去氢骆驼蓬碱在制备沙门氏菌Ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用

去氢骆驼蓬碱在制备沙门氏菌ⅲ型分泌系统抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于医学制药技术领域，具体涉及去氢骆驼蓬碱在抑制沙门氏菌iii型分泌系统(t3ss)及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的应用。


背景技术：

2.沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式疾病的总称。鼠伤寒沙门氏菌是一种导致肠道感染的重要人畜共患食源性病原菌，引起的症状轻至肠炎重至败血症和全身系统性损伤，可加重病态或死亡率，降低动物的繁殖生产力。临床上沙门氏菌感染较难控制，治疗效果非常不理想，给畜禽养殖业造成了巨大的经济损失，并严重威胁公共健康和食品安全。目前，抗生素被广泛用于鼠伤寒沙门氏菌感染，但长期使用抗生素不可避免地导致细菌耐药性。随着抗生素耐药性的增强，对于细菌感染的治疗和预防变得十分困难，所以迫切需要一种新的抗感染疗法。
3.抗毒力策略是解决抗生素耐药性问题最有希望的解决方案之一。沙门氏菌ⅲ型分泌系统(t3ss)是一种类似注射器的精密分子装置，将效应蛋白转运到真核宿主细胞中以诱导感染，可促进细菌在宿主细胞中的入侵和复制，这对于某些细菌病原体的毒力至关重要。t3ss靶向治疗策略解除病原菌的武装，但不直接杀死它们，从而降低诱导耐药性的风险。因此，t3ss对于开发针对细菌感染的创新药物而言是一个极其重要的目标。
4.去氢骆驼蓬碱(harmine)是一种天然生物碱，最初分离自骆驼蓬种子，常用于抗焦虑研究。广泛分布于自然界，如各种植物、海洋生物、昆虫和哺乳动物。据报道，harmine能够抑制几种癌细胞的生长，暗示其在癌症治疗中的潜在用途。目前，国内外未见harmine通过抑制沙门氏菌ⅲ型分泌系统的功能来抵抗沙门氏菌感染的报道。


技术实现要素：

5.本发明所述去氢骆驼蓬碱cas登录号为442-51-3，分子式为c
13h12
n2o，分子量为212。
6.去氢骆驼蓬碱的化学结构式如下：
[0007][0008]
本研究以沙门氏菌ⅲ型分泌系统效应蛋白为药物靶标筛选得到的天然化合物去氢骆驼蓬碱在较低浓度下通过抑制调节蛋白hila的转录和表达，进而阻断沙门氏菌的入侵，最终导致效应蛋白(sipa、sipb和sipc等)的表达水平显著降低。体外试验表明，在有效浓度范围内(≤32μg/ml)去氢骆驼蓬碱不具有细胞毒性，且不影响细菌生长，经去氢骆驼蓬碱预处理沙门氏菌后，沙门氏菌侵入hela细胞的能力显著降低。体内试验中，经去氢骆驼蓬碱治疗后沙门氏菌感染小鼠存活率达30.00％，靶器官(肝脏和脾脏)细菌定殖数显著降低。
附图说明
[0009]
图1：去氢骆驼蓬碱抑制沙门氏菌ⅲ型分泌系统的功能(横轴表示野生型沙门氏菌感染组、野生型沙门氏菌感染加药物处理组和iii型分泌系统功能丧失的沙门氏菌感染组；纵轴表示含有被转运sipa的细胞数量，表示不同实验组沙门氏菌对sipa的转运能力)
[0010]
图2：去氢骆驼蓬碱可显著抑制沙门氏菌效应蛋白基因及调控基因的转录和表达图3：去氢骆驼蓬碱治疗显著提高沙门氏菌感染小鼠保护率(横轴表示时间，纵轴表示存活率)
[0011]
图4：去氢骆驼蓬碱降低感染小鼠靶器官菌落定殖数(横轴表示不同处理组肝脏、脾脏和盲肠组织，纵轴为菌落定殖数)
具体实施方式
[0012]
通过以下实施进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
[0013]
实施例1
[0014]
去氢骆驼蓬碱作为沙门氏菌t3ss调控蛋白的抑制剂及在制备治疗沙门氏菌感染药物中的作用，用于药学上可接受的任何载体。
[0015]
实施例2
[0016]
去氢骆驼蓬碱作为沙门氏菌t3ss关键调控网络hila、hilc、hild和rtsa的抑制剂用于制备治疗感染性疾病的药物。
[0017]
实施例3
[0018]
去氢骆驼蓬碱作为沙门氏菌t3ss调控蛋白的抑制剂用于治疗细菌引起的感染性疾病，特别是由沙门氏菌引起的人畜感染等疾病。
[0019]
1.沙门氏菌iii型分泌系统抑制剂的筛选
[0020]
以沙门氏菌效应蛋白sipa与β-内酰胺酶融合(sipa-tem)报告质粒系统及tem荧光底物ccf-4检测受试化合物对沙门氏菌ⅲ型分泌系统功能的影响。细胞内的ccf4在没有β-内酰胺酶活性的条件下，在409nm激发完整ccf4分子中的香豆素会使荧光共振能量转移至荧光素，使荧光素发出518nm的绿色荧光信号。在β-内酰胺酶活性条件下，ccf4的切割能从空间上将两种染料分开并干扰荧光共振能量转移(fret)，此时如果用409nm的光激发香豆素，产生的将是447nm的蓝色荧光信号。这种蓝色信号在显微镜下易于观察，也可通过荧光酶标仪蓝色通道读数的增加进行检测。通过天然化合物与沙门氏菌提前共孵育后感染细胞，再以感染细胞后呈现不同颜色荧光信号进行抑制剂的筛选，若信号由绿变蓝受到抑制，则表明该化合物可能抑制sipa-tem的向细胞内的转运，辅以蛋白免疫印迹试验检测去氢骆驼蓬碱对t3ss入侵相关效应蛋白表达的影响。
[0021]
结果表明：sipa-tem融合报告质粒系统与免疫荧光图显示，与阳性对照组相比(t3ss效应蛋白sipa能够正常转运至细胞内，细胞呈蓝色荧光)，去氢骆驼蓬碱在浓度为32μg/ml时可以显著抑制沙门氏菌t3ss效应蛋白sipa由胞外转运至胞内，失去正常功能(视野内绝大部分细胞呈绿色荧光)，与沙门氏菌inva基因敲除株感染组结果相似(inva基因编码的蛋白inva是介导t3ss系统效应蛋白转运的关键基因，敲除后失去正常的功能。因此，细胞
呈绿色荧光)(见附图1)。
[0022]
2.去氢骆驼蓬碱对沙门氏菌生长的影响
[0023]
沙门氏菌接种至lb液体培养基(0.3m nacl)中过夜培养(37℃，200rpm)，次日1:100扩培至od
600nm
为0.3左右，分装至锥形瓶(20ml/瓶)，分别设定不加药物组和不同浓度去氢骆驼蓬碱处理组。37℃，200rpm继续培养，每隔30min测定并记录每组样品的od
600nm
，直至细菌生长至平台期。
[0024]
结论：在7h的培养时间内，去氢骆驼蓬碱处理组(0～32μg/ml)与未加药物处理组相比，细菌生长至平台期od
600nm
值无显著差异，表明去氢骆驼蓬碱在有效浓度范围内不影响细菌正常生长(见附表1)。
[0025]
附表1去氢骆驼蓬碱对沙门氏菌(sl1344)生长的影响测定
[0026][0027]
3去氢骆驼蓬碱对沙门氏菌入侵宿主细胞的影响
[0028]
3.1去氢骆驼蓬碱对宿主细胞无细胞毒性
[0029]
hela细胞于96孔板内过夜培养(2.0
×
104个/孔)，次日分别加入不同浓度去氢骆驼蓬碱处理组、dmem组(dmem处理组，不加药)和0.1％tritonx组(不加去氢骆驼蓬碱，能够确保细胞充分裂解死亡)，每组设定三个重复，1000rpm离心10min于37℃温箱培养8h后1000rpm离心10min取细胞培养上清于新96孔板，按照乳酸脱氢酶(ldh)试剂盒说明测定492nm处吸光度，计算各组ldh释放率。公式如下：ldh释放率(％)＝(待测组-dmem对照组)/(0.1％tritonx组-dmem对照组)
[0030]
结论：与未加去氢骆驼蓬碱处理组相比，在2～16μg/ml浓度范围内去氢骆驼蓬碱对hela细胞几乎无毒性(见附表2)。
[0031]
附表2去氢骆驼蓬碱对hela细胞毒性测定
[0032][0033]
4去氢骆驼蓬碱对t3ss效应蛋白基因及其调控基因的转录和表达的影响
[0034]
沙门氏菌接种至lb液体培养基(0.3m nacl)中过夜培养(37℃，200rpm)，次日1:
100扩培至od
600nm
为0.3左右，分别设定不加药物组和不同浓度去氢骆驼蓬碱处理组。37℃，200rpm继续培养5h，取菌液，离心，一部分用于提取rna，反转录，获得cdna后进行qrt-pcr分析，同时取适量菌液，加入适量的sds-loading buffer，煮沸10min，sds-page和蛋白免疫印迹(western blotting)分析t3ss效应蛋白基因和调控基因的表达情况。
[0035]
结论：去氢骆驼蓬碱在8-32μg/ml浓度下，可通过抑制hila、hilc、hild、rtsa蛋白基因的转录和hila的表达，经去氢骆驼蓬碱预处理后，沙门氏菌t3ss入侵相关效应蛋白(sipa、sipb和sipc)表达水平均出现不同程度的下降，该结果表明去氢骆驼蓬碱通过抑制沙门氏菌ⅲ型分泌系统效应蛋白sipa的转运和入侵相关效应蛋白(sipa、sipb和sipc)的表达而影响沙门氏菌t3ss的功能(见附图2)。
[0036]
5去氢骆驼蓬碱对小鼠沙门氏菌感染的保护作用
[0037]
5.1沙门氏菌感染小鼠模型的建立
[0038]
6-8周龄雌性balb/c小鼠(体重18～22g)，适应性饲养2～3天，5g/l链霉素饮水预处理24h，感染前禁食12h，采用口服灌胃的方式灌服沙门氏菌(5
×
107cfu/只)建立小鼠感染沙门氏菌肠炎模型。
[0039]
5.2保护率试验
[0040]
链霉素预处理小鼠随机分为健康对照组，沙门氏菌感染 pbs处理组、沙门氏菌感染 去氢骆驼蓬碱处理组，沙门氏菌感染 去氢骆驼蓬碱处理组在细菌感染小鼠后灌服100mg/kg去氢骆驼蓬碱，3次/天，连用4天，其中沙门氏菌感染 生理盐水处理组在相同时间内灌服相应体积pbs，健康对照组不做任何处理，连续10天统计不同处理组小鼠的精神状态和死亡情况。
[0041]
结论：健康对照组10d内均未出现死亡，存活率为100.00％；感染组第5天和第7的死亡率分别为50.00％和100.00％；感染治疗组第7天存活率为30.00％，保护率显著高于感染组(见附图3)。
[0042]
5.3靶器官菌落定殖数检测
[0043]
感染后第5天颈椎脱臼处死小鼠，取各组小鼠的肝脏和脾脏组织，称重研磨制备组织匀浆，pbs倍比稀释后涂于含有链霉素抗性的lb琼脂细菌培养平板，37℃培养12h后进行菌落计数。
[0044]
结论：与感染组相比，去氢骆驼蓬碱治疗后，小鼠靶器官(肝和脾)的细菌定植显著减少(见附图4)。
[0045]
综上所述，本研究以沙门氏菌感染人宫颈癌细胞系(hela)，建立细胞水平的药物保护效果评价模型；以口服感染沙门氏菌的方式成功建立沙门氏菌感染小鼠模型，发现去氢骆驼蓬碱降低沙门氏菌感染小鼠的死亡率，并抑制肝脏和脾脏的菌落定殖，这些研究将为沙门氏菌感染新药研发提供思路和基础。