一种同时检测鸡蛋中杆菌肽A和杆菌肽B残留量的方法与流程

b3ch2ch3ch3ch2ch3c1ch3ch2ch3ch3c2ch2ch3ch3ch3c3ch3ch3ch2ch3fch2ch3ch2ch3ch2ch39.为了保证动物性食品及公共卫生安全，需要对动物性食品中杆菌肽残留量进行监督和检 测，我国国家标准gb31650-2019《食品安全国家标准食品中兽药最大残留限量》规定在动物 肌肉、肝脏、肾脏、脂肪、牛奶、禽蛋中杆菌肽最大残留限量为500μg/kg。sn/t 4807-2017 《进出口食用动物，饲料中杆菌肽的测定》公布了适用于进出口食用动物的血液和饲料中杆 菌肽残留量检测。
10.根据国内外文献报道，用于杆菌肽的检测方法主要有微生物法、酶联免疫吸附法(elisa)、 毛细管电泳法(ce)和高效液相色谱法(hplc)。微生物法简单直观，通过抑菌圈的大小就可大 致判断多肽类抗生素的抑菌能力，但是操作过程繁琐耗时，检测灵敏度较低。酶联免疫吸附 法(elisa)快速简便，适用于大量样品的分析，但易出现假阳性结果。毛细管电泳法(ce)的分 离速度快、分离效率高，但也存在如线性范围窄、重现性差等不足。高效液相色谱法(hplc) 能对样品进行高分离、定量测定，但是随着各国规定的最高残留限量日益降低，其由于检测 器的限制，无法满足低残留检测的需求。
11.目前已有的国家标准应用于检测动物性食品中杆菌肽的残留时存在较大的局限性，只是 实现对单个的活性成分杆菌肽a的检测，无法对杆菌肽b有效成分进行检测，中国专利文献 cn107904198公开了一种高产杆菌肽a的地衣芽孢杆菌基因改组菌株及应用。本发明采取了育 种新技术中的等离子体诱变技术，与传统物理、化学诱变方法相结合，并采用基因组改组技 术，效果明显，产量提高显著。本发明提供的用于杆菌肽a高效发酵生产的基因改组菌株f2-x1， 降低了以地衣芽孢杆菌为发酵菌株，生产杆菌肽的成本。而且产量提高明显，经所述条件发 酵后，杆菌肽a产量可达到1.7g/l,适用于大规模发酵生产杆菌肽a。本发明提供的以hplc检测 方法简单准确，是用于快速准确检测杆菌肽a产量，该方法也只是实现对单个的活性成分杆菌 肽a的检测，无法对杆菌肽b有效成分进行检测，存在一定的局限性。
12.由于杆菌肽组分较多，对其分离具有较大的难度，现有的方法无法对杆菌肽a、杆菌肽b 有效分离，因此，建立同时检测鸡蛋中杆菌肽a和杆菌肽b残留量的方法，对于有效监控该种 药物的使用，保障我国动物源性食品安全具有重要意义。


技术实现要素：

13.针对现有技术的不足，本发明一种同时检测鸡蛋中杆菌肽a和杆菌肽b残留量的方法。
14.本发明的方法可以实现鸡蛋组织内杆菌肽a和杆菌肽b的定量检测。本发明具有抗干扰 能力强，检测限低，灵敏度高，检测快速的特点。
15.本发明是通过如下技术方案实现的：
16.一种同时检测鸡蛋中杆菌肽a和杆菌肽b残留量的方法，包括步骤如下：
17.1)鸡蛋空白样品提取：取鸡蛋空白样品先用三氯乙酸乙腈溶液涡旋浸提，提取后，
再采 用三氟乙酸水溶液振荡提取，提取后离心，合并两次提取的上清液，浓缩，加入正己烷振荡 离心，弃去上层正己烷层，下层清液为空白样品溶液；
18.2)空白样品溶液净化：将空白样品溶液过固相萃取柱，淋洗，抽干固相萃取柱；洗脱， 收集洗脱液，氮气吹干，吹干后的残渣，加入已知浓度杆菌肽a标准液、杆菌肽b标准液复 溶，涡旋，微孔滤膜过滤，得到鸡蛋基质匹配混合标准溶液；
19.3)鸡蛋基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积为 纵坐标，对应的质量浓度为横坐标作鸡蛋基质匹配标准曲线；
20.4)待测样品提取、净化：取待测鸡蛋样品按步骤1)的方法进行提取，按步骤2)的方 法过柱净化，吹干后的残渣用甲酸水溶液复溶，涡旋，微孔滤膜过滤，得到待测样品净化液；
21.5)将步骤4)中所得的待测样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定，得到待测样品净化 液的色谱峰面积，根据鸡蛋基质匹配标准曲线计算得到待测样品中杆菌肽a和杆菌肽b的残 留量。
22.根据本发明优选的，步骤5)中，杆菌肽a和杆菌肽b的残留量结果计算：
23.i)基质匹配标准曲线校准
24.将鸡蛋基质匹配标准曲线每个组分的浓度和对应峰面积进行回归分析，然后按公式1分别 计算待测样品杆菌肽各组分的残留量xa、xb，再将各组分残留量相加即得到杆菌肽a和杆菌肽 b总组分残留量；
[0025][0026]
x
总
(μg/kg)＝xa xb[0027]
式中:
[0028]
x——待测样品中被测单组分残留量(μg/kg)，分别用xa、xb表示；
[0029]
a——待测样品净化液中杆菌肽相应单组分的色谱峰面积；
[0030]
b——基质匹配标准曲线回归方程中截距；
[0031]
a——基质匹配标准曲线回归方程中斜率；
[0032]
m——待测样品的质量(g)；
[0033]
v——残余物定容的体积(ml)；
[0034]
x
总
——待测样品中杆菌肽总组分的残留量(μg/kg)；
[0035]
ii)单点校准
[0036]
按公式2计算待测样品中杆菌肽单组分残留量xa、xb，再将各组分残留量相加即得到杆菌 肽a和杆菌肽b总组分残留量；
[0037][0038]
x
总
(μg/kg)＝xa xb[0039]
式中：
[0040]
x——待测样品中被测杆菌肽单组分的残留量(μg/kg)，分别用xa、xb、表示；
[0041]cs
——空白样品溶液中相应杆菌肽单组分的浓度(ng/ml)；
[0042]
a——待测样品净化液中相应杆菌肽组分的色谱峰面积；
[0043]as
——空白样品溶液中相应杆菌肽组分的色谱峰面积；
[0044]
m——待测样品的质量(g)；
[0045]
v——残余物定容的体积(ml)；
[0046]
x
总
——待测样品中杆菌肽总组分的残留量(μg/kg)。
[0047]
计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。
[0048]
根据本发明优选的，步骤1)中，三氯乙酸乙腈溶液中三氯乙酸的质量浓度为8-12％，鸡 蛋空白样品与三氯乙酸乙腈溶液的质量体积比为：1：(1-5)，单位：g/ml；涡旋时间为1-3min。
[0049]
根据本发明优选的，步骤1)中，三氟乙酸水溶液的质量浓度为0.1-1％，鸡蛋空白样品 与三氟乙酸水溶液的质量体积比为：1：(4-8)，单位：g/ml；振荡提取时间为8-12min。
[0050]
根据本发明优选的，步骤1)中，提取后离心为于10000-20000rpm转速下离心4-10min。
[0051]
根据本发明优选的，步骤1)中，浓缩为将上清液氮气吹至15-25ml。
[0052]
根据本发明优选的，步骤1)中，正己烷的加入量与浓缩后上清液的体积比为(8-12)： (15-25)，加入正己烷振荡离心为于10000-20000rpm转速下离心3-6min。
[0053]
根据本发明优选的，步骤2)中，固相萃取柱为hlb固相萃取柱，空白样品溶液过柱前， 分别用5ml甲醇、5ml水活化平衡固相萃取柱，空白样品溶液过柱后，再分别用5ml质 量浓度2％甲醇水溶液和5ml水淋洗。
[0054]
根据本发明优选的，步骤2)中，洗脱为用6ml甲酸、甲醇和乙腈的混合液洗脱，甲酸、 甲醇和乙腈的混合液中，甲醇与乙腈的体积比为1:1，甲酸占混合液质量的1-3％，复溶时杆 菌肽a标准液、杆菌肽b标准液的加入量为1ml，复溶后涡旋3min，微孔滤膜过滤为采用 0.22μm微孔滤膜过滤。
[0055]
根据本发明优选的，步骤4)中，用甲酸水溶液复溶为用1ml质量浓度为0.1％的甲酸 水溶液复溶。
[0056]
根据本发明优选的，步骤3)和步骤5)中，所采用的色谱条件为：色谱柱为agilent zobaxeclipse plus-c
18
色谱柱，柱温为30-40℃，流动相a为0.2％甲酸水溶液，流动相b为0.2％甲 酸甲醇，a、b两相的混合液作为洗脱液；洗脱梯度程序:0～1min，90％a；1～1.5min，20％a 线性变化到44％a；1.5～4.5min，44％a；4.5～5min，44％a线性变化到10％a；5～7min， 10％a；7～10min，90％a；流速：0.4ml/min；进样量：8～12μl。
[0057]
根据本发明优选的，步骤3)和步骤5)中，所述色谱柱规格为长(100-250)mm
×
内径 3.0mm，填料颗粒粒径1.8μm。
[0058]
根据本发明优选的，步骤3)和步骤5)中，流动相梯度洗脱程序如表2所示：
[0059]
表2 梯度洗脱条件
[0060][0061]
根据本发明优选的，步骤3)和步骤5)中，流动相a与流动相b的体积比为44％：56％～ 45％：55％。
[0062]
最为优选的，步骤3)和步骤5)中，流动相a为44％，流动相b为56％。
[0063]
根据本发明优选的，步骤3)和步骤5)中，所采用的质谱条件为：离子源为电喷雾esi 离子源，正离子扫描模式，扫描方式为多反应监测mrm，离子源温度(tem)为550℃， 离子化电压(is)为5500v，气帘气(cur)为25psi，喷雾气(gs1)为60psi，辅助加热 气(gs2)为50psi；
[0064]
杆菌肽a的母离子-子离子对为m/z 712.0([m/2 h] )
→
m/z199.1/227.1，去簇电压为 130v，碰撞能量为45v；
[0065]
杆菌肽b的母离子-子离子对为m/z 705.0([m/2 h] )
→
m/z199.0/227.1，去簇电压为130v， 碰撞能量为45v。
[0066]
本发明的技术特点及优点：
[0067]
1、本发明中通过液相色谱-串联质谱法同时把杆菌肽a和杆菌肽b一次测定出来，方法 简便快速、分离效果好，测定精度高，结果重现性好，易于观察，专属性强，色谱峰峰形良 好，节省时间、试剂，可以进行准确而快速的测定。
[0068]
2、本发明的检测方法可以检测鸡蛋中杆菌肽兽药残留，用于有效监控该种药物的使用。
附图说明
[0069]
图1为本发明不同体积比的流动相对杆菌肽b各组分的分离谱图；
[0070]
图2为杆菌肽a子离子质谱图；
[0071]
图3为杆菌肽b子离子质谱图；
[0072]
图4为本发明不同洗脱液对杆菌肽回收率结果图。
具体实施方式：
[0073]
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施 例进行详细描述，但不仅限于此，本发明未详尽说明的，均按本领域常规技术。
[0074]
实施例1：
[0075]
一种同时检测鸡蛋中杆菌肽a和杆菌肽b残留量的方法，包括步骤如下：
[0076]
1)鸡蛋空白样品提取：取鸡蛋空白样品2g(精确至0.01g)，置于50ml离心管中， 加入4ml 10％三氯乙酸乙腈溶液，涡旋1min，然后加入10ml 0.5％三氟乙酸水溶液，振荡 提取10min，于10 000rpm离心8min，转移至另一离心管中，重复上述操作，重复提取一 次，合并两次提取的上清液，混匀，将上清液氮气吹至20ml，加入10ml正己烷，振荡5min， 于10000rpm离心5min，弃去上层正己烷层，将下层清液转移至另一离心管，制得空白样品 溶液；
[0077]
2)空白样品溶液净化；分别用5ml甲醇、5ml水活化和平衡hlb固相萃取柱，将全 部空白样品溶液过柱，然后再分别用5ml 2％甲醇水溶液和5ml水淋洗，抽干固相萃取柱， 用6ml甲酸、甲醇和乙腈的混合液洗脱，甲酸、甲醇和乙腈的混合液中，甲醇与乙腈的体积 比为1:1，甲酸占混合液质量的2％，收集洗脱液，氮气吹干，吹干后的残渣加入已知浓度杆 菌肽a标准液、杆菌肽b标准液1ml复溶复溶后涡旋3min，微孔滤膜过滤为采用0.22μm 微孔滤膜过滤；得到鸡蛋基质匹配混合标准溶液；
[0078]
3)将鸡蛋基质匹配混合标准溶液进行液相色谱-串联质谱测定，以定量离子色谱峰面积 为纵坐标，对应的质量浓度为横坐标作鸡蛋基质匹配标准曲线；
[0079]
4)取待测鸡蛋样品2g(精确至0.01g)，置于50ml离心管中，加入4ml 10％三氯乙 酸乙腈溶液，涡旋1min，然后加入10ml 0.5％三氟乙酸水溶液，振荡提取10min，于10 000 rpm离心8min，转移至另一离心管中，重复上述操作，重复提取一次，合并两次提取的上清 液，混匀，将上清液氮气吹至20ml，加入10ml正己烷，振荡5min，于10000rpm离心5 min，弃去上层正己烷层，将下层清液转移至另一离心管，制得待测样品溶液；
[0080]
5)待测样品溶液净化；分别用5ml甲醇、5ml水活化和平衡hlb固相萃取柱，将全 部待测样品溶液过柱，然后再分别用5ml 2％甲醇水溶液和5ml水淋洗，抽干固相萃取柱， 用6ml甲酸、甲醇和乙腈的混合液洗脱，甲酸、甲醇和乙腈的混合液中，甲醇与乙腈的体积 比为1:1，甲酸占混合液质量的2％，收集洗脱液，氮气吹干，吹干后的残渣加入1ml质量 浓度为0.1％的甲酸水溶液复溶，涡旋3min，微孔滤膜过滤为采用0.22μm微孔滤膜过滤； 得到鸡蛋基质匹配混合标准溶液；得到待测样品净化液；
[0081]
6)将待测样品净化液进行液相色谱-串联质谱测定，得到待测样品净化液的色谱峰面积， 根据鸡蛋基质匹配标准曲线计算得到待测样品中杆菌肽a和杆菌肽b的残留量。
[0082]
所采用的色谱条件：色谱柱：agilent zobax eclipse plus-c18色谱柱(dim：3.0
×
150mm， 粒径：1.8μm)，流动相：0.2％甲酸水和0.2％甲酸甲醇梯度洗脱，流速：0.4ml/min，柱温： 35℃，进样量：10μl；
[0083]
所采用的质谱条件：质谱仪：sciex triple quad4500，离子源：电喷雾离子源，扫描方式： 正离子扫描，检测方式：多反应监测，离子源温度(tem)：550℃，离子化电压(is)：5500 v，气帘气(cur)：25psi；喷雾气(gs1)：60psi；辅助加热气(gs2)：50psi；
[0084]
杆菌肽a和杆菌肽b的串联质谱参数见表3所示：
[0085]
表3 待测药物定性、定量离子对及对应的去簇电压、碰撞能量
[0086][0087]
注：*为定量离子。
[0088]
实验例：检测条件选择
[0089]
1、不同溶剂处理方法对浸提的影响
[0090]
a、由于鸡蛋提取液中杂质含量较多，鸡蛋样品含有丰富的蛋白质与脂肪。分别用4％、 10％、30％的三氯乙酸乙腈溶液提取，结果显示，当使用30％三氯乙酸乙腈溶液时，药物的 回收率较低。而4％和10％的三氯乙酸乙腈溶液在除蛋白效果上差别不显著，10％的三氯乙酸 乙腈溶液对峰型变化的影响、基质干扰程度较小且回收率满足要求，因此选用10％的三氯乙 酸乙腈溶液作为提取溶剂。
[0091]
b、多肽类药物结构中含有多个氨基和羧基属极性化合物，常采用强酸性溶液提取动物源 性食品中的多肽类药物。同时杆菌肽易溶于水，微溶于甲醇、乙腈等有机试剂，分别0.5％ 三氟乙酸水溶液、1％三氟乙酸水溶液和0.5％甲酸水溶液作为提取溶液，研究对杆菌肽提取效 果的影响，结果表明，0.5％三氟乙酸水溶液的提取效果更好。因此选用0.5％三氟乙酸水溶液 作为提取溶剂。
[0092]
2、固相萃取柱的选择及净化方法的优化
[0093]
由于浸提液中有机溶剂含量比较高，不能直接上固相萃取柱净化，本发明将上清液氮气 吹至20ml左右，将有机溶剂去除，但提取液仍有一些内源性干扰物，如蛋白质、脂肪等脂溶 性物质，鸡蛋样品中有丰富的脂肪，蛋黄中脂肪的含量约为28.2％。氮吹至无有机相后，由 于蛋黄中被提取出来的脂类析出，样品提取液出现浑浊的黄色，加入正己烷除脂，得到待检 测样溶液。
[0094]
为得到更干净的上样液，本发明采用固相萃取柱(spe)对试样净化。并考察了c
18
、hlb 净化能力。向样品空白基质提取液(不含待测组分)加入杆菌肽a和杆菌肽b的标准液，得样 液；将样液置于35℃下氮气吹至20ml左右，备用。分别选用c18(200mg/6ml)、hlb(200 mg/6ml)固相萃取柱进行净化。
[0095]
依次用5ml甲醇、5ml水活化和平衡固相萃取柱，之后将样液过柱，接取流出液，待样 液全部流出之后，用5ml2％甲醇水、5ml水淋洗，接取淋洗液，抽干柱子；最后使用5ml 甲醇，5ml0.1％甲酸甲醇洗脱，收集洗脱液，氮吹至无有机相，用0.1％甲酸水溶液定容至1ml， 超声混匀，过微孔有机滤膜，上机检测。同时分别检测c18和hlb柱的样品流出液、淋洗液。
[0096]
结果表明：c18(200mg/6ml)、hlb(200mg/6ml)两种固相萃取柱的回收率都不高， hlb的回收率比c18的回收率高。观察hlb和c18样品流出液，c18检出的目标物，c18对目 标物的保留效果不好，淋洗液中没有检出目标物，说明洗脱液洗脱不完全。故选用hlb固相 萃
取柱，进一步优化洗脱液。
[0097]
同时比较了洗脱液a)2％甲酸甲醇、b)95％甲醇水、c)90％甲醇水、d)80％甲醇水、e)甲 酸、甲醇和乙腈的混合液5种洗脱条件下的洗脱效果，测试结果如图4所示，通过图4可以 看出，甲酸、甲醇和乙腈的混合液最好。
[0098]
3、流动相的选择
[0099]
以agilent公司的zobax eclipse plus-c18(3.0
×
150mm，1.8μm)色谱柱，分别以0.2％甲 酸水溶液-乙腈、0.2％甲酸水溶液-甲醇和0.2％甲酸水溶液-0.2％甲酸甲醇为流动相，测试流动 相对离子化的影响。
[0100]
结果表明：0.2％甲酸水溶液-0.2％甲酸甲醇体系能使杆菌肽在质谱中有较好的响应值及峰 形。
[0101]
为了使杆菌肽a和杆菌肽b目标峰得到很好的分离，不被杂质峰干扰。通过调节不同的流 动相比例，
①
a相：45％b相：55％、
②
a相：44％b相：56％、
③
a相：42％b相：58％，3种 梯度变化时杆菌肽a和杆菌肽b1、b2、b3各组分目标峰的分离度及杂质干扰峰的分离。
[0102]
实验结果表明：在3种不同比例流动相的情况下，杆菌肽a分离度好，不存在杂质峰的 干扰情况；杆菌肽b各组分在
①
、
②
和
③
流动相比例时，b1、b2、b3可以得到很好的分离；
ꢀ①
、
②
流动相不存在杂质峰的干扰，但是
③
流动相在最后一个组分目标峰处，存在杂质峰的 干扰。为了能使单位时间的分离能力增加，色谱时间缩短，故
②
a相：44％b相：56％保持 3min中的等度洗脱，不同体积比的流动相对杆菌肽b各组分的分离谱图见图1。
[0103]
4、质谱条件的选择及优化
[0104]
通过注射泵将杆菌肽为1000μg/l的混合标准溶液以5μl/min的流速注射进离子源中。在 正离子模式下进行一级质谱扫描，得到各个组分的母离子峰；然后再对各组分的分子离子进 行二级质谱扫描，得到各自的子离子信息；见图2、图3所示。
[0105]
可知杆菌肽a的分子质量为1422.69一般选择m/z 712.0([m/2 h] )为母离子，m/z199.1、 227.1的子离子来监测杆菌肽a。杆菌肽b的分子质量为1408.66，一般选择m/z 705.2 ([m/2 h] )为母离子m/z199.0、227.1的子离子来监测杆菌肽b。杆菌肽的母离子、子离子分子 量的数值均与现有报道的一致。