，最终引起心力衰竭。
108.8.1方法
109.7周龄的c57雄鼠分为4组(对照组、模型组、水莴苣提取物0.6/kg组和水莴苣提取物1.2/kg组)，每组8只老鼠。每天上午灌胃给药，对照组和模型组给等量饮用水，下午皮下注射给盐酸异丙肾上腺素，第1天剂量为20mg/kg，第2天剂量为10mg/kg，第3-14天剂量为5mg/kg，对照组注射等量生理盐水。第15天采用visual-sonics vevo 3100小动物高分辨率显微超声成像系统评价各组实验小鼠的心脏结构及功能,取3个心动周期，测量收缩期室间隔厚度(ivss)、舒张期室间隔厚度(ivsd)、左心室收缩期内径(lvids)、左心室舒张期内径(lvidd)、左心室收缩期后壁厚度(lvpws)、左心室舒张期后壁厚度(lvpwd)，计算射血分数
(ef)、短轴缩短率(fs)、左心室收缩末容量(lvesv)和左心室舒张末容量(lvedv)，用graph pad软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。第16天解剖小鼠取心脏制心脏切片，切片进行he染色和masson染色，并用image j软件对染色部分进行定量，用graph pad 7.00软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。
110.8.2结果
111.8.2.1心功能评价
112.如图7和表2结果所示，模型组的小鼠心功能显著减退，收缩/舒张期左心室室间隔厚度和后壁厚度明显变薄，内径变大，射血分数和短轴缩短率降至正常范围以下(射血分数正常小鼠参考值为55-85％，短轴缩短率正常小鼠参考值为30-50％)。水莴苣提取物高低剂量给药组均能有效的改善盐酸异丙肾上腺素造成的心功能减退，使射血分数恢复到正常范围内，并且呈现出剂量依赖性，1.2g/kg高剂量组表现出更优的药效。
113.表2心功能指标
[0114][0115]
注：数值为平均值
±
标准误差，样本量为8，
#
：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
[0116]
8.2.2心脏切片染色
[0117]
图8a为心脏切片he染色的典型性图片，用来评估组织或细胞的形态和可以看出模型组心肌细胞明显损伤，并伴有部分炎性细胞浸润，而水莴苣提取物给药组未见或少见心肌细胞损伤，细胞排列规则且致密。水莴苣提取物减少了心肌细胞的损伤，对心脏组织起到了保护作用。
[0118]
图8b为心脏切片masson染色的典型性图片，用来表征心肌纤维化的程度，黑色箭头指示的蓝色区域即为纤维化区域。对照组仅见局部纤维化区域，模型组切片多见大面积的纤维化区域，水莴苣提取物0.6g/kg低剂量给药组可见部分较大面积的纤维化区域，而1.2g/kg高剂量给药组可见局部纤维化区域。对上述各组纤维化面积进行定量，结果如图8c所示，模型组较对照组，心肌细胞纤维化程度显著加重，水莴苣提取物给药可减轻心肌细胞纤维化，尤其是水莴苣提取物1.2g/kg高剂量给药组可显著减轻纤维化。误差棒标识的是平均数标准误差(sem)。
#
：显著性差异相对于对照组，*：显著性差异相对于模型组。
[0119]
实施例9水莴苣提取物活性分段在体外氧糖剥夺模型下对大鼠心肌细胞的保护作用
[0120]
9.1方法
[0121]
将培养好的大鼠心肌细胞h9c2(2-1)消化计数后按以7000/孔的数量转接至96孔板中，12小时后，用培养基将水莴苣提取物母液稀释成所需浓度加入到孔板中进行预处理，
12小时后，将造模组的培养基替换成含对应浓度水莴苣提取物的pbs，并将孔板置于缺氧小室中，n2置换空气后将缺氧小室放回细胞培养箱继续培养6小时。对照组细胞继续放在细胞培养箱中正常培养。结束缺氧培养后，将孔板从缺氧小室中取出，所有孔板吸除培养液，每孔加入100μl含10％cck检测试剂的培养基，放回培养箱中孵育。2小时后，用酶标仪检测450nm波长下的吸光度。用graph pad 7.00软件进行数据处理，计算显著性差异(unpaired t-test)。
[0122]
9.2结果
[0123]
如表3所示，馏分e0-e7在一定浓度下均能提高氧糖剥夺模型下细胞的存活率，即每个馏分均为具有细胞保护作用的活性分段。各分段中最低起效浓度为10μg/ml，最高有效浓度可达800μg/ml，具有可观的安全窗口。其中馏分e3和e7在10μg/ml-800μg/ml之间均能显著提高细胞存活率，显示了稳定有效的体外细胞保护作用。由图1色谱图可以看出e7非量峰组分，成分组成较为复杂，因此我们将e3定义为8个活性分段中的最优活性分段。
[0124]
表3 ogd模型下馏分e0-e7的细胞存活率
[0125][0126][0127]
注：数值为平均值
±
标准误差，复孔数量为8，*：显著性差异相对于模型组，nt：not tested。
[0128]
本发明的水莴苣提取物及其活性分段，制备工艺简洁，在体外心肌细胞氧糖剥夺模型中均具有显著的细胞保护作用，且心脏毒性弱，并且其提取物在体内实验中也表现出良好的抗心衰药效。因此，该中药提取物及其活性分段有望开发成新型抗心衰药物，而且还可以开发成与现有抗心衰药物进行组合给药的抗心衰药物。
[0129]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。