基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器

1.本发明涉及生物医学传感器技术领域，尤其是一种基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器及检测方法。


背景技术：

2.表面等离子体共振(surface plasmon resonance，spr)生物传感器，是基于生物分子在识别并形成复合物过程中，引起界面折射率变化与一定波长的入射光在界面形成的反射光衰减程度存在直接相关性的原理而研制的一种光学检测仪器。表面等离子体共振(surface plasmon resonance,spr)传感器，与传统的电化学传感器相比较，具有检测速度更快、更易于操作等特点。目前，市场上以biacore系列的spr分析仪器为主导，该仪器将能特异性识别待测物的检测分子修饰在传感器表面，当样本溶液流过传感器芯片表面时，若样本中的待测物分子与检测分子发生特异性反应，将会引起传感器表面的物质质量(厚度)发生变化，表面折射率也会发生相应的变化，从而影响spr信号。
3.表面等离子体共振，是由金属薄膜的光学耦合产生的一种物理效应。当光束以临界角从光密介质射入到光疏介质中时，会发生全反射现象，此时，如果光疏介质中的倏逝波的传播常数与金属膜内表面电子(即等离子体)的传播常数相互匹配，就会引起电子共振，即发生表面等离子共振。此时，入射光的部分能量被吸收，并在反射光谱上出现一个最小值，即共振峰。共振峰的位置随金属膜表面待测物的折射率变化而变化，通过建立数学模型，推算出待测介质的折射率，即可换算出待测介质的浓度。在生物分子的研究和检测方面，通过在金属表面修饰不同的物质，可以特异性吸附生物分子，当它们发生相互作用时产生的化学变化，将导致传感器表面折射率变化，然后再将光信号转化为电信号，从而达到定量分析生物分子浓度的目的。
4.然而，现有的商用化spr仪器大多数是基于棱镜耦合式结构，相对于光纤spr传感器，虽具有较高的灵敏度，但是光学和机械零件繁多且成本高昂，尤其是难以实现系统的小型化，因此，近年来一些研究人员将目光转移向了基于光纤的spr传感器，并取得了一些进展。
5.c-反应蛋白(c-reactive protein，crp)在人体内的含量变化，相对于影像学检测或临床症状可以较早表征患者疾病病情，并且crp的检测样本采集简便，检验过程操作简单、快速，因此，该方法适用于炎症相关疾病的发现和筛查。但是，对于现有的、普通的基于抗原-抗体作用的亲和型光纤spr传感器，由于抗体分子本身质量较大，当crp与抗体结合时，传感器表面附近的折射率变化不足以引起共振波长的较大变化，也就是说，基于抗原-抗体作用的亲和型光纤spr传感器的无标签检测方法得到的传感器响应过于微弱，因此，通过现有的反射光谱相关检测设备，在每次检测操作中，需要额外的信号增强标签对传感器的响应信号进行放大，因此提高了检测成本，并且其操作复杂，无法实现大规模推广。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题在于提供一种基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器。
7.本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种具有上述微型光纤表面等离子共振传感器的检测系统。
8.本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种应用上述微型光纤表面等离子共振传感器的crp检测方法。
9.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
10.一种基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，包括光纤spr传感器主体和sma连接器(1)，所述光纤spr传感器主体为一根光纤(1000)，该光纤的两端分别安装有一个sma连接器(1)；所述光纤包括从内向外依次分布的纤芯(7)、包层(101)以及涂覆层(2)；所述光纤上设置有传感区域(100)，所述传感区域包括从内向外依次分布的纤芯(7)、粘结层(6)、金膜层(5)、自组装分子层(4)、适体特异性识别层(3)和流体运输层(8)，所述流体运输层(8)两端插有流体运输管(802)，其中，流体运输层(8)的轴向长度大于传感区域(100)(约10mm左右)，通过在流体运输层(8)和涂覆层(2)之间的缝隙注入环氧胶，将流体运输层(8)固定到光纤的涂覆层(2)上。
11.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述光纤(1000)为多模光纤、单模光纤或侧边抛磨光纤。
12.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述粘结层(6)的材质为金属铬或金属钛，粘结层(6)为金属铬膜或者金属钛膜。
13.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述传感区域(100)沿着光纤的轴向所分布的长度范围为10-15mm。
14.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述传感区域(100)中的金膜层的厚度范围为20-45nm。
15.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述适体特异性识别层(3)是通过在经过热退火处理的含有特异性dna适体的标准浓度tris缓冲液中浸泡获得。
16.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述自组装分子层(4)是通过在6-巯基1-己醇溶液中浸泡获得。
17.优选的，上述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，所述流体运输层(8)包括反应室(801)和运输管(802)两部分，反应室(801)由包裹在光纤外围的硅橡胶软管制成，橡胶管内径为2mm，外径为2.5mm，长度为15mm,运输管(802)由通过环氧胶粘附在反应室两端的pvc管制成，pvc管外径为1.5mm，内径为1mm，长度为30cm-50cm，整个流体运输层使用环氧胶封闭，并固定在光纤上。
18.一种具有上述微型光纤表面等离子共振传感器的检测系统，包括微型光纤表面等离子共振传感器、光源、光谱仪和计算机，其中，光纤spr传感器主体两端的sma连接器(1)，分别对应与光源(301)的输出接口和光谱仪(302)的输入接口相连接；所述光谱仪(302)的输出端与计算机(303)相连接。
19.一种应用上述微型光纤表面等离子共振传感器的crp检测方法，通过向光纤spr传
感器主体的传感区域表面注入crp生物分子，在光纤spr传感器主体的反射光谱中会得到强烈的偏移共振峰，并由此可以得到crp生物分子所对应的共振波长(共振峰在反射光谱上对应的波长，即为共振波长)，从而可以建立不同浓度的生物分子与共振波长之间的线性关系。
20.因此，对于需要检测的、未知浓度的crp生物分子，在注入光纤spr传感器主体的传感区域表面后，根据crp生物分子在反射光谱中对应的不同共振峰，以及已建立的不同浓度的生物分子与共振波长之间的线性关系，可以获得待测crp生物分子的浓度。
21.有益效果：
22.所述基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，有利于进一步实现对crp分子的高灵敏度检测，提高检测效率，具体优点如下：
23.1、本发明提出的基于适体变构效应的光纤spr传感器，通过利用crp特异性引发dna适体构象改变引起强烈的spr传感器共振波长的偏移，能够实现对crp蛋白分子的高灵敏度检测，同时不需要进一步的信号增强手段，因此，可以显著提高光纤spr传感器的检测效率；
24.2、本发明提出的基于适体变构效应的光纤spr传感器，相比于现有的其他crp检测方法，拥有体积小、灵敏度高、无毒无污染的优点。
附图说明
25.图1为本发明所述基适体变构效应的光纤spr传感器的整体结构示意简图；
26.图2为沿图1传感区域的剖视图；
27.图3为本发明所述基于适体变构效应的光纤spr传感器，与由光源、光谱仪和计算机等组成的一个现有的反射光谱检测系统之间的结构连接图。
28.图中，1-sma连接器 2-涂覆层 3-适体特异性识别层 4-自组装分子层
29.5-金膜层 6-粘接层 7-纤芯 8-流体运输层
30.801-反应室 802-运输管 100-传感区域 101-包层
31.301-光源 302-光谱仪 303-计算机 1000-光纤
具体实施方式
32.下面结合实施例和附图对本发明的一种基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器及其实施方法做出详细说明。
33.实施例1
34.一种基于适体变构效应的微型光纤表面等离子共振传感器，结构如下：
35.参见图1至图3，本发明提供了一种基于适体变构效应的光纤spr传感器，包括光纤spr传感器主体；
36.光纤spr传感器主体为一根光纤1000；
37.该光纤的两端，分别安装有一个sma连接器1；
38.该光纤，包括从内向外依次分布的纤芯7、包层101以及涂覆层2；
39.该光纤上，设置一定长度的传感区域100；包括从内向外依次分布的纤芯7、粘结层6、金膜层5、自组装分子层4；该传感区域不包括涂覆层2和包层101，涂覆层2和包层101被剥
离；
40.在本发明中，需要说明的是，sma连接器1(即sma接头)，全称是sub miniature version a，是一种典型的高频连接器。由于sma接头具有尺寸小、可靠性高、频带宽、性能优、寿命长等特点，所以，经常适用于微波设备和数字通信系统中连接射频电缆、光纤或微带线。例如，sma连接器，可以采用sma905光纤接头。
41.本发明具体实现上，传感区域100沿着光纤的轴向所分布的长度为10mm(10-15mm均可)；光纤spr传感器主体1000与sma接头的连接部分，表面覆盖有环氧胶，用于固定传感器整体结构。所述光纤spr传感器主体1000采用的光纤的种类为深圳鑫锐光技术有限公司生产的型号为cs-h600的多模光纤(也可以为单模光纤或侧边抛磨光纤)；粘结层6为铬膜，其材质为金属铬(也可以为金属钛膜，其材质为金属钛)。
42.综合考虑本发明的光纤spr共振峰的位置与衰减深度，传感区域100中的金膜层5的厚度为40nm(20-45nm均可)；由于dna适体分子不能直接与光纤表面的金膜形成稳定的结合，因此需要将dna适体分子巯基化修饰。所述传感区域分别具有的自组装分子层4以及适体特异性识别层3，分别是利用6-巯基1-己醇溶液、经过热退火处理的含有dna适体分子的tris缓冲液而形成(具体为通过在11-巯基十一烷酸溶液中浸泡获得)，金膜层5外部先形成适体特异性识别层4之后形成自组装分子层3。具体实现上，6-巯基1-己醇溶液中，6-巯基1-己醇的浓度范围为1mm(毫摩尔每升)经过热退火处理的含有dna适体分子的tris缓冲液中，dna适体分子的浓度为100nm(纳摩尔)(50nm-1000nm(纳摩尔)均可)；tris浓度为10mm(毫摩尔)，热退火温度为95℃(摄氏度)到4℃(摄氏度)，退火速率为-1℃/s(摄氏度每秒)。
43.流体运输层8包括反应室801和运输管802两部分，反应室801由包裹在光纤外围的硅橡胶软管制成，橡胶管内径为2mm，外径为2.5mm，运输管802由通过环氧胶粘附在反应室两端的pvc管制成，pvc管外径为1.5mm，内径为1mm，长度为30cm-50cm，整个流体运输层8使用环氧胶封闭并固定在光纤上，其中，流体运输层8的轴向长度大于传感区域100约10mm左右，通过在流体运输层8和涂覆层2之间的缝隙注入环氧胶，将流体运输层8固定到光纤的涂覆层2上。
44.需要说明的是，对于本发明，鉴于当金膜直接蒸镀在光纤传感区域表面时，因其附着性较差遇水溶液易脱落，会直接影响测量结果，因此，本发明可选用对共振峰曲线影响较小的金属铬膜或金属钛膜作为粘结层6。
45.对于本发明，当光束经过传感区域时，其透过粘结层传递到金膜层5，该金膜层5可以激发spr效应，当金膜层厚度增加时，传感器的共振波长发生明显的红移，且衰减深度急剧减小，这是由于金膜变厚而导致的可激发spr现象的倏逝波能量减小，但是若表面蒸镀的薄膜厚度太薄，则难以保证在实际蒸镀中光纤表面金属薄膜的均匀性，从而会增大测量误差。
46.在本发明中，为了制备上述本发明提供的基于适体变构效应的光纤spr传感器，本发明还提供了一种基于适体变构效应的光纤spr传感器的制备方法，具体包括以下步骤：
47.第一步，传感区域的去包层101处理：在一根预设长度的光纤上，预先确定传感区域的分布位置，然后对这个位置剥离涂覆层2和包层101，获得一段裸露的纤芯，然后将整个光纤擦洗干净，并通过氮气枪缓慢吹干，进行干燥处理；
48.例如，在长度为100mm的多模光纤上，预先确定位置的传感区域100，然后再剥掉传
感区域100上长约为10mm的涂覆层2和包层101，裸露出纤芯7表面，确保无包层101残留，然后按照去离子水-乙醇-异丙醇-乙醇-去离子水的先后顺序，将整个光纤擦洗干净，氮气干燥；
49.第二步，蒸镀传感区域：采用热蒸发镀膜工艺(是现有的工艺，采用现有的真空镀膜设备进行)，在镀膜过程中，在传感区域的分布位置中的纤芯表面，从内向外依次蒸镀上预设厚度的粘接层6和金膜层5；
50.第三步，构造自组装分子层：将第三步获得的光纤(即已镀膜的光纤spr传感器)，依次用去离子水和无水乙醇冲洗预设时长(例如1-2min)，然后用氮气吹干，然后将洗净吹干的光纤浸泡在预设温度和预设浓度的经过热退火处理的含有dna适体的tris缓冲液中，持续预设时长，在传感区域中的金膜层表面，形成适体特异性识别层3，之后使用蒸馏水冲洗光纤预设时长，并浸泡在预设温度和预设浓度的6-巯基1-己醇溶液中，在传感区域中的金膜层表面，形成自组装分子层4。
51.需要说明的是，通过6-巯基1-己醇的巯基(mch)与金膜形成au-s键，通过6-巯基1-己醇(mch)另一端的烷基，具有明显的电荷屏蔽和疏水作用，从而可以降低干扰物质在金膜表面的非特异性吸附作用。
52.例如，将洗净吹干的光纤，在4℃下的含有100nm的dna适体、10mm的tris溶液中，浸泡12h，之后使用蒸馏水冲洗5min，然后，在4℃下的含有1mm(毫摩尔每升)的6-巯基1-己醇(mch)溶液中，浸泡2h。其中，m为物质的量浓度。
53.第四步，封装光纤spr传感器：首先，用刀片将第三步获得的光纤两端，分别剥去预设长度的包层101及涂覆层2，便于光纤伸出接头端面；然后将作为流体运输层8的硅橡胶管套在光纤传感区域上，然后在硅橡胶管两端插入作为流体运输管802的pvc管；然后，再将光纤的两端，分别接入sma连接器1(即光纤接头)，获得传感器成品。
54.具体操作上，可以将光纤中间部分放在半玻璃管上，并且使用硅橡胶管包裹住光纤和半玻璃管，将光纤的左右两端先后接入光纤接头，且使半玻璃管的两端恰好能卡在接头口处，同时光纤两端剥去包层的部分伸出在接头外端；之后在硅胶管与光纤的缝隙处插入pvc管，然后在硅胶管、光纤、运输管和sma接头的连接处涂一些环氧胶，最后将固定好的光纤接头插入手抛盘，在砂纸上反复打磨至端面平整。
55.在本发明中，基于上述本发明提供的基于适体变构效应的光纤spr传感器，参见图3，本发明还提供了一种光纤spr传感器的检测系统，具体包括前面所述的光纤spr传感器以及现有的反射光谱检测系统：
56.现有的反射光谱检测系统，包括光源、光谱仪和计算机；
57.光纤1000(spr传感器主体)两端的sma连接器1，分别与一个光源301的输出接口和一个光谱仪302的输入接口相连接；
58.光谱仪302的输出端，与计算机303相连接；
59.其中，光源，用于向光纤spr传感器主体的一端发出光束；
60.光谱仪302，用于将所述光纤spr传感器主体另一端所输出的发射光束，处理形成发射光谱，然后输出给计算机303。
61.在本发明中，具体实现上，光源301，可以为现有的卤钨灯光源。
62.如图3所示，为spr传感器的检测系统原理示意图，整个测量系统在光学平台上进
行，选用的光源301和光谱仪302的输出和输入接口均为sma型号，由光源301发射的光，经光纤spr传感器耦合后，输入到光谱仪302中，再通过光谱仪302输入计算机，然后通过计算机303上安装的、现有的基于软件动态链接库编写的光谱采集及数据处理软件sprectanalysis，来显示相应的光谱数据并储存，最后再利用现有的matlab软件，来对所采集的数据(即反射光谱)进行处理，得到此时光纤spr传感器主体1000中的传感区域中注入crp生物分子的共振波长。
63.具体操作上，基于图3所示的检测系统，首先将光谱仪302与计算机相连303，再将封装好的光纤两端的sma905连接器分别接到光谱仪302和光源301上，然后电脑上打开光谱分析软件sprectanalysis以备实时接收光谱数据。连接好光纤后，在未开光源时，先存储暗光谱，然后打开光源，调节光强到足够用于实验测量，但不超过光谱仪的测量范围，存储亮光谱，最后进行光谱归一化处理。
64.在得到归一化光谱后，首先缓慢地向半玻璃管中光纤的传感区域100注入去离子水，原本是归一化直线的光谱，此时出现了下凹的吸收峰，点击保存光谱数据，然后利用氮气枪，通过pvc管，将光纤表面的液滴吹干。其中，注意氮气枪的输出压力不宜太大，以免将传感器损坏。
65.为了更加清楚地理解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例，来说明本发明的检测方法。
66.实施案例
67.具体以检测炎症标志物crp生物分子为例，来说明本发明的检测原理。
68.对于crp，crp是一种急性期反应蛋白。crp为含有5个分子量为23kda亚基的多聚体；它的水平在正常个体中通常0.8mg/l-8mg/l，但在急性全身炎症时可升高100至200倍或更高。研究人员在各种临床环境中测量了crp和其他炎症标志物，并表明急性炎症反应综合征患者的crp水平很高，可用于预测这些患者的预后。与此同时，crp水平可预测表面健康的男性和女性未来的心血管风险。相关研究已经报道，crp水平可预测未来的心肌梗塞和中风。除此之外，crp水平可以用于预测心血管并发症，包括外周血管疾病。
69.基于上述本发明提供的基于适体变构效应的光纤spr传感器，本发明还提供了一种光纤spr传感器的crp检测方法，当需要检测crp生物分子的共振波长时，具体包括以下步骤：
70.第一步，将封装好的光纤spr传感器，依次用去离子水和无水乙醇冲洗，氮气吹干，然后向光纤spr传感器中的传感区域100注入tgk缓冲液，然后，根据光纤spr传感器输出的反射光谱，在反射光谱中得到传感区域100所对应的共振峰，并由此测量得到此时传感区域上的tgk缓冲液在反射光谱中所对应的共振波长(共振峰在反射光谱上对应的波长，即为共振波长)；
71.需要说明的是，在本发明中，tgk缓冲液，用于作为背景参照。
72.第二步，传感器表面的功能化：将热退火处理后的含有特异性dna适体(通过喷墨打印式高通量dna原位合成仪合成，具有序列表seq id no.1所示序列)的tris溶液，缓慢地注入传感器传感区域100表面，静置预设时长(例如12h)后，使用蒸馏水冲洗，然后用氮气吹干，再向传感区域100中的金膜层5表面注入tgk缓冲液，测量此时两个传感区域上的tgk缓冲液在反射光谱中对应的共振波长；
73.具体实现上，dna适体的碱基序列，如下表1所示。
74.表1 dna适体的碱基序列
[0075][0076]
其中，具体测量共振波长的方式，同第一步所述。
[0077]
第三步，将6-巯基1-己醇溶液，滴在传感区域100表面上，静置预设时长(例如1h)，以封闭传感区域表面多余的活性位点，然后用蒸馏水冲洗，接着用氮气吹干，然后滴入tgk缓冲液，测量此时传感区域100上的tgk缓冲液在反射光谱中对应的共振波长；
[0078]
其中，具体测量共振波长的方式，同第一步所述。
[0079]
需要说明的是，在本发明中，6-巯基1-己醇溶液可以封闭多余的活性位点，形成一层薄的非反应层，防止crp与位点的非特异性结合。
[0080]
第四步，将含有crp生物分子的tgk缓冲液，滴在、传感区域中的适体分子识别层3表面，静置预设时长(例如3min)，待dna-crp发生特异性结合后，记录crp生物分子在反射光谱中的共振波长。具体为：根据光纤spr传感器输出的反射光，传入到光谱仪302中可得到反射光谱，在反射光谱中得到crp生物分子所对应的共振峰，并由此可以计算得到生物分子此时在反射光谱中所对应的共振波长。
[0081]
在本发明中，第四步中，关于crp生物分子的tgk溶液，其中，crp生物分子的浓度，可以是已知的浓度，也可以是未知的待测浓度。无论两种不同的生物分子的浓度是否已知，都可以根据第四步，获得在反射光谱中所对应的共振波长。
[0082]
当然，对于本发明，如需检测其他任意生物分子的混合溶液，则需将前面检测方法中第二步中相应的dna适体序列做出相应更改。
[0083]
需要说明的是，在本发明中，前面所述的第一步至第四步的步骤中，每个步骤结束后都需要测量tgk缓冲液的共振波长。
[0084]
对于本发明，由于本发明实验中的分子特异性结合反应的背景环境是tgk缓冲液，因此在完成每一步修饰经冲洗、吹干后，都会滴入50μl的tgk缓冲液，并记录下每一次共振峰的位置。
[0085]
在理论上，每修饰完一步，传感器表面的折射率都会发生变化，所以每次测量tgk溶液得到的共振波长时也会发生相应的变化。例如功能化后，测量tgk溶液的共振峰没有变化，可以判定没有实现功能化。
[0086]
对于本发明，当crp生物分子吸附到适体特异性识别层3上时，由于适体特异性识别层3中的dna适体的折叠导致其水合层厚度变小，会引发明显的共振峰偏移。因此，基于核酸适体的构象变化在没有额外信号增强策略的情况下可以引起强烈的传感器响应。
[0087]
对于本发明，光纤spr传感器能够实现crp生物分子的检测，极大提高了spr传感器的检测效率，拥有体积小、灵敏度高、无毒无污染的优点。
[0088]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明结构的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的结构改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。