高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法

1.本发明涉及骨胶原蛋白肽制备技术领域。更具体地说，本发明涉及一种高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法。


背景技术：

2.骨胶原蛋白是世界上最丰富的食物来源胶原蛋白之一，主要来源于动物骨骼。它具有很高的营养价值，可以促进生理健康。目前，骨胶原蛋白广泛应用于组织工程、食品包装、化妆品等领域。随着人们对改善骨胶原蛋白功能特性的不断研究，从骨胶原蛋白中提取的生物肽引起了人们的广泛关注。研究表明，骨胶原蛋白肽作为一种天然抗氧化剂，可以在不同的食物体系中防止脂质氧化。
3.畜禽骨副产物进行蛋白质资源的深加工过程中，如何进一步提高骨胶原蛋白肽的抗氧化活性，有很高的开发价值和应用前景，同时能提高牛骨、猪骨和鸡骨等畜禽骨的附加值，为牛、猪和鸡等动物及其下脚料资源的利用开辟了新的途径，具有广阔的市场前景。


技术实现要素：

4.本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
5.本发明还有一个目的是提供一种高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，制备得到具有良好的体外与体内抗氧化性，安全无毒的畜禽骨胶原蛋白肽，且整体工艺简单。
6.为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
7.向畜禽骨胶原蛋白液中以酶比活为5000u/g加入胰蛋白酶进行水解，得水解液，水解液经灭酶、离心、干燥得骨胶原蛋白肽；
8.对骨胶原蛋白肽进行稀释得骨胶原蛋白肽溶液，并将d-半乳糖溶解在骨胶原蛋白肽溶液中得反应液，将反应液的初始ph值调整为8.8-9.2后在93-98℃水浴中加热4.5-5.5h，冷却后离心得上清液，上清液冻干即得n端修饰的骨胶原蛋白肽，其中，d-半乳糖与骨胶原蛋白肽的质量比为1：1。
9.优选的是：畜禽骨胶原蛋白液中畜禽骨胶原蛋白和水的质量体积比为5g/1l。
10.优选的是：水解液经灭酶、离心、干燥得骨胶原蛋白肽具体为：将水解液置于95℃恒温水浴中加热10-12min灭酶，4℃、8000
×
g离心20-25min得上清液，上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20℃，得骨胶原蛋白肽。
11.优选的是：使用6m naoh调整反应液的初始ph值。
12.优选的是：畜禽骨胶原蛋白液中畜禽骨胶原蛋白的制备方法包括畜禽骨经破碎、脱脂、脱除钙盐、加酶控温酶解、盐析、透析后冷冻干燥得畜禽骨胶原蛋白。
13.优选的是：脱脂具体为：畜禽骨经破碎后，加入5-6倍体积的0.1m的naoh溶液，搅拌8-10h，得naoh溶液处理的畜禽骨渣，其中，每隔2h更换一次naoh溶液；
14.naoh溶液处理的畜禽骨渣经蒸馏水洗至中性后沥干，再加入5倍体积的10％的正
己烷搅拌12-14h，得正己烷处理的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次正己烷溶液。
15.优选的是：脱除钙盐具体为：正己烷处理的畜禽骨渣经蒸馏水反复水洗至中性后沥干，然后加入5-6倍体积的0.25m的edta-na2溶液搅拌12-14h脱除钙盐，得脱除钙盐后的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次edta-na2溶液。
16.优选的是：加酶控温酶解具体为：
17.脱除钙盐后的畜禽骨渣经蒸馏水反复洗涤后沥干，再加入5-6倍体积的0.5m乙酸溶液和1.6％倍脱除钙盐后的畜禽骨渣质量的胃蛋白酶搅拌提取24-28h，双层纱布过滤得畜禽骨粗胶原蛋白滤液和滤渣，其中，间隔12h更换依次乙酸和胃蛋白酶；
18.滤渣经乙酸重复提取两次，过滤得乙酸滤液，合并畜禽骨粗胶原蛋白滤液和乙酸滤液，得提取液。
19.优选的是：盐析、透析后冷冻干燥得畜禽骨胶原蛋白具体为：
20.向提取液中加入nacl调至其终浓度0.9m、tris至其终浓度为0.05m，调溶液ph＝7.0，搅拌析出絮状沉淀后经4℃、10000
×
g离心20-22min收集沉淀，得盐析后的畜禽骨粗胶原蛋白；
21.将盐析后的畜禽粗胶原蛋白溶解于0.5m乙酸溶液，依次分别采用0.1mol/l的乙酸和超纯水各透析24-25h，期间乙酸和超纯水各3次，透析后的产品置于冷冻干燥机，于-20℃冷冻干燥，即得干燥后的畜禽骨胶原蛋白。
22.本发明至少包括以下有益效果：
23.第一、在畜禽骨胶原蛋白制备过程中，通过naoh前处理配合正己烷处理实现有效脱脂进一步配合脱除钙盐、加酶控温酶解、盐析、透析获得畜禽骨胶原蛋白；
24.第二、通过胰蛋白酶的选取，有效控制蛋白的降解程度，得到具有高效n端修饰反应活性的畜禽骨胶原蛋白肽；
25.第三、通过畜禽骨胶原蛋白肽与单糖(还原糖)混合进行n端修饰，制备出的n端修饰的畜禽骨胶原蛋白肽具有良好的体外与体内抗氧化性，安全无毒、工艺简单且价格低廉；
26.第四、本发明为畜禽动物及其下脚料的应用提供了一条新思路，为开发安全、健康和天然的功能性食品提供了理论依据和技术支持。
27.本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
28.图1为模拟胰蛋白酶对鸡骨胶原蛋白α-1链的酶切位点图；
29.图2为模拟胰蛋白酶对鸡骨胶原蛋白α-2链的酶切位点图；
30.图3为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的ft-ir光谱图；
31.图4为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的分子量分布图；
32.图5为本发明的其中一种技术方案所述dpph自由基清除法测骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的抗氧化活性柱状图；
33.图6为本发明的其中一种技术方案所述abts自由基清除法测骨胶原蛋白肽和n端
修饰的骨胶原蛋白肽的抗氧化活性柱状图；
34.图7为本发明的其中一种技术方案所述羟基自由基清除法测骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的抗氧化活性柱状图；
35.图8为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的荧光显微镜图；
36.图9为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的ros清除能力柱状图；
37.图10为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的细胞毒性结果图；
38.图11为本发明的其中一种技术方案所述骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的细胞毒性结果图。
具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
40.《实施例1》
41.高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
42.s1、畜禽骨胶原蛋白制备：
43.牛骨经破碎后，加入5倍体积的0.1m的naoh溶液(v/w，ml/g)，搅拌8h，得naoh溶液处理的畜禽骨渣，其中，每隔2h更换一次naoh溶液，0.1m为0.1mol/l；
44.naoh溶液处理的畜禽骨渣经蒸馏水洗至中性后沥干，再加入5倍体积(v/w)的10％的正己烷(体积分数)搅拌12h，得正己烷处理的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次正己烷溶液；
45.正己烷处理的畜禽骨渣经蒸馏水反复水洗至中性后沥干，然后加入5倍体积(v/w)的0.25m的edta-na2(乙二胺四乙酸二钠)溶液搅拌12h脱除钙盐，得脱除钙盐后的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次edta-na2溶液；
46.脱除钙盐后的畜禽骨渣经蒸馏水反复洗涤后沥干，再加入5倍体积(v/w)的0.5m乙酸溶液和1.6％倍畜禽骨质量(w/w)的胃蛋白酶(ec number 3.4.23.1，1200u/mg)搅拌提取24h，双层纱布过滤得畜禽骨粗胶原蛋白滤液和滤渣，其中，间隔12h更换依次乙酸和胃蛋白酶；
47.滤渣经乙酸重复提取两次，过滤得乙酸滤液，合并畜禽骨粗胶原蛋白滤液和乙酸滤液，得提取液；
48.向提取液中加入nacl调至其终浓度0.9m、tris(三羟甲基氨基甲烷)至其终浓度为0.05m，调溶液ph＝7.0，搅拌析出絮状沉淀后经4℃、10000
×
g离心20min收集沉淀，得盐析后的畜禽骨粗胶原蛋白；
49.将盐析后的畜禽粗胶原蛋白溶解于0.5m乙酸溶液，依次分别采用0.1mol/l的乙酸和超纯水各透析24h，期间乙酸和超纯水各3次(即每隔8h换液一次)，透析后的产品置于冷冻干燥机，于-20℃冷冻干燥，即得干燥后的畜禽骨胶原蛋白；
50.s2、畜禽骨胶原蛋白肽制备：
51.称取5.0g干燥后的畜禽骨胶原蛋白于2l的烧杯中，加入1000ml水均质搅拌配置成0.5％(w/v)的畜禽骨胶原蛋白液，将畜禽骨胶原蛋白液的ph和温度分别调整至胰蛋白酶最适条件(温度：37℃ph＝8)，以酶比活为5000u/g(酶/畜禽骨胶原蛋白)的比例加入酶解液，畜禽骨胶原蛋白水解结束，将水解液置于95℃恒温水浴中加热10min灭酶，4℃、8000
×
g离心20min，上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20℃，得骨胶原蛋白肽；
52.s3、n端修饰的骨胶原蛋白肽的制备：
53.对骨胶原蛋白肽进行稀释得骨胶原蛋白肽溶液(25mg骨胶原蛋白肽/ml骨胶原蛋白肽溶液)，并将d-半乳糖以1：1的比例溶解在骨胶原蛋白肽溶液中得反应液，使用6mol/lnaoh将反应液的初始ph值调整为9.0，将反应液在95℃水浴中加热5h，冷却混合物，以8000
×
g离心20min，上清液冻干即得n端修饰的骨胶原蛋白肽。
54.《实施例2》
55.高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
56.s1-s3同实施例1，不同的是，处理的为猪骨。
57.《实施例3》
58.高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
59.s1-s3同实施例1，不同的是，处理的为鸡骨。
60.《实施例4》
61.高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
62.s1、畜禽骨胶原蛋白制备：
63.牛骨经破碎后，加入6倍体积的0.1m的naoh溶液(v/w，ml/g)，搅拌10h，得naoh溶液处理的畜禽骨渣，其中，每隔2h更换一次naoh溶液，0.1m为0.1mol/l；
64.naoh溶液处理的畜禽骨渣经蒸馏水洗至中性后沥干，再加入5倍体积(v/w)的10％的正己烷(体积分数)搅拌13h，得正己烷处理的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次正己烷溶液；
65.正己烷处理的畜禽骨渣经蒸馏水反复水洗至中性后沥干，然后加入6倍体积(v/w)的0.25m的edta-na2(乙二胺四乙酸二钠)溶液搅拌13h脱除钙盐，得脱除钙盐后的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次edta-na2溶液；
66.脱除钙盐后的畜禽骨渣经蒸馏水反复洗涤后沥干，再加入5倍体积(v/w)的0.5m乙酸溶液和1.6％倍畜禽骨质量(w/w)的胃蛋白酶(ec number 3.4.23.1，1200u/mg)搅拌提取28h，双层纱布过滤得畜禽骨粗胶原蛋白滤液和滤渣，其中，间隔12h更换依次乙酸和胃蛋白酶；
67.滤渣经乙酸重复提取两次，过滤得乙酸滤液，合并畜禽骨粗胶原蛋白滤液和乙酸滤液，得提取液；
68.向提取液中加入nacl调至其终浓度0.9m、tris(三羟甲基氨基甲烷)至其终浓度为0.05m，调溶液ph＝7.0，搅拌析出絮状沉淀后经4℃、10000
×
g离心20min收集沉淀，得盐析后的畜禽骨粗胶原蛋白；
69.将盐析后的畜禽粗胶原蛋白溶解于0.5m乙酸溶液，依次分别采用0.1mol/l的乙酸和超纯水各透析25h，期间乙酸和超纯水各3次(即每隔8h换液一次)，透析后的产品置于冷冻干燥机，于-20℃冷冻干燥，即得干燥后的畜禽骨胶原蛋白；
70.s2、畜禽骨胶原蛋白肽制备：
71.称取5.0g干燥后的畜禽骨胶原蛋白于2l的烧杯中，加入1000ml水均质搅拌配置成0.5％(w/v)的畜禽骨胶原蛋白液，将畜禽骨胶原蛋白液的ph和温度分别调整至胰蛋白酶最适条件，以酶比活为5000u/g(酶/畜禽骨胶原蛋白)的比例加入酶解液，畜禽骨胶原蛋白水解结束，将水解液置于95℃恒温水浴中加热12min灭酶，4℃、8000
×
g离心25min，上清液经冷冻干燥机冻干后保存于-20℃，得骨胶原蛋白肽；
72.s3、n端修饰的骨胶原蛋白肽的制备：
73.对骨胶原蛋白肽进行稀释得骨胶原蛋白肽溶液(25mg骨胶原蛋白肽/ml骨胶原蛋白肽溶液)，并将d-半乳糖以1：1的比例溶解在骨胶原蛋白肽溶液中得反应液，使用6mol/lnaoh将反应液的初始ph值调整为8.9，将反应液在98℃水浴中加热4.5h，冷却混合物，以8000
×
g离心20min，上清液冻干即得n端修饰的骨胶原蛋白肽
74.《实施例5》
75.高抗氧化活性骨胶原蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
76.s1、畜禽骨胶原蛋白制备：
77.牛骨经破碎后，加入5倍体积的0.1m的naoh溶液(v/w，ml/g)，搅拌9h，得naoh溶液处理的畜禽骨渣，其中，每隔2h更换一次naoh溶液，0.1m为0.1mol/l；
78.naoh溶液处理的畜禽骨渣经蒸馏水洗至中性后沥干，再加入5倍体积(v/w)的10％的正己烷(体积分数)搅拌14h，得正己烷处理的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次正己烷溶液；
79.正己烷处理的畜禽骨渣经蒸馏水反复水洗至中性后沥干，然后加入5倍体积(v/w)的0.25m的edta-na2(乙二胺四乙酸二钠)溶液搅拌14h脱除钙盐，得脱除钙盐后的畜禽骨渣，其中，每隔4h更换一次edta-na2溶液；
80.脱除钙盐后的畜禽骨渣经蒸馏水反复洗涤后沥干，再加入6倍体积(v/w)的0.5m乙酸溶液和1.6％倍畜禽骨质量(w/w)的胃蛋白酶(ec number 3.4.23.1，1200u/mg)搅拌提取26h，双层纱布过滤得畜禽骨粗胶原蛋白滤液和滤渣，其中，间隔12h更换依次乙酸和胃蛋白酶；
81.滤渣经乙酸重复提取两次，过滤得乙酸滤液，合并畜禽骨粗胶原蛋白滤液和乙酸滤液，得提取液；
82.向提取液中加入nacl调至其终浓度0.9m、tris(三羟甲基氨基甲烷)至其终浓度为0.05m，调溶液ph＝7.0，搅拌析出絮状沉淀后经4℃、10000
×
g离心20min收集沉淀，得盐析后的畜禽骨粗胶原蛋白；
83.将盐析后的畜禽粗胶原蛋白溶解于0.5m乙酸溶液，依次分别采用0.1mol/l的乙酸和超纯水各透析24h，期间乙酸和超纯水各3次(即每隔8h换液一次)，透析后的产品置于冷冻干燥机，于-20℃冷冻干燥，即得干燥后的畜禽骨胶原蛋白；
84.s2、畜禽骨胶原蛋白肽制备：
85.称取5.0g干燥后的畜禽骨胶原蛋白于2l的烧杯中，加入1000ml水均质搅拌配置成0.5％(w/v)的畜禽骨胶原蛋白液，将畜禽骨胶原蛋白液的ph和温度分别调整至胰蛋白酶最适条件，以酶比活为5000u/g(酶/畜禽骨胶原蛋白)的比例加入酶解液，畜禽骨胶原蛋白水解结束，将水解液置于95℃恒温水浴中加热11min灭酶，4℃、8000
×
g离心22min，上清液经
冷冻干燥机冻干后保存于-20℃，得骨胶原蛋白肽；
86.s3、n端修饰的骨胶原蛋白肽的制备：
87.对骨胶原蛋白肽进行稀释得骨胶原蛋白肽溶液(25mg骨胶原蛋白肽/ml骨胶原蛋白肽溶液)，并将d-半乳糖以1：1的比例溶解在骨胶原蛋白肽溶液中得反应液，使用6mol/lnaoh将反应液的初始ph值调整为9.2，将反应液在93℃水浴中加热5.5h，冷却混合物，以8000
×
g离心20min，上清液冻干即得n端修饰的骨胶原蛋白肽
88.实验1
89.1.1、取实施例1-3对应的步骤s1获得的畜禽骨胶原蛋白，测定其成分，具体如下表1所示：
90.表1实施例1-3的畜禽骨胶原蛋白成分测定
91.成分实施例1实施例2实施例3水分％4.124.174.08胶原蛋白％85.3286.7683.79脂肪％0.320.220.35灰分％5.324.973.93碳水化合物％4.014.237.19
92.注：上述表格各成分单独由仪器测定获得。
93.由表1可知，在畜禽骨胶原蛋白制备过程中，通过naoh前处理配合正己烷处理实现有效脱脂，获得骨胶原蛋白中脂肪含量不高于0.35％；进一步配合脱除钙盐、加酶控温酶解、盐析、透析，有效的去除非胶原蛋白成分，获得畜禽骨胶原蛋白纯度较高，其中，胶原蛋白含量不低于83.79％。
94.1.2计算实施例1-3对应的步骤s1获得的畜禽骨胶原蛋白的产率(湿重)％，其中，产率(湿重)％＝(畜禽骨胶原蛋白重/骨料重)*100％，具体结果如下表2所示：
95.表2实施例1-3畜禽骨胶原蛋白的产率(湿重)％统计
[0096] 实施例1实施例2实施例3产率(湿重)％5.344.993.97
[0097]
由表1可知，在畜禽骨胶原蛋白制备过程中，畜禽骨胶原蛋白的产率不低于3.97％。
[0098]
实验2
[0099]
通过模拟酶切软件对骨胶原蛋白进行模拟酶解，可知畜禽骨胶原蛋白，相对于胰蛋白酶酶解位点较多，且末端碱性氨基酸较多，有利于n端修饰，活性更高，即通过胰蛋白酶的选取，有效控制蛋白的降解程度，进一步得到具有高效n端修饰反应活性的畜禽骨胶原蛋白肽；其中，关于鸡骨胶原蛋白的模拟结果如图1-2所示，其中，图1为模拟胰蛋白酶对鸡骨胶原蛋白α-1链(collagen alpha-1(i)chain)的酶切位点(cleavage site)图，图2为模拟胰蛋白酶对鸡骨胶原蛋白α-2链(collagen alpha-2(i)chain)的酶切位点图。
[0100]
实验3：ft-ir是一种重要的分析方法，广泛用于分析复杂化合物的化学成分以及蛋白质和水解物的二级结构。采用ft-ir红外光谱技术，分析获得实施例1-3获得的骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的ft-ir光谱，如图3所示，图3中由下至上的6条光谱线分别对应鸡骨胶原蛋白肽(图上简称鸡骨肽)、猪骨胶原蛋白肽(图上简称猪骨肽)、牛骨胶原
蛋白肽(图上简称牛骨肽)、n端修饰的鸡骨胶原蛋白肽(图上简称修饰的鸡骨肽)、n端修饰的猪骨胶原蛋白肽(图上简称修饰的猪骨肽)、n端修饰的牛骨胶原蛋白肽(图上简称修饰的牛骨肽)。
[0101]
依据图3可知：
①
骨胶原蛋白肽的ft-ir在3500-3200cm-1
处显示出宽峰，n端修饰后，糖基化水解物在3500-3200cm-1
处的红外光谱的宽峰强度变弱，这可能是由于引入半乳糖后游离羟基的拉伸振动。
②
ft-ir光谱在1676cm-1
和1539cm-1
处的吸收峰是由c＝o拉伸振动(1680-1630cm-1
)和n-h弯曲振动(1655-1540cm-1
)，与骨胶原蛋白肽相比，n端修饰的骨胶原蛋白肽在该两个吸收峰处的强度略有下降，这可能是由于氨基和羰基在反应过程中聚合形成大分子化合物，导致吸收减少。
③
酰胺iii带(1450-1240cm-1
)主要由c-n拉伸和n-h变化引起，n端修饰的骨胶原蛋白肽在1393cm-1
处的吸收峰弱于骨胶原蛋白肽的吸收峰，这可能是由o-h面内变形振动引起的。
④
与骨胶原蛋白肽相比，n端修饰的肽在1137-938cm-1范围内表现出更强的吸收峰，表明半乳糖附着在骨胶原蛋白肽的骨架上，导致肽结构的部分变化。此外，与骨胶原蛋白肽相比，n端修饰的肽在660.03cm处的吸收较弱，这意味着在反应过程中消耗了氨基，导致n-h弯曲振动的减少。
[0102]
实验4：骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的分子量分布如图4所示，其中，bbcp表示猪骨胶原蛋白肽，简称猪骨肽；pbcp表示牛骨胶原蛋白肽，简称牛骨肽；cbcp表示鸡骨胶原蛋白肽，简称鸡骨肽；g-cbcp表示n端修饰的鸡骨胶原蛋白肽，简称修饰的鸡骨肽；g-pbcp表示n端修饰的牛骨胶原蛋白肽，简称修饰的牛骨肽；g-bbcp表示n端修饰的猪骨胶原蛋白肽，简称修饰的猪骨肽。
[0103]
由图4可知，bbcp的分子量大于pbcp，pbcp的分子量大于cbcp，因此，bbcp可能含有比cbcp和pbcp更复杂或更多的二级结构，这将通过空间位阻效应影响游离氨基的反应活性，cbcp具有较小的分子量，可以促进n端修饰活性，即cbcp在三种水解物中显示出最高的活性。
[0104]
n端修饰的骨胶原蛋白肽(g-cbcp，g-pbcp，g-bbcp)的分子量高于相应修饰前骨胶原蛋白肽(cbcp，pbcp，bbcp)的分子量，说明骨胶原蛋白肽在修饰反应过程中与半乳糖交联形成了偶联物，大大增加分子量。
[0105]
实验5：分别采用dpph自由基清除法、abts自由基清除法、羟基自由基清除法评价骨胶原蛋白肽和n端修饰的骨胶原蛋白肽的抗氧化活动，如下表3-8所述：
[0106]
表3dpph自由基清除法测不同浓度下骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0107][0108]
表4dpph自由基清除法测不同浓度下n端修饰的骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0109][0110]
表5abts自由基清除法测不同浓度下骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0111][0112]
表6abts自由基清除法测不同浓度下n端修饰的骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0113][0114]
表7羟基自由基清除法测不同浓度下骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0115][0116]
表8羟基自由基清除法测不同浓度下n端修饰的骨胶原蛋白肽的清除率统计表
[0117][0118][0119]
注：表3-4的数据对应图5，表5-6的数据对应图6，表7-8的数据对应图7，如图5-7所示可知，在浓度范围为3至15mg/ml(dpph自由基清除法、abts自由基清除法)、0.1至4mg/ml(羟基自由基清除法)时，随着浓度的增加所有6个样本的dpph、abts及羟基自由基清除活性均显著增加(p《0.05)。
[0120]
n端修饰的骨胶原蛋白肽(g-cbcp，g-pbcp，g-bbcp)的dpph，abts和羟基自由基清除活性显著高于对应的骨胶原蛋白肽(cbcp，pbcp，bbcp)。
[0121]
此外，g-cbcp的dpph、abts和羟基自由基清除活性最强，其次依次是g-pbcp和g-bbcp。因此，与骨胶原蛋白肽相比，三种n端修饰的骨胶原蛋白肽表现出显着的特征和结构变化以及更高的抗氧化活性。
[0122]
实验6：ros是一种不稳定的分子，具有高活性和短半衰期。研究表明，抗氧化剂可以通过激活细胞中的抗氧化酶直接或间接清除ros。设置对照组、过氧化氢处理组、实施例1-3对应的实验组，分别使用荧光显微镜定性地观察每组的ros变化，其中，对照组不经任何处理，过氧化氢处理组采用过氧化氢处理，实施例1-3对应的实验组分别采用不同浓度n端修饰的骨胶原蛋白肽(1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml)进行处理，荧光显微镜观察结果如图8-9所示，具体的：
[0123]
对照组细胞几乎没有绿色荧光(图8第1行第1列图片)；
[0124]
过氧化氢处理组的细胞表现出最强的绿色荧光强度(图8第2行第1列图片)，表明
过氧化氢诱导了过量的ros产生；
[0125]
在实验组中，绿色荧光强度、ros水平随着n端修饰的骨胶原蛋白肽浓度的增加而显着降低(p《0.05)。此外，g-cbcp对应的实验组荧光强度最弱、ros水平最低，表明g-cbcp的ros清除能力最强，其次是g-pbcp和g-bbcp。
[0126]
实验7：流式细胞术用于定量测定三种n端修饰的骨胶原蛋白肽的潜在细胞毒性。三种n端修饰的骨胶原蛋白肽的潜在细胞毒性结果如图10-11所示，其中：a为空白处理，就是没有加n端修饰的骨胶原蛋白肽，b是加了不同来源、不同浓度的n端修饰的骨胶原蛋白肽。
[0127]
依据图10-11可知：对照组正常活细胞达到95.18％。
[0128]
在g-cbcp处理组中，正常活细胞分别占96.07％、94.50％和92.44％，浓度为0.5～2mg/ml。
[0129]
在g-pbcp处理组中，正常活细胞分别占95.19％，93.01％和89.65％，浓度为0.5-2mg/ml。
[0130]
在g-bbcp处理组中，正常活细胞分别占91.67％、91.02％和92.06％，浓度为0.5～2mg/ml。
[0131]
与对照组相比，6组样品在48h时均未显著抑制0.5～2.0mg/ml的细胞活性，表明3种n端修饰的骨胶原蛋白肽无明显毒性，因此，三种n端修饰的骨胶原蛋白肽可以作为天然抗氧化剂安全地应用于食品中。
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尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。