一种脂联素荧光定量免疫层析试剂条的制作方法

1.本实用新型涉及医学检测领域，尤其涉及一种脂联素荧光定量免疫层析试剂条。


背景技术：

2.脂肪组织adipose tissue主要由大量聚集成团的脂肪细胞构成，脂联素(adiponectin，adp)是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽或蛋白质，在人体内的以3-30ug/ml的浓度出现在循环血浆中。脂联素是一种胰岛素敏感性激素，是脂类和糖类代谢重要的调控因子具有抗糖尿病、抗脂炎症和抗动脉粥样硬化等特性。现有研究显示，血液中一定量的脂联素可以降低二型糖尿病、冠状动脉疾病和胰岛素抵抗的发病风险，因此，测定血液中脂联素的水平，对这些疾病的诊断和预后有重要的临床意义。
3.传统的检测方法主要是胶乳增强免疫比浊法和化学发光法来检测脂联素浓度，其中，胶乳增强免疫比浊法的灵敏度不高，并且操作复杂，耗时较长，不适于临床推广；而化学发光的方法通常需要使用大型仪器，而且检测所需的试剂通常需要冷藏保存，运输成本高。
4.荧光免疫分析技术的基本原理是待测抗体或抗原的特异性反应过程由荧光物质标记，在特定波段的激发光照射下，荧光物质会辐射出一定波长的反射荧光通过光电模块检测该荧光的强度信息，就可以反馈出待测物质的浓度信息。荧光免疫分析技术具有特异性强、灵敏度高、检测速度快等优点，因此被广泛应用于微生物检测、病毒抗原或抗体检测、激素检测、肿瘤标记物检测等领域。
5.公开号为207992242u的专利申请公开了一种检测脂联素的荧光免疫层析试剂条，所述检测脂联素的荧光免疫层析试剂条包括pvc衬板、硝酸纤维素膜、耦合物结合垫、样品垫及吸水垫5个附件单元，该试剂条中，荧光标记脂联素抗体在稀释10倍后，以25ul/cm均匀的喷洒在结合垫上，该标记物的用量比较大，成本较高。


技术实现要素：

6.为了解决上述的技术问题，本实用新型的目的是提供一种结构简单、操作快捷、灵敏度高、制造成本较低的脂联素荧光定量免疫层析试剂条。
7.为了达到上述的目的，本实用新型采用了以下的技术方案：
8.一种脂联素荧光定量免疫层析试剂条，包括基底以及依次设置在基底上的样品垫、包被膜和吸水垫，所述包被膜的一端与样品垫连接，包被膜的另一端与吸水垫连接；所述包被膜上设有标记区、检测区和质控区，所述标记区设置在包被膜上靠近样品垫的一侧，质控区设置在包被膜上靠近吸水垫的一侧，检测区设置在标记区和质控区之间，所述标记区包被有与脂联素特异性结合的第一adp单抗、dnp-bsa与荧光胶乳微粒耦合而成的耦合物，所述检测区包被有与第一adp单抗配对的第二adp单抗，所述第二adp单抗与脂联素特异性结合；所述质控区包被有与耦合物中dnp-bsa特异性结合的兔抗dnp抗体。在本技术中，所述标记区耦合物中的第一adp单抗能够与样本中的adp特异性结合形成adp-耦合物，然后adp-耦合物层析到达检测区并在检测区与第二adp单抗结合，形成耦合物-adp-第二adp单
抗这种三明治结构，该耦合物-adp被第二adp单抗捕获，样本中的adp浓度越高，检测区的光密度值越高；所述质控区的兔抗dnp抗体能够与游离的耦合物中的dnp-bsa特异性结合，通过检测仪器读取检测区和质控区的信号即可对样本中adp的含量进行定量分析。
9.作为优选，所述样品垫与所述包被膜部分重叠，所述吸水垫与所述包被膜部分重叠，所述标记区、检测区和质控区设置在所述包被膜未重叠的部分处。
10.作为优选，所述荧光胶乳微粒为胶体金颗粒或磁珠微粒中的一种。
11.作为优选，所述耦合物中第一adp单抗和荧光胶乳微粒时以1:10的质量比共价偶联而成的，这样，能够放大本试剂条中的信号量，提高第一adp单抗与荧光胶乳微粒的结合比例，从而改善试剂条的灵敏度和准确度。
12.作为优选，所述荧光胶乳微粒的直径为0.1μm-1μm，荧光胶乳微粒受激发后的发射波长为180n～800nm。
13.作为优选，所述基底为pvc材质。
14.作为优选，所述样品垫为玻璃纤维材质。
15.作为优选，所述包被膜为硝酸纤维素膜。
16.作为优选，所述吸水垫由吸水滤纸制成。
17.作为优选，还包括壳体，所述壳体上设有加样口和检测口，所述加样口的位置与所述样品垫的位置相对应，所述检测口的位置与所述包被膜的位置相对应。
18.本实用新型由于采用了以上的技术方案，具有以下益处：
19.本脂联素荧光定量免疫层析试剂条没有采用单独设置一个结合垫，而是在包被膜上设置标记区、检测区和质控区，这样，试剂条的结构简单，耦合物的用量大大减少且标记区的荧光胶乳微粒的释放速度较快，仅需5min即可完成检测，检测较快。本技术的试剂条灵敏度高，用于特异性检测样品中adp含量。
附图说明
20.图1是本实用新型的结构示意图；
21.图2是本实用新型的脂联素荧光定量免疫层析试剂条对不同浓度的adp校准品进行检测后得到的拟合曲线；
22.图3是本实用新型的脂联素荧光定量免疫层析试剂条与商业化的adp化学发光检测试剂的临床对比分析结果曲线；
23.附图标记：110、基底；120、样品垫；130、包被膜；131、标记区；132、检测区；133、质控区；140、吸水垫。
具体实施方式
24.下面详细描述本实用新型的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本实用新型，而不能理解为对本实用新型的限制。
25.在本实用新型的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“顺时
针”、“逆时针”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本实用新型和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实用新型的限制。
26.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本实用新型的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确的限定。
27.在本实用新型中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本实用新型中的具体含义。
28.在本实用新型中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征之“上”或之“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
29.如图1所示的一种脂联素荧光定量免疫层析试剂条，包括基底110以及依次设置在基底110上的样品垫120、包被膜130和吸水垫140，所述包被膜130的一端与样品垫120连接，包被膜130的另一端与吸水垫140连接；所述包被膜130上设有标记区131、检测区132和质控区133，所述标记区131设置在包被膜130上靠近样品垫120的一侧，质控区133设置在包被膜130上靠近吸水垫140的一侧，检测区132设置在标记区131和质控区133之间，所述标记区131包被有荧光胶乳微粒标记的耦合物，所述耦合物由第一adp单抗、dnp-bsa与荧光胶乳微粒耦合而成，所述检测区132包被有第二adp单抗；所述质控区133包被有兔抗dnp抗体。
30.在本技术中，所述标记区131耦合物中的第一adp单抗能够与样本中的adp特异性结合形成adp-耦合物，然后adp-耦合物在检测区132与第二adp单抗结合，形成耦合物-adp-第二adp单抗这种三明治结构，该耦合物-adp被第二adp单抗捕获，样本中的adp浓度越高，检测区132的光密度值越高；所述质控区133的兔抗dnp抗体能够与游离的耦合物中的dnp-bsa特异性结合，通过检测仪器读取检测区132和质控区133的信号即可对样本中adp的含量进行定量分析。本脂联素荧光定量免疫层析试剂条没有采用单独设置一个结合垫，而是在包被膜130上设置标记区131、检测区132和质控区133，这样，试剂条的结构简单，且标记区131的荧光胶乳微粒的释放速度较快，仅需5min即可完成检测，检测较快。
31.作为优选，所述样品垫120与所述包被膜130部分重叠，所述吸水垫140与所述包被膜130部分重叠，所述标记区131、检测区132和质控区133设置在所述包被膜130未重叠的部分处。需要说明的是，所述样品垫120、包被膜130、吸水垫140和基底110之间可以采用搭接或者其他粘贴方式实现连接即可。
32.作为优选，所述荧光胶乳微粒为胶体金颗粒或磁珠微粒中的一种。
33.作为优选，所述荧光胶乳微粒的直径为0.1μm-1μm，荧光胶乳微粒受激发后发射的
波长为180nm～800nm。
34.在本实用新型中，所述基底110为pvc材质，所述样品垫120为玻璃纤维材质，所述包被膜130为硝酸纤维素膜，所述吸水垫140由吸水滤纸制成。
35.一般来说，所述脂联素荧光定量免疫层析试剂条还包括壳体，所述壳体上设有加样口和检测口，所述加样口的位置与所述样品垫120的位置相对应，所述检测口的位置与所述包被膜130的位置相对应。
36.上述脂联素荧光定量免疫层析试剂条的储存温度在4℃～30℃，无需冷藏，运输方便，使用者操作快捷。
37.一般来说，本实用新型的脂联素荧光定量免疫层析试剂条的制备方法，包括如下步骤：
38.s1、将样品垫处理液加到样品垫，干燥。
39.具体步骤为：将样品垫处理液，以2-8μl/cm的速度喷在样品垫120上，过夜烘干。
40.在上述步骤中，所述样品垫120处理液为含0.5-2mg/ml鼠igg、0.5％-1％伊文斯兰和0.1-2mg/ml rbc的样品垫稀释液，所述样品垫稀释液为含有0.5％-3％吐温-20和2％-5％bsa(牛血清白蛋白)的0.02m pb缓冲液(磷酸缓冲液)。
41.s2、使用荧光胶乳微粒标记第一adp单抗与dnp-bsa，制备第一adp单抗、dnp-bsa与荧光胶乳微粒的耦合物标记溶液，将耦合物标记溶液、第二adp单抗溶液和兔抗dnp溶液分别加到包被膜130的标记区131、检测区132和质控区133，干燥。
42.在上述步骤中，所述荧光胶乳微粒溶液中活化荧光胶乳微粒的浓度为800μg/100μl～1200μg/100μl。所述耦合物中第一adp单抗和荧光胶乳微粒时以1:10的质量比共价偶联而成的，这样，能够放大本试剂条中的信号量，提高第一adp单抗与荧光胶乳微粒的结合比例，从而改善试剂条的灵敏度和准确度。
43.在上述步骤中，标记区131上标记溶液的加入量为0.012μl/cm2～0.024μl/cm2，第二adp单抗的浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml，在检测区132的加入量为20μl/(27～35)cm2。
44.所述第二adp单抗的配制步骤：用含2-5％蔗糖的0.01m pb(ph＝7.4)缓冲液将第二adp单抗稀释至浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml。
45.在上述步骤中，兔抗dnp溶液的浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml，在质控区133的加入量为20μl/(27～35)cm2。兔抗dnp溶液的配置步骤：用含2-5％蔗糖的0.01m pb(ph＝7.4)缓冲液将兔抗dnp溶液稀释至浓度为0.5mg/ml～1.0mg/ml。
46.在上述步骤中，所述耦合物标记溶液的制备步骤如下：
47.1、制备第一adp单抗与dnp-bsa的偶联复合物；
48.2、活化荧光胶乳微粒，制备活化荧光胶乳微粒溶液，然后将偶联复合物与活化荧光胶乳微粒溶液在旋转混匀仪上混匀60-120min，然后加入封闭液，超声混匀，然后在旋转混匀仪上混匀60min；向活化荧光微球溶液中加入偶联复合物，然后在12000-15000rpm离心10-15min，弃上清液，保留沉淀；
49.3、向沉淀中加入微球稀释液复溶，超声混匀，得到耦合物标记溶液。
50.所述封闭液是含0.5-2％bsa的0.01m tris缓冲液，微球稀释液是含有0.5％-3％吐温-20、2％-5％bsa和3-10％蔗糖的0.02m pb缓冲液。
51.耦合物标记溶液可以使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没等方式加到标记区131。同
样的，第二adp单抗溶液和兔抗dnp溶液也是使用喷涂、点涂、均匀涂布或浸没等方式加到相应的区。
52.在上述步骤中，制备活化荧光胶乳微粒溶液的具体步骤为：将荧光胶乳微粒清洗、活化、活化终止；
53.1、清洗：用移液枪吸取荧光胶乳微粒于离心管中，在12000-15000rpm离心10-15min，弃上清液，加入1ml清洗缓冲液，超声混匀。进一步地，上述清洗缓冲液为0.01m tris缓冲液。
54.2、活化：向上述清洗后的荧光胶乳微粒中加入活化缓冲液，在旋转混匀仪上混匀20min。进一步地，活化缓冲液是含5-10mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺和5-10mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.01m tris缓冲液。
55.3、活化终止：将上述活化后的荧光胶乳微粒在12000-15000rpm离心10-15min，弃上清液，加入1ml终止液，超声混匀。进一步地，终止液是含0.1-0.5％甲醇的0.1m mes缓冲液。
56.s3、将干燥后的样品垫120、干燥后的包被膜130及吸水垫140依次设置在基底上，使所述包被膜130的一端与样品垫120连接，包被膜130的另一端与吸水垫140连接，得到脂联素荧光定量免疫层析检测试剂条。
57.上述脂联素荧光定量免疫层析试剂条的制备方法简单、制作流程简便，便于推广使用。
58.具体的，在本实用新型中，脂联素荧光定量免疫层析试剂条的制备方法如下步骤所示：
59.1、标记溶液的制备
60.1)、制备活化荧光微球溶液：
61.清洗：用移液枪吸取1ml浓度为10mg/1ml荧光微球液于离心管中，在14000rpm离心15min，弃上清液，加入1ml 0.01m tris缓冲液，超声混匀，得到清洗后的荧光微球溶液。
62.活化：向上述清洗后的荧光微球溶液中加入1ml含5mg/ml的n-羟基琥珀酰亚胺和5mg/ml 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的0.01m tris缓冲液，在旋转混匀仪上混匀20min，得到活化的荧光微球溶液。
63.活化终止：将上述活化的荧光微球在14000rpm离心15min，弃上清液，加入1ml含0.1％甲醇的0.1m mes缓冲液，超声混匀，得到活化后的荧光微球溶液。
64.2)、制备标记溶液
65.向上述活化后的荧光微球溶液中分别加入1mg第一adp单抗与dnp-bsa，以1:10的质量比共价偶联形成耦合物，在旋转混匀仪上混匀120min，然后加入1ml含0.5％bsa的0.01m tris缓冲液，超声混匀，然后在旋转混匀仪上混匀60min。
66.然后在14000rpm离心15min，弃上清液，保留沉淀；
67.向上述沉淀中加入1ml含有0.5％吐温-20、2％bsa和3％蔗糖的0.02m pb缓冲液，复溶，超声混匀，得到耦合物标记溶液。
68.2、包被膜的制备
69.用含3％蔗糖的0.01m pb(ph＝7.4)缓冲液将第二adp单抗稀释到1mg/ml，为检测区的工作液。
70.用含3％蔗糖的0.01m pb(ph＝7.4)将兔抗dnp溶液稀释到1mg/ml，为质控区的工作液。
71.将硝酸纤维膜贴在pvc板上，在膜上划标记区、检测区和质控区，划膜的速度为1.0μl/cm，放置50℃，烘干72h。
72.3、样品垫的制备
73.将样品垫处理液以2μl/cm的速度喷在玻璃纤维上，过夜烘干；样品垫处理液为含0.5mg/ml鼠igg、0.5％伊文斯兰和0.1mg/ml rbc的样品垫稀释液，样品垫稀释液为含有0.5％吐温-20和2％bsa的0.02m pb缓冲液。
74.4、在pvc板依次相互搭接地粘贴样品垫和吸水纸，并使样品垫、硝酸纤维素膜及吸水纸从pvc板的一端至另一端依次连接，然后切割成适当宽度，获得脂联素荧光定量免疫层析试剂条。
75.将上述脂联素荧光定量荧光免疫层析试剂条进行性能评估。
76.仪器：因特维斯(杭州)生物技术有限公司生产的电化学免疫分析仪，型号：flash-200；
77.1、线性研究
78.试验方法：采用实用新型的脂联素荧光定量荧光免疫层析试剂条对浓度为0μg/ml、3.75μg/ml、7.5μg/ml、15μg/ml、30μg/ml、60μg/ml的adp校准品进行检测，每份校准品重复检测3次，并计算每份每个浓度的平均值，采用rodbard拟合曲线建立adp标准反应的四参量曲线拟合：y＝d (a-d)/(1 (x/c)^b)，其中，x为adp校准品浓度。
79.实验结果：如图2所示，该rodbard拟合曲线的相关系数r2＝0.9984，符合rodbard拟合曲线，说明本脂联素荧光定量荧光免疫层析试剂条性能好，准确度高，能够用于adp的特异性定量检测。
80.2、临床对比研究
81.以本实用新型adp定量检测试剂条为实验组，以某商业化的adp化学发光检测试剂作为对照组，将试验组通过flash-200进行检测得到相应的浓度，对照组通过化学发光分析仪进行检测得到相应的adp浓度，采集26份新鲜的病人血清，将26份新鲜的病人血清分别通过实验组和对照组检测病人血清中adp含量，并以对照组检测出的病人血清中adp浓度为x轴，以实验组检测出的病人血清中adp浓度为y轴，获得实验组与对照组的相关性，结果如图3所示，y＝1.0498x 0.0513，一致性系数r2＝0.9523，本发明的脂联素荧光定量免疫层析试剂条跟化学发光试剂有很好的临床相关一致性，可以用于替代商业化学发光试剂进行adp的特异性定量检测。
82.说明书、所附权利要求和附图中所描述的所有特征，无论单独还是它们的任意组合，都是本实用新型的重要特征。
83.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“一种实施方式”、“具体实施方式”、“其他实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本实用新型的至少一个实施例、实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，上述描述的具体特征、结构、材料或者特点也可以在任何的一个或多个实施例、实施方式或示例中以合适的方式结合。本实用新型记载的技术方案也包括上述描述
的任意一个或多个具体特征、结构、材料或者特点以单独或者组合的方式形成的技术方案。
84.尽管上面已经示出和描述了本实用新型的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本实用新型的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本实用新型的原理和宗旨的情况下在本实用新型的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换、变型、删除部分特征、增加特征或重新进行特征组合形成的技术方案，凡是依据本实用新型的创新原理对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本实用新型技术方案的范围内。