一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法。


背景技术：

2.透明质酸又名玻璃酸，是由d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺组成的高级多糖。d-葡萄糖醛酸及n-乙酰葡糖胺之间通过β-1,4配糖键和β-1,3配糖键相连。透明质酸的相对分子质量(mr)一般为1
×
105～1
×
107d，分子中两种单糖的摩尔比为1:1。透明质酸广泛存在于动物组织的细胞间质和某些细菌的夹膜中。在人和脊椎动物的组织中，透明质酸广泛存在，是组成细胞外基质的几种粘多糖之一。透明质酸在人体皮肤的真皮层和关节的滑液中含量比较多，具有保湿、润滑等非常重要的生理功能。由于具有独特的流变学特性、保湿性、润滑性、天然性、良好的生物相容性和无过敏性，透明质酸在化妆品领域、保健食品领域、美容手术及医药领域均得到广泛地发展与应用。
3.透明质酸的商品形式一般为其钠盐，即透明质酸钠。现有透明质酸钠含量的测定方法主要是首先测定葡萄糖醛酸的含量，进而计算得出透明质酸钠的含量。但是该方法不能直接测定透明质酸钠的含量，过程复杂，准确性较低。目前，有些研究人员采用核磁共振氢谱对透明质酸钠的含量进行测定，但由于透明质酸钠是大分子化合物，溶解性较差，样品比较粘稠，使得氢谱谱线宽度增加，分辨率下降，而且透明质酸钠的结构式为糖链，在氢谱中氢的化学位移值主要集中在3～6ppm之间，不易区分定量特征峰，使其定量过程的难度增加。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，该方法可以优化定量特征峰的峰形，提高氢谱图的分辨率，对透明质酸钠的含量进行准确的定量分析。
5.为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
6.本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
7.将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；
8.所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；
9.所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；
10.所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；
11.根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
12.所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；
13.所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；
14.所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
15.透明质酸钠含量＝a
×mmal
×
m1×
p/(m
样
×
m2)，％；
16.a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
17.p：内标物的含量，％；
18.m
mal
：内标物的质量，mg；
19.m
样
：待测样品的质量，mg；
20.m1：透明质酸钠的分子质量；
21.m2：内标物的分子质量。
22.优选的，所述重水和氘代氢氧化钠的体积比为100∶(1～3)。
23.优选的，将所述待测样品和内标物的质量比为1:1替换为所述待测样品和内标物的摩尔比为1:1；且所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
24.透明质酸钠含量＝a
×m×
m1×
p/m
样
，％；
25.a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
26.p：内标物的含量，％；
27.m：内标物的摩尔质量，mol；
28.m
样
：待测样品的质量，mg；
29.m1：透明质酸钠的分子质量。
30.优选的，所述核磁共振氢谱测试的采样温度≥295k。
31.优选的，所述核磁共振氢谱测试的检测谱宽范围为18～22ppm。
32.优选的，所述核磁共振氢谱测试的谱宽中心值为5～7ppm。
33.优选的，所述核磁共振氢谱测试的扫描次数≥12次。
34.优选的，所述核磁共振氢谱测试的采样时间≥2min。
35.优选的，所述核磁共振氢谱测试的线宽因子为0.2～0.4hz。
36.本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述透明质酸钠样品和内标物的质量比为1∶1；所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；所述透明质酸钠的含量的计算公式为：透明质酸钠含量＝a
×mmal
×
m1×
p/(m
样
×
m2)，％；a：透明质
酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；p：内标物的含量，％；m
mal
：内标物的质量，mg；m
样
：透明质酸钠样品的质量，mg；m1：透明质酸钠的分子质量；m2：内标物的分子质量。
37.本发明采用马来酸作为内标物，马来酸与透明质酸钠可以在相同的溶剂中溶解，出峰互不干扰，两者不会发生化学反应，且马来酸出峰少，干扰小；马来酸中只有氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰，而透明质酸钠为糖单元，端基氢质子出峰具有规律；采用含有重水和氘代氢氧化钠的氘代溶剂对待测样品进行溶解，可以降低透明质酸钠溶液的粘度，增加透明质酸钠的溶解性，提高氢谱图的分辨率，再通过调整核磁共振氢谱的检测参数，延长驰豫延迟时间可以增强信号响应，减少基线的干扰，优化定量特征峰峰形，实现对待测样品中透明质酸钠的定量检测。该方法不会破坏对待测样品中的透明质酸钠，可直接准确地测定透明质酸钠的含量，与高效液相法、气质及液质联用等定量技术相比，无需使用高纯度的透明质酸钠标准品作为内标或外标，不需要建立标准曲线，具有不受杂质响应值影响，能同时给出定性的结构信息和定量分析结果的特点，而且本方法高效、简便、采样量少、重复性好，可降低定量成本。
附图说明
38.图1为空白溶液测定图；
39.图2为空白溶液加内标测定图；
40.图3为空白溶液加内标加样品测定图；
41.图4为重复性测定图；
42.图5为中间精密度测定图；
43.图6为实施例1中样品测定图；
44.图7为实施例1中样品测定图。
具体实施方式
45.本发明提供了一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
46.一种核磁共振氢谱定量测定透明质酸钠含量的方法，包括以下步骤：
47.将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；
48.所述内标物为马来酸；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；
49.所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；
50.所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s；
51.根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
52.所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键上的2个氢特征峰；
53.所述透明质酸钠的积分面积测定值为所述透明质酸钠的定量目标峰的积分面积
与所述内标物的定量目标峰的积分面积的比值；
54.所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
55.透明质酸钠含量＝a
×mmal
×
m1×
p/(m
样
×
m2)，％；
56.a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
57.p：内标物的含量，％；
58.m
mal
：内标物的质量，mg；
59.m
样
：待测样品的质量，mg；
60.m1：透明质酸钠的分子质量；
61.m2：内标物的分子质量。
62.如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
63.本发明将待测样品、内标物和氘代溶剂混合后，进行核磁共振氢谱测试，得到核磁共振氢谱图。
64.在本发明中，将所述待测样品、内标物和氘代溶剂混合前，优选将所述透明质酸钠样品进行干燥；所述干燥的方式优选为减压干燥；所述干燥的温度优选为60℃，所述干燥的时间优选为5h，本发明对所述减压干燥的压强没有特殊限定，采用本领域熟知的减压干燥压强即可。在本发明中，所述待测样品优选为市售的透明质酸钠产品。
65.在本发明中，所述内标物为马来酸；所述马来酸的质量为8～30mg；所述待测样品和内标物的质量比为1∶1；或者，所述待测样品和内标物的摩尔比为1∶1；所述氘代溶剂包括重水和氘代氢氧化钠；所述重水和氘代氢氧化钠的体积比优选为100∶(1～3)；为了达到核磁共振氢谱测试中检测样品溶液的高度，所述氘代溶剂的用量优选≥500μl，更优选为500～1000μl。本发明对所述待测样品、内标物和氘代溶剂的混合过程没有特殊限定，采用本领域熟知的混合过程使物料混合均匀即可。本发明对所述核磁共振氢谱测试所用的仪器没有特殊限定，采用本领域熟知的核磁共振波谱仪即可。在本发明实施例中，所述核磁共振氢谱测试所用的仪器具体为1h核磁共振波谱仪。
66.在本发明中，所述核磁共振氢谱测试的脉冲序列为zg；所述核磁共振氢谱测试的驰豫延迟时间≥8s，优选为8～12s；所述核磁共振氢谱测试的采样温度优选≥295k，更优选为295～313k；所述核磁共振氢谱测试的检测谱宽范围优选为18～22ppm；所述核磁共振氢谱测试的谱宽中心值优选为5～7ppm；所述核磁共振氢谱测试的扫描次数优选≥12次，更优选为12～20次；所述核磁共振氢谱测试的采样时间优选≥2min，更优选为2～8min；所述核磁共振氢谱测试的线宽因子优选为0.2～0.4hz。
67.得到核磁共振氢谱图后，本发明优选对所述核磁共振氢谱图进行相位调整和基线调整；本发明对所述相位调整和基线调整的过程没有特殊限定，采用本领域熟知的相位调整和基线调整的过程即可。
68.调整所述核磁共振氢谱图的相位和基线后，本发明根据所述核磁共振氢谱图，对透明质酸钠的定量目标峰和内标物的定量目标峰分别进行积分，得到透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，通过透明质酸钠的含量的计算公式，计算得到透明质酸钠的含量。
69.在本发明中，所述透明质酸钠的定量目标峰为氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰；所述内标物的定量目标峰为氢谱化学位移δ5.80～6.20ppm处烯键
上的2个氢特征峰。
70.当所述待测样品和内标物的质量比为1∶1时，所述透明质酸钠的含量的计算公式为：
71.透明质酸钠含量＝a
×mmal
×
m1×
p/(m
样
×
m2)，％；
72.a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
73.p：内标物的含量，％；
74.m
mal
：内标物的质量，mg；
75.m
样
：待测样品的质量，mg；
76.m1：透明质酸钠的分子质量；
77.m2：内标物的分子质量；
78.当所述待测样品和内标物的摩尔比优选为1∶1时，所述透明质酸钠的含量的计算公式优选为：
79.透明质酸钠含量＝a
×m×
m1×
p/m
样
，％；
80.a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
81.p：内标物的含量，％；
82.m：内标物的摩尔质量，mol；
83.m
样
：待测样品的质量，mg；
84.m1：透明质酸钠的分子质量。
85.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
86.实施例1
87.(1)仪器方法
[0088]1h核磁共振波谱仪的参数设置如表1所示。
[0089]
表11h核磁共振波谱仪的参数
[0090][0091]
(2)分析方法
[0092]
样品配制：分别称取透明质酸钠10mg和马来酸10mg，置同一离心管中再加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠的混合溶剂进行溶解，涡旋，转移至核磁管中，按上述表1的参数进行检测。
[0093]
定量方法：内标法(峰面积)，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰，对其进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过如下计算公式，计算得到透明质酸钠的含量；
[0094]
1)透明质酸钠的含量的计算公式为：
[0095]
透明质酸钠含量＝a
×mmal
×
m1×
p/(m
样
×
m2)，％；
[0096]
a：透明质酸钠定量目标峰的积分面积测定值，％；
[0097]
p：内标物的含量，％；
[0098]mmal
：内标物的质量，mg；
[0099]m样
：待测样品的质量，mg；
[0100]
m1：透明质酸钠的分子质量；
[0101]
m2：内标物的分子质量。
[0102]
实施例2
[0103]
分别称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和10μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，得到待测溶液；采用1h核磁共振波谱仪对待测溶液进行核磁共振氢谱测试，设定参数为脉冲序列zg，检测谱宽18ppm，谱宽中心值5ppm，采样时间2min34s，驰豫延迟时间8s，线宽因子0.2hz，采样温度295k，采样次数12次，得到核磁共振氢谱图；根据所述核磁共振氢谱图，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过上述透明质酸钠积分面积测定值带入计算公式，计算得到透明质酸钠的含量为95.69％。
[0104]
实施例3
[0105]
分别称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和30μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，转移至核磁管中，得到待测溶液；采用1h核磁共振波谱仪对待测溶液进行核磁共振氢谱测试，设定参数为脉冲序列zg，检测谱宽22ppm，谱宽中心值7ppm，采样时间5min19s，驰豫延迟时间12s，线宽因子0.4hz，采样温度313k，采样次数20次，得到核磁共振氢谱图；根据所述核磁共振氢谱图，选择氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为透明质酸钠的定量目标峰，氢谱化学位移δ4.36～4.63ppm处糖端基上的2个氢特征峰作为内标物的定量目标峰进行积分，得到透明质酸钠定量特征峰的积分面积测定值(透明质酸钠的定量目标峰的积分面积与内标物的定量目标峰的积分面积的比值)，通过上述透明质酸钠积分面积测定值带入计算公式，计算得到透明质酸钠的含量为95.73％。
[0106]
方法验证：
[0107]
方法验证过程中1h核磁共振波谱仪的参数与实施例1一致。
[0108]
(1)专属性测试
[0109]
1)溶液配制
[0110]
空白溶液：1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合均匀，即得。
[0111]
样品空白溶液：称取透明质酸钠10mg置离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得10mg/ml的样品空白溶液。
[0112]
内标溶液：称取马来酸10mg，置离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，即得10mg/ml的对照品溶液前边写的是内标，名称尽量保持一致。
[0113]
样品加标溶液(内标浓度10mg/ml)：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离
心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得样品加标溶液。
[0114]
2)试验过程
[0115]
取上述溶液，分别置于核磁共振波谱仪中进行测试，参数如表1所示，采集数据，记录各样品中峰的化学位移值。
[0116]
3)接受标准
[0117]
空白溶液、对照品溶液与样品空白溶液峰无干扰。
[0118]
3)结果及结论
[0119]
测试结果如表2所示，测试谱图如图1～3所示，图1为空白溶液测定图，图2为空白溶液加内标测定图，图3为空白溶液加内标加样品测定图。
[0120]
表2专属性试验结果
[0121][0122]
由表2可知，空白溶液、内标溶液与样品空白溶液峰无干扰，专属性良好。
[0123]
(2)精密度测试
[0124]
1)重复性
[0125]
1、溶液配制
[0126]
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制共6份。
[0127]
2、试验过程
[0128]
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算浓度，并计算透明质酸钠含量的rsd。
[0129]
3、接受标准
[0130]
6份样品中透明质酸钠含量rsd≤2％。
[0131]
4、结果及结论
[0132]
重复性试验结果如表3所示。
[0133]
表3重复性试验结果
[0134][0135]
由表3可知，6份样品中透明质酸钠含量的rsd为0.11％，重复性良好。
[0136]
2)中间精密度
[0137]
1、溶液配制
[0138]
在不同日期按上述重复性溶液配制要求重新配制6份100％样品加标溶液。
[0139]
2、试验过程
[0140]
取上述溶液依次进样分析，以内标法计算透明质酸钠含量，并计算透明质酸钠含量的rsd。
[0141]
3、接受标准
[0142]
12份加标溶液透明质酸钠含量的rsd≤2％。
[0143]
4、结果及结论
[0144][0145][0146][0147]
中间精密度试验结果如表4所示。相关试验部分图谱见图4和图5，图4为重复性测定图，图5位中间精密度测定图。
[0148]
表4中间精密度试验结果
[0149][0150][0151]
由表4可知，12针透明质酸钠样品加标含量的rsd为0.15％，中间精密度良好。
[0152]
3)准确度
[0153]
1、溶液配制
[0154]
80％样品加标溶液：称取透明质酸钠8mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
[0155]
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
[0156]
120％样品加标溶液：称取透明质酸钠12mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得；同法配制3份。
[0157]
2、试验过程
[0158]
每份溶液测定1次，以内标法计算透明质酸钠含量，并计算透明质酸钠含量的rsd。
[0159]
3、接受标准
[0160]
各浓度下样品中透明质酸钠含量的rsd≤2％。
[0161]
4、结果及结论
[0162]
准确度试验结果如表5所示。
[0163]
表5准确度试验结果
[0164][0165]
由表5可知，80％加标下样品中透明质酸钠含量的rsd为0.09％，100％加标下样品中透明质酸钠含量的rsd为0.16％，120％加标下样品中透明质酸钠含量的rsd为0.16％，准确度良好。
[0166]
4)溶液稳定性
[0167]
1、溶液配制
[0168]
100％样品加标溶液：称取透明质酸钠10mg，马来酸10mg，置同一离心管中，加入1ml重水和20μl氘代氢氧化钠混合溶剂溶解，涡旋，摇匀即得。
[0169]
2、试验过程
[0170]
上述溶液于室温放置，分别于0h、2h、13h，每份溶液测定1次，记录峰面积，具体时间可根据实际情况进行调整。
[0171]
3、接受标准
[0172]
各放置时间点溶液测得含量与0h的比值在98～102％之间。
[0173]
4、溶液稳定性结果及结论
[0174]
样品加标溶液稳定性结果如表6所示。
[0175]
表6样品加标溶液稳定性结果
[0176][0177]
由表6可知，2h、13h时间点溶液测得含量与0h的比值在98～102％之间，即样品加标溶液室温放置13h内稳定性良好。
[0178]
实施例1的样品检测结果
[0179]
对实施例1的样品测定两针平行样，检测结果如表7所示。相关图谱如图6和图7所示。
[0180]
表7样品检测结果
[0181][0182]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。