一种血平片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱与流程

1.本发明涉及中药制剂的质量控制方法，特别是涉及一种用高效液相色谱法对血平片制剂指纹图谱的构建方法及其所获取的指纹图谱。


背景技术：

2.中药质量控制是中药现代化的重要内容，指纹图谱技术被认为是中药质量控制的有效手段。中药指纹图谱能科学地反映中药制剂中相关处方药的化学物质的种类，是实现中药真实性、质量可控性和产品稳定性的可行模式，能更好地反映中药的内在品质。建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。
3.血平片由地黄、熟大黄、地榆、三七、海螵蛸、茜草、蒲黄(炒)七味药制成的中药复方制剂。具有清热化瘀，止血调经的作用。用于血热挟淤所致的崩漏。现行的血平片的质量标准以hplc测定大黄酸和大黄酚的含量，再进一步有研究人员通过hplc法同时测定血平片中大黄和三七含量，实现一次性测定大黄中大黄素、大黄酚及三七中三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1含量的方法。但这些方法都是仅选取其中几种成分状况来说明产品的内在质量，这些控制方法不足以代表其质量整体，具有一定的局限性。不能真实反映其内在品质及批次之间产品质的一致性。直至目前未见有血平片的宏观指纹图谱研究的成果报道。
4.血平片成分复杂，含有一些无紫外吸收或只具有紫外末端吸收等不适合采用紫外检测器检测的成分。而蒸发光散射检测器通常被认为是通用型检测器，可用于检测缺少发色体的药物、碳水化合物、多聚糖、脂类、植物油、脂肪酸等。因此采用高效液相色谱法联合紫外检测器与蒸发光散射检测器对血平片进行整体全面的质量控制。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，建立了一种血平片指纹图谱的质量控制方法及其依该方法所得到的具有血平片特征的指纹图谱，该方法以高效液相色谱法联合紫外检测器与蒸发光散射检测器对血平片中的指标成分进行全面检测，获得指纹图谱，用于评价和控制血平片的质量，以确保证血平片的质量稳定性、一致性和可控性，从而提高血平片的安全性和有效性。
6.本发明提供一种血平片指纹图谱的建立方法，具体步骤包括：
7.(a)供试品的制备：不同批次的血平片，除去包衣研细后，取一定量的血平片粉末置于容器中，加入一定浓度的甲醇溶液进行回流提取，放冷，用甲醇溶液补足减失重量，滤过，即得供试品溶液；
8.(b)对照品的制备：精密称取毛蕊花糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、地榆皂苷-ii、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1对照品适量，分别加甲醇制成一定浓度的对照品溶液；
9.(c)测定方法：精密吸取参照物和供试品溶液，注入液相色谱仪联合紫外检测器和
蒸发光散射检测器，测定，记录色谱图，洗脱过程为梯度洗脱；
10.(d)将获得的血平片色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”进行相似度评价。
11.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(a)供试品的制备具体操作过程为：精密称取2.0g的血平片粉末，精密加入50％～90％甲醇溶液25ml，称重，加热回流2小时，放冷，用50％～90％甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液即得供试品溶液。
12.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(b)对照品的制备具体操作过程为：精密称取毛蕊花糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、地榆皂苷-ii、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.04mg/ml的对照品溶液。
13.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(c)测定方法具体操作过程为：分别精密吸取对照品和供试品溶液，注入液相色谱仪联合紫外检测器和蒸发光散射检测器，测定，记录色谱图的时间为90min。
14.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(c)中，血平片指纹图谱测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按下表中规定进行梯度洗脱；柱温30℃；流速为每分钟1ml，检测波长为254nm；理论板数按大黄酚计算应不低于3000；漂移管温度60℃；气流速350kpa；增益值6/32倍。3000；漂移管温度60℃；气流速350kpa；增益值6/32倍。
15.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，色谱柱规格为thermo ods hypersil-c18，5um，4.6*250mm。
16.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(a)供试品的制备具体操作过程为：精密称取2.0g的血平片粉末，精密加入50％～90％甲醇溶液25ml，称重，加热回流2小时，放冷，用50％～90％甲醇补足减失重量，滤过，取续滤液即得供试品溶液；
17.步骤(b)对照品的制备具体操作过程为：精密称取毛蕊花糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、地榆皂苷-ii、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1对照品适量，分别加甲醇制成每1ml含0.04mg/ml的对照品溶液；
18.步骤(c)测定方法具体操作过程为：分别精密吸取对照品和供试品溶液，注入液相色谱仪联合紫外检测器和蒸发光散射检测器，测定，记录色谱图的时间为90min；
19.血平片指纹图谱测定条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按下表中规定进行梯度洗脱；柱温30℃；流速为每分钟1ml，检测波长为254nm；理论板数按大黄酚计算应不低于3000；漂移管温度60℃；气流速350kpa；增益值6/32倍。
20.本发明前述血平片指纹图谱的建立方法，优选地，步骤(d)具体操作过程为：将获得的血平片色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版，进行相似度评价。
21.一种血平片在紫外检测器波长254nm条件下得到的指纹图谱中所述的18个特征共有峰与峰17的相对保留时间如下：峰1∶0.094；峰2∶0.148；峰3∶0.187；峰4∶0.333；峰5∶0.444；峰6∶0.465；峰7∶0.575；峰8∶0.67；峰9∶0.691；峰10∶0.705；峰11∶0.783；峰12∶0.813；峰13∶0.847；峰14∶0.869；峰15∶0.884；峰16∶0.97；峰17∶1；峰18∶1.049。其中峰5为毛蕊花糖苷，峰12为芦荟大黄素，峰15为大黄酸，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚。
22.一种血平片在蒸发光散射检测器条件下得到的指纹图谱中所述的5个特征共有峰与峰22的相对保留时间如下：峰19∶0.507；峰20∶0.727；峰21∶0.767；峰22∶1.000；峰23∶1.035。其中峰20为三七皂苷r1，峰21为人参皂苷rg1，峰22为人参皂苷rb1，峰23为地榆皂苷-ii。
23.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
24.(1)本发明所提供的方法建立的血平片指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的表征其质量，有利于全面监控血平片的质量。
25.(2)通过采用液相色谱法联合紫外检测器和蒸发光散射检测器建立的指纹图谱，弥补传统检测器无法对无紫外吸收或紫外末端吸收的大分子成分进行检测的不足，从整体上对血平片多组分进行分析，使用本发明所提供的方法建立的血平片指纹图谱，能有效的表征其质量，有利于全面监控产品的质量。
26.(3)指纹图谱注重各特征峰的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，本发明标定了血平片中23个共有峰，其中10个化合物经过对照品验证，反应信息比较完全，保证了产品质量的长期稳定性，疗效的安全性和可靠性。
27.(4)本发明具有方便、快捷、稳定、精密度高和重现性好等优点，可准确可靠的控制血平片的质量。
附图说明
29.图1不同溶剂提取考察图谱。
30.图2不同提取方式考察图谱。
31.图313批血平片紫外254nm指纹图谱。
32.图413批血平片蒸发光散射指纹图谱。
33.图5血平片紫外254nm对照指纹图谱。
34.图6血平片蒸发光散射对照指纹图谱。
具体实施方式
36.除非另有定义，本发明使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同。通常，本发明使用的命名及下述实验方法都是本领域公知的或常用的。为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。
37.1、仪器：岛津lc20a-elsd液相色谱仪；waters 2695-2996-elsd液相色谱仪；kq-250db型数控超声波清洗；mili-q超纯水仪。
38.2、试药与试剂：血平片批号分别为150902、160301、170301、171101、181001、190903、190904、191101、191201、191202、191203、191204、191205；甲醇，色谱纯；甲醇，分析纯；甲酸，分析纯；水为超纯水。
39.3、对照品：毛蕊花糖苷，批号：111530-201914、大黄素，批号：110756-201913、芦荟大黄素，批号：110795-201710、大黄酸，批号：110757-201607、大黄酚，批号：110796-201922、大黄素甲醚，批号：110758-201817、三七皂苷r1，批号：110745-201921、人参皂苷rg1，批号：110703-201933、人参皂苷rb1，批号：110704-202028、地榆皂苷-ii，批号：111952-201301，上述购自中国药品食品检定研究院。
40.4、血平片建立指纹图谱步骤如下：
41.4.1对照品溶液的制备
42.精密称取毛蕊花糖苷、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、地榆皂苷-ii、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1适量，分别加甲醇制成每1ml含0.04mg/ml的对照品溶液。
43.4.2供试品溶液制备
44.精密称取血平片粉末2.0g，精密加入70％甲醇溶液25ml，称重，加热回流2小时，放冷，用70％甲醇补足减失重量，滤过，即得。
45.4.3色谱条件
46.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，thermo ods hypersil-c18，5um，4.6*250mm；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按下表中规定进行梯度洗脱；柱温30℃；流速为每分钟1ml，检测波长为254nm；理论板数按大黄酚计算应不低于3000；漂移管温度60℃；气流速350kpa；增益值6/32倍。
47.5、供试品制备条件优化
48.5.1提取溶剂考察
49.取血平片样品2.0g，置10ml容量瓶中，加50％甲醇、70％甲醇、90％甲醇、50％乙醇5ml，超声处理10分钟，放冷，分别用相应试剂稀释至刻度，摇匀，注入液相色谱仪，结果见图
1，经四种提取溶剂提取后，差别不大，但经70％甲醇提取的图谱分离的更清晰，且甲醇提取的供试品中的色谱峰峰面积较大，故最终选取70％甲醇作为提取溶剂。
50.5.2提取方式考察
51.分别考察了超声和回流的提取方式，具体方法为取血平片粉末2.0g，加入70％甲醇25ml，超声或回流2小时，放冷，用70％甲醇补足减失重量，滤过，即得。所得色谱图见图2：回流提取方式比超声提取方式对成分提取更完全，故最终选取回流2小时作为提取方式。
52.6、特征峰归属考察分别测定了毛蕊花糖苷对照品液、地黄药材供试液、地榆皂苷-ii对照品液、地榆药材供试液、三七皂苷r1、人参皂苷rg1、人参皂苷rb1混标对照品液、三七药材供试液、熟大黄药材供试液、大黄素、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚混标对照品液、蒲黄药材供试液、海螵蛸药材供试液、茜草药材供试液，用来确定血平片指纹图谱中特征峰的峰归属，结果显示主要特征峰来源于地黄、熟大黄、茜草、三七、地榆。其中1、4、5号峰来自地黄，8、9、10、13号峰来自茜草，12、15、16、17、18号峰来自熟大黄，20、21、22号峰来自三七，23号峰来自地榆。峰5为毛蕊花糖苷，峰12为芦荟大黄素，峰15为大黄酸，峰16为大黄素，峰17为大黄酚，峰18为大黄素甲醚，峰20为三七皂苷r1，峰21为人参皂苷rg1，峰22为人参皂苷rb1，峰23为地榆皂苷-ii。
53.7、方法学验证
54.7.1精密度试验
55.取批号：150902血平片样品制成供试品溶液，按上述色谱条件连续进样6针，计算其rsd值，结果见表1、2，结果表明，连续六次进样，其紫外、蒸发光散射rsd值分别为1.16、1.20，方法精密度良好。
56.表1.精密度-紫外检测器254nm
57.表2.精密度-蒸发光散射蒸发光散射
58.7.2重复性试验
59.取批号：150902血平片样品，平行制备供试品溶液共6份，按色谱条件进行测定，计算其rsd值，结果见表3、4，结果表明，平行制备6份血平片供试品溶液的紫外、蒸发光散射rsd值分别为1.49、0.38，方法重复性良好。
60.表3.重复性-紫外检测器254nm
61.表4.重复性-蒸发光散射
62.7.3溶液稳定性试验
63.取批号：150902血平片样品制成供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24小时后进样，计算rsd值，结果见表5、6，结果表明，同一份血平片供试品溶液在0、2、4、8、12、18、24小时后进行测定，其紫外、蒸发光散射rsd值分别为1.75、0.81，方法溶液稳定性良好。
64.表5.溶液稳定性-紫外检测器254nm
65.表6.溶液稳定性-蒸发光散射
66.8、指纹图谱测定
67.取血平片13批样品，按上述样品制备方法及色谱条件，分别测定指纹图谱。将以上13批样品指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”2012版，进行相似度评价。血平片指纹图谱相似度研究结果见图3、4及表7、8，生成的对照指纹图谱见图5、6。结果表明，不同批次血平片在紫外检测器与蒸发光散射检测器检测下得到的指纹图谱相似度均大于0.9，说明各批次的样品色谱模式相似，其化学成分一致性较好。
68.表7不同批次血平片指纹图谱相似度计算结果-紫外检测器254nm
69.表8不同批次血平片指纹图谱相似度计算结果-蒸发光散射
70.应当说明的是，虽然本发明以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何熟习此项技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。