捕蝇草组培快速育苗方法及应用

1.本发明涉及食虫植物培养技术领域，具体是一种捕蝇草组培快速育苗方法及应用。


背景技术：

2.捕蝇草(dionaea muscipula)又名苍蝇夹，苍蝇的地狱等，为茅膏菜科捕蝇草属多年生草本植物，亦是捕蝇草属唯一的种，原产于美国南卡罗莱纳州东北部、北卡罗莱纳州东南部以及新泽西州和弗吉尼亚州等地，主要生长于半稀树草原的沼泽、湿地周围，该环境下土质多为泥炭土及硅砂。捕蝇草为最有趣味性的食虫植物，其叶片进化为夹子状捕虫器，可通过释放挥发性有机化合物吸引昆虫，当猎物爬过时多次触碰到夹子内的小刺，夹子即可产生动作电位并迅速关闭夹子，同时，昆虫在夹子内反复摆动，促使夹子分泌消化液，最终“吃”掉昆虫。早在1875年，达尔文便在其专著《insectivorous plants》中描述了捕蝇草的捕食现象,并称之为世界上最奇妙的植物。
3.随着科技的进步，对捕蝇草的研究不仅限于其观赏性及趣味性，21世纪，各国科学家研究了其捕虫机理，根据仿生学发明了捕蝇草仿生机器人、人工肌肉仿生结构的机翼、可编程复合材料、光驱动人工捕蝇器、基于吸湿电纺纳米纤维的双稳态软激发结构等。同时，捕蝇草内次生代谢产物白花丹醌及其衍生物、香草酸、槲皮素等的分离提纯，捕蝇草的药用价值也在逐步开发。
4.根据捕蝇草叶片、夹子等形态，将捕蝇草分别命名为大嘴、三头犬、蜘蛛、花市、鲨鱼等百余品系，由于其独特的观赏性和趣味性，捕蝇草被世界各国引种栽培。21世纪初，我国逐步开始引进捕蝇草的种植，目前主要集中于浙江、广东、北京、山东、云南、四川等省市栽培。
5.最初我国引种时捕蝇草主要以叶片进行扦插繁殖获得种苗，栽植一段时间后开始结籽，种子繁殖亦成为捕蝇草种苗的繁殖方法，但经过年多次的种子繁殖研究，种子繁殖极易出现“返祖”的情况，因此，后期在捕蝇草市场化栽培中，叶插还是作为捕蝇草种苗的主要繁殖方式。
6.随着科技的进步，利用现代生物组培技术，亦成为捕蝇草种苗来源的重要方式，但捕蝇草种类极多，且更新较快，捕蝇草需不停的进行新品种的组培初代诱导，而捕蝇草组培初代诱导时，在消毒环节极其难，一般单品种开展时，需经过一年甚至更长周期的初代培养。同时，现有捕蝇草组培技术还存在培养过程中叶片色泽变红，培养周期长，苗培养过程中极易产生僵苗等情况。


技术实现要素：

7.本发明针对现有技术的不足，发明了一种消毒污染率及消毒死亡率低、培养周期短、苗健壮、不会出现僵苗的捕蝇草组培繁育方法。
8.为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种捕蝇草组培快速育苗方法，步骤
包括：
9.1.外植体清洁：选取健康无病虫害的捕蝇草叶片作为外植体，用软毛刷蘸取饱和肥皂液反复轻刷叶片表面6～8次，并用自来水洗净表面肥皂液，后滴加2～3滴吐温-80，浸泡30～40min，再用自来水冲淋60～70min；
10.2.外植体消毒：洗净的外植体转移至超净工作台，依次用75％(v/v)酒精消毒10～15s，无菌水涮洗2～3次，4％双氧水溶液消毒6～7min，无菌水涮洗2～3次，后在超声波清洗机中，将超声波调至25～30khz，用0.4％新洁尔灭溶液超声消毒2～3min，用无菌水涮洗3～4次，后继续在超声波清洗机中用0.02％升汞溶液超声消毒1～2min，无菌水涮洗6～8次；
11.3.丛生芽诱导：消毒好丛生芽接种在以1/4ms naa 0.1～0.2mg/l tdz 1.0～1.5mg/l zt 0.3～0.5mg/l 活性炭1.0～1.2g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养培养15～20天，待丛生芽萌发后，温度调整至25
±
2℃继续暗培养10～15天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照2000～3000lux光12h进行光暗交替培养30～40天；
12.4.丛生芽增殖：诱导出丛生芽切成单芽，同时剪下叶片，分别将单芽和叶片接种在改良n6 naa 0.5～0.6mg/l tdz 0.5～0.6mg/l kt 2.0～2.5mg/l ch 20～30mg/l 椰乳60～80mg/l 酵母粉20～30mg/l 活性炭0.3～0.4g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养5～10天，待丛生芽萌发后，温度调整至25
±
2℃继续暗培养5～10天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照2000～3000lux光12h进行光暗交替培养20～30天；
13.5.丛生芽生根：增殖丛生芽切成单芽，接种在改良n6 naa 0.2～0.4mg/l iba 0.8～1.2mg/l ch 50～80mg/l 茉莉酸甲酯0.3～0.4mg/l 椰乳60～80mg/l 活性炭0.5～0.6g/l，在温度25
±
2℃，每日照3000～4000lux光14h培养15～20天，开始生根后置于遮阴率75～85％的日光下培养10～15天。
14.发明中，上述改良n6培养基为在原n6培养基的基础上，将硝酸钾改为880mg/l，硫酸二氢钾改为120mg/l，硫酸铵改为360mg/l，硫酸镁改为35mg/l，氯化钙改为25mg/l。
15.本发明的有益技术效果是：
16.1.本发明在外植体消毒时，采用了酒精，双氧水溶液，新洁尔灭溶液消，升汞溶液四种消毒剂的复合消毒方法，不论是消毒浓度还是消毒时间，较组培时的常规消毒方法相对较低，同时在升汞溶液消毒时，还配合使用了超声波，使在减少对外植体伤害的前提下尽可能的降低消毒污染率。本发明的消毒污染率为47％，消毒死亡率为57％，是目前捕蝇草初代培养最佳的消毒方法。
17.2.本发明在增殖培养时，采用一定浓度的naa、kt及tdz的搭配组合，能使捕蝇草叶片产生大量丛生苗，且产生丛生芽的周期短。同时在增殖培养基中添加了一定浓度的ch、椰乳及酵母粉，可为捕蝇草丛生芽的生长提供优质、适宜的有机养分，促使丛生芽在短期内迅速生长，一方面缩短了培养周期，另一方面丛生苗叶片的迅速展开，可促使叶片可以更多的用于继续扩繁，从而增加了增殖系数。
18.3.本发明在生根培养时，采用了一定浓度的naa和iba的搭配组合，可使生根率达100％，同时，在生根培养基中继续添加了一定浓度的水解酪蛋白(ch)及椰乳而去掉增殖时的酵母粉，能最大程度的使生根苗快速生长的同时，还能防治生根过程中玻璃化的发生，同时，在生根培养基中添加一定浓度的茉莉酸甲酯，亦能在很大程度的防治玻璃化的发生，还能促使在瓶苗阶段大量夹子的产生，从而有利于缩短驯化时的成苗周期。
19.4.捕蝇草不同于现有常规植物，由于其长期生长在土壤贫瘠的地方，使得其可通过进化的夹子获得更多的营养，亦使得捕蝇草对各元素极其敏感。而利用现有的基本培养基进行捕蝇草组培培养时，均会出现大量的僵苗、红苗、枯稍等不利于捕蝇草生长的情况发生，本发明在增殖及生根时，均采用了改良n6培养基，对氮、磷、钾、钙、镁等元素进行了调整，能有效减少甚至避免捕蝇草在培养过程中的红苗、僵苗、枯稍等现象，从而降低了捕蝇草的生产成本。
20.5.在捕蝇草增殖培养时，在培养初期进行高温无光培养，有利于从叶片快速诱导出大量丛生芽，在中期降低温度至适温，继续无光培养，可使丛生芽叶片迅速展开，从而增加增殖系数，而在后期进行适温，光暗交替培养，使丛生苗能更加健壮，一方面提高了可利用叶片数量，另一方面有利于生根时苗的健壮。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例1
23.一种捕蝇草组培快速育苗方法，步骤包括：
24.1.外植体清洁：选取健康无病虫害的捕蝇草叶片作为外植体，用软毛刷蘸取饱和肥皂液反复轻刷叶片表面6次，并用自来水洗净表面肥皂液，后滴加2滴吐温-80，浸泡30min，再用自来水冲淋60min。
25.2.外植体消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，依次用75％(v/v)酒精消毒10s，无菌水涮洗2次，4％双氧水溶液消毒6min，无菌水涮洗2次，后在超声波清洗机中，将超声波调至25khz，用0.4％新洁尔灭溶液超声消毒3min，用无菌水涮洗3次，后继续在超声波清洗机中用0.02％升汞溶液超声消毒2min，无菌水涮洗8次。
26.3.丛生芽诱导：将消毒好的丛生芽，接种在以1/4ms naa 0.1mg/l tdz 1.0mg/l zt 0.3mg/l 活性炭1.0g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养15天，待丛生芽萌发后，将温度调整至25
±
2℃继续暗培养15天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照2000lux光12h进行光暗交替培养40天。
27.4.丛生芽增殖：诱导出的丛生芽切成单芽，同时剪下叶片，分别将单芽和叶片接种在改良n6 naa 0.5mg/l tdz 0.5mg/l kt 2.0mg/l ch 20mg/l 椰乳60mg/l 酵母粉20mg/l 活性炭0.3g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养10天，待丛生芽萌发后，将温度调整至25
±
2℃继续暗培养10天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照2000lux光12h进行光暗交替培养25天。
28.5.丛生芽生根：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在改良n6 naa 0.2mg/l iba 0.8mg/l ch 50mg/l 茉莉酸甲酯0.3mg/l 椰乳60mg/l 活性炭0.5g/l，在温度25
±
2℃，每日照3000lux光14h培养20天，开始生根后置于遮阴率75％的日光下培养10天。
29.6.将生根苗出瓶后，洗净基部培养基，移栽于水苔中，在遮阳率为75％的环境下驯化，前20天保持小环境空气湿度为100％，后逐步降低空气湿度，驯化期间保持水苔湿度在
65％。
30.其中，上述改良n6培养基为在原n6培养基的基础上，将硝酸钾改为880mg/l，硫酸二氢钾改为120mg/l，硫酸铵改为360mg/l，硫酸镁改为35mg/l，氯化钙改为25mg/l。
31.实施例2
32.一种捕蝇草组培快速育苗方法，步骤包括：
33.1.外植体清洁：选取健康无病虫害的捕蝇草叶片作为外植体，用软毛刷蘸取饱和肥皂液反复轻刷叶片表面8次，并用自来水洗净表面肥皂液，后滴加3滴吐温-80，浸泡40min，再用自来水冲淋70min。
34.2.外植体消毒：将洗净的外植体转移至超净工作台，依次用75％(v/v)酒精消毒15s，无菌水涮洗3次，4％双氧水溶液消毒7min，无菌水涮洗3次，后在超声波清洗机中，将超声波调至30khz，用0.4％新洁尔灭溶液超声消毒2min，用无菌水涮洗4次，后继续在超声波清洗机中用0.02％升汞溶液超声消毒1min，无菌水涮洗8次。
35.3.丛生芽诱导：将消毒好的丛生芽，接种在以1/4ms naa 0.2mg/l tdz 1.5mg/l zt 0.5mg/l 活性炭1.2g/l的丛生芽诱导培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养15天，待丛生芽萌发后，将温度调整至25
±
2℃继续暗培养10天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照3000lux光12h进行光暗交替培养30天。
36.4.丛生芽增殖：诱导出的丛生芽切成单芽，同时剪下叶片，分别将单芽和叶片接种在改良n6 naa 0.6mg/l tdz 0.6mg/l kt 2.5mg/l ch 30mg/l 椰乳80mg/l 酵母粉30mg/l 活性炭0.4g/l的丛生芽增殖培养基中，在温度为28
±
2℃下完全暗培养10天，待丛生芽萌发后，将温度调整至25
±
2℃继续暗培养5天，待叶片舒展后，保持温度不变，每天照3000lux光12h进行光暗交替培养20天。
37.5.丛生芽生根：增殖的丛生芽切成单芽，接种在改良n6 naa 0.4mg/l iba 1.2mg/l ch 80mg/l 茉莉酸甲酯0.4mg/l 椰乳80mg/l 活性炭0.6g/l，在温度25
±
2℃，每日照4000lux光14h培养15天，开始生根后置于遮阴率85％的日光下培养15天。
38.6.将生根苗出瓶后，洗净基部培养基，移栽于水苔中，在遮阳率为75％的环境下驯化，前20天保持小环境空气湿度为100％，后逐步降低空气湿度，驯化期间保持水苔湿度在65％。
39.实施例中，上述改良n6培养基为在原n6培养基的基础上，将硝酸钾改为880mg/l，硫酸二氢钾改为120mg/l，硫酸铵改为360mg/l，硫酸镁改为35mg/l，氯化钙改为25mg/l。
40.对比例1
41.照余金平，任全进等发表的《捕蝇草组织培养与快速繁殖研究》(江苏农业科学[j]，2008，(1)：129～131)中的最佳方案进行实施，并照本发明实施例1中的驯化方法进行驯化。
[0042]
对比例2
[0043]
照余慧琳，胡月华发表的《维纳斯捕蝇草及其叶片离体快繁技术研究》(余慧琳，胡月华，生物学通报[j]，2009，44(3)：59～61)中的最佳实施方案进行实施，并照本发明实施例1中的驯化方法进行驯化。
[0044]
对比例3
[0045]
照专利《一种捕蝇草组织培养育苗方法》(专利申请号：cn106718905a)中的实施例
1进行实施，并照本发明实施例1中的驯化方法进行驯化。
[0046][0047]
捕蝇草组培最困难的环节为无形体系的建立，低的消毒污染率会引起极高的消毒死亡率，而低的消毒死亡率又会引起高的消毒污染率，现有的消毒技术存在消毒污染率和消毒死亡率的矛盾。对比例1中，在外植体消毒时，共进行了两次，仅第二次有2颗苗无污染，且仅1颗苗存活并成功诱导，而对比例2及对比例3时，均进行了3次外植体消毒，前两次未污染的苗死亡率为100％，仅最后一次成活了一颗并成功诱导。
[0048]
由上表可以看出，不论是消毒方法，增殖过程中的最佳增殖周期、增殖系数以及增殖过程中的僵苗、红苗及枯稍苗等异常率，还是生根过程中的玻化率以及具夹率，本发明都优于现有技术，同时，由于生根苗具夹率高，夹子较大，出瓶进行驯化，其驯化成商品苗的周期亦较现有技术短。
[0049]
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。