一种信号放大技术在PGP9.5检测试剂盒中的应用的制作方法

一种信号放大技术在pgp9.5检测试剂盒中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种信号放大技术在脑特异性蛋白产物9.5(pgp9.5)检测试剂盒中的应用。


背景技术：

2.创伤性脑损伤(tbi)是由外力引起的大脑损伤，会破坏大脑正常功能，导致人的认知能力或身体机能受损。脑创伤使神经系统产生复杂的病生理变化，在细胞、分子水平产生一系列级联反应。特别是在创伤后的继发性脑损伤中，加剧神经组织损伤和保护神经细胞的各种反应往往相互交织，使得对于脑创伤后的致病机制研究更加复杂。在所有类型tbi中，最常见的后遗症为头痛(47.9％)和记忆异常(42％)(《英国神经外科杂志》，2018)，约三成患者需要心理辅导或神经病学治疗。tbi是神经外科中最常见疾病，也是世界范围内主要的死亡原因及致残因素之一，其后遗症对患者健康有永久性影响。
3.疑似tbi的医疗护理流程分为三步：首先是使用15分格拉斯哥昏迷量表(gcs)(美国外科医师学会创伤委员会，1997)对神经进行评估，以评定脑损伤严重度，然后进行结构性神经影像学检查，最常见的是通过头部ct扫描来可视化骨折和颅内病变，最后根据ct结果制定治疗方案、留院观察或出院。
4.目前，ct扫描是广泛用于帮助临床医师评估tbi的唯一客观、简单且可靠的选择。然而，ct结果的正确性与ct设备的准确性及医师的阅片水平直接相关，和其他检测方法相比，是一种相对主观的判断方法。约90％轻度tbi(有时被称为“脑震荡”)的ct扫描结果呈阴性。这些患者中只有不到1％的人需进行神经外科干预。鉴于这些患者的ct扫描阳性百分比非常低，且不必要的影像学检测可能会增加辐射诱发癌变的风险，寻找开发其他的脑损伤诊断方法来准确判断颅脑损伤程度和评估预后，具有巨大的临床意义和战略意义。
5.脑特异性蛋白产物9.5(pgp9.5)(又名泛素羧基末端水解酶l1，uch-l1)是一种去泛素化酶，也是一种神经系统特异性蛋白。人的pgp9.5由223个氨基酸组成，主要分布于成熟神经元，特别是黑质中，在未分化的中枢神经和周围神经均有分布。pgp9.5作为脑中含量最丰富的蛋白质之一，其含量可占脑可溶蛋白的2％(应天舒，泛素羧基末端水解酶l1的分布及改变，2013)。pgp9.5经由泛素相关途径行使对细胞增生、分化和凋亡的调节功能。研究表明，pgp9.5对维持神经轴突的稳定、胚脑组织神经发生过程、应激介导的细胞凋亡有关，从而影响神经系统。
6.在tbi中，pgp9.5在1小时内会通过血脑屏障进入血液，导致血清pgp9.5显著升高。对tbi的早期诊断，鉴别诊断和判断预后有重要的意义(刘媛，泛素羧基末端水解酶-1的研究进展，2008)，临床上主要用于脑外伤的辅助诊断。如专利cn201880020489.5公开了一种使用早期生物标记物泛素羧基末端水解酶l1(uch-l1)帮助诊断和评价已遭受或可能已遭受对头部的损伤、诸如轻度或中度至重度创伤性脑损伤(tbi)的人类受试者的方法。专利cn201710396942.x则公开了一种用于轻中度脑损伤的快速诊断试剂及含有该试剂的试剂盒及该试剂盒的制备和检测方法，该试剂和试剂盒包括s100、gfap、uchl1分别制得的单克
隆捕获抗体；所述试剂盒还包括检测抗体s100、gfap、uchl1分别制得的多克隆抗体。
7.生物素-亲和素系统(biotin-avidin-system，bas)是70年代末发展起来的一种新型生物反应放大系统。生物素与亲和素之间高亲合力的牢固结合以及多级放大效应，使bas免疫标记和有关示踪分析更加灵敏，已成为广泛用于微量抗原、抗体定性、定量检测及定位观察研究的新技术。但目前尚未有技术公开生物素-亲和素放大系统在pgp9.5检测中的应用。


技术实现要素：

8.针对上述不足，本发明提供了一种用于检测脑特异性蛋白产物9.5(pgp9.5)的试剂盒及其制备方法与应用。本发明采用“链霉亲和素-生物素”信号放大体系，利用磁微粒化学发光法定量分析人外周血脑特异性蛋白产物9.5(pgp9.5)的水平，用于创伤性脑损伤等神经系统疾病的辅助诊断，增加了检测的灵敏度，降低了主要原料使用量，降低了材料成本，检测快速，操作简便。
9.术语：
10.pgp9.5：脑特异性蛋白产物9.5，又名泛素羧基末端水解酶l1，uch-l1。
11.alp：碱性磷酸酶。
12.一方面，本发明提供了一种用于检测脑特异性蛋白产物9.5的试剂盒。
13.具体地，所述的试剂盒中包括两种能与脑特异性蛋白产物9.5结合的抗体1和抗体2，所述的抗体1包括seq id no:2所示的重链可变区序列和seq id no:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括seq id no:3所示的重链可变区序列和seq id no:5所示的轻链可变区序列。
14.进一步具体地，所述的重链可变区和轻链可变区通过seq id no:6所示的柔性连接肽连接。
15.进一步具体地，所述的抗体1的序列为seq id no:7所示的氨基酸序列，所述的抗体2的序列为seq id no:8所示的氨基酸序列。
16.进一步具体地，所述的试剂盒中还包括碱性磷酸酶、链霉亲和素和生物素。
17.优选地，所述的抗体1或抗体2与碱性磷酸酶或生物素偶联后使用。
18.进一步具体地，所述的试剂盒中还包括：校准品和质控品。
19.所述的质控品包括脑特异性蛋白产物9.5抗原，由脑特异性蛋白产物9.5抗原与缓冲液配制而成。
20.另一方面，本发明提供了前述用于检测脑特异性蛋白产物9.5的试剂盒的制备方法。
21.具体地，所述的制备方法包括：碱性磷酸酶和抗脑特异性蛋白产物9.5抗体1的偶联；生物素和抗脑特异性蛋白产物9.5抗体的偶联；链霉亲和素连接磁微粒。
22.进一步具体地，所述的抗体1包括seq id no:2所示的重链可变区序列和seq id no:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括seq id no:3所示的重链可变区序列和seq id no:5所示的轻链可变区序列，所述的重链可变区和轻链可变区通过seq id no:6所示的柔性连接肽连接。
23.进一步具体地，所述的抗体1的序列为seq id no:7所示的氨基酸序列，所述的抗
体2的序列为seq id no:8所示的氨基酸序列。
24.进一步具体地，所述的抗体1与碱性磷酸酶的质量比1:1-2；所述的生物素与抗体2的质量比为1:12.5-125。
25.所述的磁微粒与链霉亲和素质量比10-100:1。
26.所述的生物素间隔臂大于13埃。
27.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
28.(1)本发明在原有工艺基础上加入了信号放大体系，原有的待测物结构“碱性磷酸酶-抗体1＝抗原＝抗体2-磁微粒”是一种单一的线性结构，一个抗原对应一个磁微粒。由于每个链霉亲和素都可以和4个生物素相连接，因此，新的待测物“碱性磷酸酶-抗体1＝抗原＝抗体2-生物素-链霉亲和素-磁微粒”是一种树状结构。这种结构在磁微粒数量不变的情况下可以使信号值放大4倍；在信号值相同的情况下可以使磁微粒和抗体2用量减小4倍，节省大量生产成本。在实际应用中会采用折中的方法，一般可以使信号值提高1-2倍、灵敏度提高30％-50％、生产成本下降5％-15％。本发明生物素-亲和素信号放大体系示意图见图4。
29.(2)本发明使用免疫学检测手段对创伤性脑损伤进行血液检测，与影像学检测手段(主要为ct)相比，更能客观地反映样本的真实情况，减少了因主观判断造成的误判和漏判。
30.(3)本发明使用的磁微粒化学发光法可以使检测灵敏度达到皮克级别(10-12
g/ml)，而ct依赖像素达到更高的分辨率。由于本发明是对脑损伤特异性标志物进行检测，检测窗口比ct提前很多。在ct阴性的情况下，即可对正常人和轻度tbi患者进行有效区分。
31.(4)本发明使用全自动仪器进行检测，只需加入血清样本，30分钟即可得到准确结果。而ct检测时间较长，一般需要至少等待4小时才能取得检测结果。
附图说明
32.图1为pgp9.5检测试剂条示意图。
33.图2为本发明的反应流程图(反应原理)。
34.图3为本发明的工艺流程图。
35.图4为生物素-亲和素信号放大体系示意图。
36.图5为四参数logistic方程拟合曲线示意图。
37.图6为最小二乘法拟合曲线示意图。
具体实施方式
38.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
39.基础实施例：pgp9.5抗体制备
40.1.免疫动物
41.选择balb/c小鼠作为宿主动物进行免疫，将1-5mg/ml的抗原(所述的抗原为
pgp9.5蛋白，所述的pgp9.5蛋白的序列如seq id no:1所示)与弗氏完全佐剂(购自sigma，货号f5881)按体积比1:1混合后进行腹腔注射。在第14天、第35天将1-5mg/ml的抗原溶液与弗氏不完全佐剂(购自sigma，货号f5506)按体积比1:1混合后进行第二次、第三次免疫，在第56天左右将1-5mg/ml抗原溶于pbs进行第四次免疫。第61天左右即可进行细胞融合。期间，在第21天、42天分别进行两次滴度测试，观察免疫效果。
42.2.细胞融合及培养
43.将提取的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞按计数比1:3混合。混合后加入rpmi1640培养基(购自sigma，货号r8758)定容至40ml，1500rpm离心5分钟后去上清。在37℃水浴融合，期间加入1ml等温的融合剂(购自sigma，货号11363735001)，静置1分钟后，加入缓慢加入2ml等温的rpmi 1640培养基。混匀后，1500rpm离心5分钟后去上清。将融合的细胞液放入有饲养细胞的培养盘中，在5％浓度的co2培养箱中37℃培养。
44.3.杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化
45.培养7天后，用hat培养基(购自sigma，货号h0262)置换培养液，继续进行培养，14天后进行第二次筛选。第二次筛选采用有限稀释法对细胞进行3-4次稀释，选择阳性值最高的细胞进行克隆化，以得到合适的细胞株。
46.4.单克隆抗体制备
47.选择balb/c小鼠作为宿主，每只小鼠进行0.5-1ml降植烷腹腔注射。在每只小鼠腹腔内接种2ml细胞浓度在200-300细胞/ml以内的对数期杂交瘤细胞。在14天后开始抽取小鼠腹水，每次抽取腹水应间隔3天，直至无腹水产生或小鼠转状态不良。使用盐析法及亲合法将小鼠腹水纯化为单克隆抗体。
48.本发明制备得到的抗体1的序列为seq id no:7所示的氨基酸序列，所述的抗体2的序列为seq id no:8所示的氨基酸序列。其中，抗体1包括seq id no:2所示的重链可变区序列和seq id no:4所示的轻链可变区序列，所述的抗体2包括seq id no:3所示的重链可变区序列和seq id no:5所示的轻链可变区序列，所述的重链可变区和轻链可变区通过seq id no:6所示的柔性连接肽连接。
49.5.抗体亲和力检测
50.使用fortebio octet qke生物分子相互作用分析仪，通过生物层干涉测量法检测上述抗体与抗原(所述的抗原为pgp9.5蛋白，所述的pgp9.5蛋白的序列如seq id no:1所示)的亲和力(步骤详见说明书或参照tobias等人，biomolecular binding kinetic assays in the octet platform,application note 14,fortebio,div.of pall life sciences,2013)。通过检测可知，本技术所述的抗体1的kd(m)值为0.97e-12，所述的抗体2的kd(m)值为1.14e-12。
51.基础实施例2.一种脑特异性蛋白产物9.5检测试剂盒
52.本试剂盒采用双抗体夹心法测定pgp9.5的含量。样本中pgp9.5和试剂a中的抗体1及试剂b中的抗体2结合，形成“三明治”夹心结构。加入过量的试剂c，试剂c中的链霉亲和素与试剂b中的生物素反应，生成“碱性磷酸酶-抗体1-pgp9.5-抗体2-生物素-链霉亲和素＝磁微粒”复合物(图4)。经洗涤，发光底物被复合物中的酶催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基态时便发出光子。产生的光子数与样本中pgp9.5的浓度成正相关。
53.1、试剂盒组分包括：检测试剂条、校准品、质控品，其中：
54.检测试剂条由一系列溶液和附件组成一个整体，可以独立检测一个样本；
55.校准品由含有两个浓度的pgp9.5抗原和缓冲液配制而成，用于校准标准曲线；
56.质控品由pgp9.5抗原和缓冲液配制而成。
57.具体如下表1所示。
58.表1
59.试剂盒主要组分装量浓度检测试剂条10条-质控品200μl
×
1320pg/ml校准品1200μl
×
1160pg/ml校准品2200μl
×
11280pg/ml
60.2、试剂条组分
61.检测试剂条由试剂a、试剂b、试剂c、清洗液、发光底物、测读孔、洗脱套、吸头组成。
62.试剂a为含一定浓度碱性磷酸酶标记的pgp9.5抗体1溶液；
63.试剂b为含一定浓度生物素标记的pgp9.5抗体2溶液；
64.试剂c为含一定浓度链霉亲和素标记的磁微粒；
65.清洗液用于反应过程的清洗；
66.发光底物为alp催化的发光底物；
67.测读孔用于最终的检测读值。
68.pgp9.5检测试剂条示意图见图1，对应孔位主要组分见下表2。
69.表2
70.位置检测试剂条组分装量/数量1【无】样本孔位/2吸头1个3洗脱套1个4清洗液2.0ml5发光底物180μl6试剂b60μl7试剂c60μl8试剂a80μl9【无】/10【无】/11【无】反应孔位/12【无】清洗孔位/13【无】清洗孔位/14【无】清洗孔位/15测读孔1个
71.3、生产工艺
72.3.1校准品、质控品的生产
73.将pgp9.5蛋白(序列如seq id no:1所示)作为校准品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度为160pg/ml、1280pg/ml。
74.将pgp9.5重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合配制成质控品。浓度为320pg/ml。
75.缓冲液7的配方如下表3所示。
76.表3
[0077][0078]
3.2试剂a的生产
[0079]
以缓冲液8将酶标记pgp9.5抗体1偶联物充分混匀配制成试剂a，酶标记pgp9.5抗体1偶联物终浓度为1.0μg/ml，缓冲液8的配方如下表4所示。
[0080]
表4
[0081][0082]
酶标记pgp9.5抗体1偶联物制备方法如下：
[0083]
(1)抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml。按2-it与抗体1摩尔比15:1-30:1的比例(即：1mg抗体1加入10-20μl 2it溶液)将2it溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入5-20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体1。
[0084]
缓冲液1的配方如下表5所示。
[0085]
表5
[0086][0087]
缓冲液2的配方如下表6所示。
[0088]
表6
[0089][0090]
(2)碱性磷酸酶的活化
[0091]
alp的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml。按smcc与alp摩尔比15:1-60:1的比例在alp溶液中加入smcc溶液(即：1mg alp加入8.5-34.5μl smcc溶液)。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg alp加入10-50μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，室温反应10min。使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp。
[0092]
(3)抗体和alp的连接
[0093]
活化后的抗体1和活化后的alp的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与alp质量比1:2-1:1的比例在抗体1溶液中的加入alp溶液(即：1.0mg抗体1加入1.0-2.0mg alp)。震荡混匀后，将混合物在2℃-8℃环境中反应12-18小时。
[0094]
(4)抗体1偶联物的终止和纯化
[0095]
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml的马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入4-20μl 0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm。即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1。按1mg抗体1加入10-50μl 100mm乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至0.5-2mg/ml。使用纯化蛋白分析仪和superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体即为酶标抗体1偶联物。
[0096]
3.3试剂b的生产
[0097]
以缓冲液8将酶标记pgp9.5抗体2偶联物充分混匀配制成试剂b，酶标记pgp9.5抗体2偶联物的终浓度为0.8μg/ml。
[0098]
酶标记pgp9.5抗体2偶联物的制备方法如下：
[0099]
(1)抗体2的除盐
[0100]
使用缓冲液10作为pd10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15ml缓冲液10清洗pd10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内
体积补足至2-2.6ml。当柱内液体完全进入柱料时，加入3ml缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6ml)。缓冲液10的配方如下表7所示。
[0101]
表7
[0102][0103]
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/ml。高速冷冻离心机参数为：6000-8000rpm、离心10-20分钟。
[0104]
(2)抗体2连接生物素
[0105]
称取一定量的间隔臂大于13埃的生物素，用缓冲液2溶解至5-20mm。按生物素与抗体2质量比1：12.5-125的比例(即：1mg抗体加入8-80μg生物素)，将生物素加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应30分钟。
[0106]
(3)生物素抗体2连接物的纯化
[0107]
使用缓冲液10作为pd10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15ml缓冲液10清洗pd10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的生物素抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2-2.6ml。当柱内液体完全进入柱料时，加入3ml缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2-2.6ml)。
[0108]
将除盐后的生物素抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至0.5-4mg/ml，即酶标记pgp9.5抗体2偶联物。
[0109]
3.4试剂c的生产
[0110]
将链霉亲和素标记磁微粒作为试剂c的原料。以缓冲液9将其充分混匀配制成试剂c，缓冲液9的配方如下表8所示。
[0111]
表8
[0112][0113]
链霉亲和素连接磁微粒及纯化方法如下：
[0114]
(1)磁微粒的清洗
[0115]
选择粒径为0.5-3μm，脑核磁化强度60-100emu/g的羧基磁微粒原料充分混匀0.5-1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为5-10mg/ml。缓冲液11的配方如下表9所示。
[0116]
表9
[0117][0118]
将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
[0119]
一共重复三次重悬、分离步骤。
[0120]
(2)磁微粒的重悬
[0121]
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为5-10mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
[0122]
(3)链霉亲和素连接磁微粒
[0123]
将一定量的链霉亲和素用缓冲液11溶解至1-5mg/ml。按磁微粒与链霉亲和素质量比100:1-100:10的比例(即1mg磁微粒加入10-100μg链霉亲和素)，将链霉亲和素加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀20分钟。
[0124]
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)用缓冲液11溶解至4-15mg/ml。按磁微粒与edc质量比100:15-100:50的比例(即1mg磁微粒加入150-500μg edc)，将edc加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀1.5小时。
[0125]
(4)链霉亲和素磁微粒连接物的封闭
[0126]
在偶联反应完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml。缓冲液12的配方如下表10所示。
[0127]
表10
[0128][0129][0130]
将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
[0131]
(5)链霉亲和素磁微粒连接物的清洗
[0132]
在封闭完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，缓冲液13的配方如下表11所示。
[0133]
表11
[0134][0135]
将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
[0136]
一共重复三次磁分离、重悬、混匀步骤。
[0137]
(6)链霉亲和素磁微粒连接物的重悬
[0138]
在清洗完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5-10mg/ml，混匀5分钟。再加入总体积1/20-1/50的缓冲液14，混匀25分钟。将连接物在2℃-8℃环境中保存。缓冲液14的配方如下表12所示。
[0139]
表12
[0140][0141][0142]
制备工艺流程图参考图3。
[0143]
实施例1一种脑特异性蛋白产物9.5检测方法
[0144]
1、生产工艺
[0145]
1.1校准品、质控品的生产
[0146]
将pgp9.5蛋白(序列如seq id no:1所示)作为校准品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合后配制成2个校准品，浓度为160pg/ml、1280pg/ml。
[0147]
将pgp9.5重组蛋白作为质控品的原料。以缓冲液7将其溶解，充分混合配制成质控品。浓度为320pg/ml。
[0148]
缓冲液7的配方如下表13所示。
[0149]
表13
[0150][0151]
1.2试剂a的生产
[0152]
以缓冲液8将酶标记pgp9.5抗体1偶联物充分混匀配制成试剂a，酶标记pgp9.5抗体1偶联物终浓度为1.0μg/ml，缓冲液8的配方如下表14所示。
[0153]
表14
[0154][0155][0156]
酶标记pgp9.5抗体1偶联物制备方法如下：
[0157]
(1)抗体1的活化需在十万级洁净厂房内进行。称取4-8mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐(2it)，用缓冲液1溶解至13.76mg/ml。按2-it与抗体1摩尔比20:1的比例将2it溶液加入抗体1溶液中进行活化。震荡混匀后在室温下反应30分钟。终止活化，按1mg抗体1加入10μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入抗体1溶液中，室温反应10min。使用pd10脱盐柱除去过量的2it，收集活化后的抗体1。
[0158]
缓冲液1的配方如下表15所示。
[0159]
表15
[0160][0161]
缓冲液2的配方如下表16所示。
[0162]
表16
[0163][0164]
(2)碱性磷酸酶的活化
[0165]
alp的活化需在十万级洁净厂房内进行。alp购自sigma，货号为p0114。称取2-4mg(n-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(smcc)，用二甲基甲酰胺(dmf)溶解至6.69mg/ml。按smcc与alp摩尔比40:1的比例在alp溶液中加入smcc溶液。震荡混匀后，室温下反应30分钟。终止活化，按1mg alp加入20μl缓冲液2的比例，将缓冲液2加入alp溶液中，
室温反应10min。使用pd10脱盐柱除去过量的smcc，收集活化后的alp。
[0166]
(3)抗体和alp的连接
[0167]
活化后的抗体1和活化后的alp的连接需在十万级洁净厂房内进行。按抗体与alp质量比1.5:1的比例在抗体1溶液中的加入alp溶液。震荡混匀后，将混合物在4℃环境中反应15小时。
[0168]
(4)抗体1偶联物的终止和纯化
[0169]
抗体1偶联物的终止和纯化需在十万级洁净厂房内进行。称取1-10mg马来酰亚胺，用dmf溶解至9.7mg/ml。按1/10比例，用缓冲液1稀释，得到0.97mg/ml的马来酰亚胺溶液。按1mg抗体1加入10μl 0.97mg/ml马来酰亚胺溶液比例加入该溶液，在室温下反应15分钟。准确量取6μl乙醇胺，用缓冲液1溶解至100mm。即在6μl乙醇胺加入994μl缓冲液1。按1mg抗体1加入30μl 100mm乙醇胺溶液的比例加入该溶液，震荡混匀。使用超滤浓缩管将待纯化的抗体1偶联物浓缩至1mg/ml。使用纯化蛋白分析仪和superdex 200制备级2.6/60凝胶柱进行抗体纯化，洗脱液为缓冲液2。纯化后的液体即为酶标抗体1偶联物。
[0170]
1.3试剂b的生产
[0171]
以缓冲液8将酶标记pgp9.5抗体2偶联物充分混匀配制成试剂b，酶标记pgp9.5抗体2偶联物的终浓度为0.8μg/ml。
[0172]
酶标记pgp9.5抗体2偶联物的制备方法如下：
[0173]
(1)抗体2的除盐
[0174]
使用缓冲液10作为pd10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15ml缓冲液10清洗pd10脱盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的抗体2。使用缓冲液2将柱内体积补足至2ml。当柱内液体完全进入柱料时，加入3ml缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2ml)。缓冲液10的配方如下表17所示。
[0175]
表17
[0176][0177]
将除盐后的抗体2加入超滤浓缩管进行浓缩至3mg/ml。高速冷冻离心机参数为：6000rpm、离心20分钟。
[0178]
(2)抗体2连接生物素
[0179]
称取一定量的间隔臂大于13埃的生物素(购自sigma，货号为qbd10200)，用缓冲液2溶解至10mm。按生物素与抗体2质量比1：100的比例，将生物素加入抗体2溶液中进行反应。震荡混匀后在室温下(20-30℃)反应30分钟。
[0180]
(3)生物素抗体2连接物的纯化
[0181]
使用缓冲液10作为pd10脱盐柱的平衡液和洗脱液。使用15ml缓冲液10清洗pd10脱
盐柱，在最后一次清洗的液体完全进入柱料时，加入需要脱盐的生物素抗体2连接物。使用缓冲液2将柱内体积补足至2ml。当柱内液体完全进入柱料时，加入3ml缓冲液10开始洗脱。收集蛋白洗脱液，收集量为第一次补足的相应体积(2ml)。
[0182]
将除盐后的生物素抗体2连接物加入超滤浓缩管进行浓缩至3mg/ml，即酶标记pgp9.5抗体2偶联物。
[0183]
1.4试剂c的生产
[0184]
将链霉亲和素标记磁微粒作为试剂c的原料。以缓冲液9将其充分混匀配制成试剂c，缓冲液9的配方如下表18所示。
[0185]
表18
[0186][0187][0188]
链霉亲和素连接磁微粒及纯化方法如下：
[0189]
(1)磁微粒的清洗
[0190]
选择粒径为0.5-3μm，脑核磁化强度60-100emu/g的羧基磁微粒原料(购自biomag，货号为bms)充分混匀0.5-1小时。使用缓冲液11对磁珠进行重悬，浓度为8mg/ml。缓冲液11的配方如下表19所示。
[0191]
表19
[0192][0193]
将清洗后的磁珠充分混匀10分钟，使用sepmag磁性分离器对磁微粒进行分离，每克磁珠原料分离2分钟，但不能少于5分钟。
[0194]
一共重复三次重悬、分离步骤。
[0195]
(2)磁微粒的重悬
[0196]
使用缓冲液11对清洗三次后的磁微粒进行重悬，浓度为8mg/ml。将重悬后的磁微粒充分混匀5分钟。
[0197]
(3)链霉亲和素连接磁微粒
[0198]
将一定量的链霉亲和素(sigma rstrep-ro)用缓冲液11溶解至3mg/ml。按磁微粒与链霉亲和素质量比100:5的比例，将链霉亲和素加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀20分钟。
[0199]
将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)用缓冲液11溶解至10mg/ml。按磁微粒与edc质量比100:30的比例，将edc加入磁微粒中进行反应，在室温下混匀1.5小时。
[0200]
(4)链霉亲和素磁微粒连接物的封闭
[0201]
在偶联反应完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液12对连接物进行重悬，浓度为5mg/ml。缓冲液12的配方如下表20所示。
[0202]
表20
[0203][0204]
将重悬后的连接物室温混匀1.5小时。
[0205]
(5)链霉亲和素磁微粒连接物的清洗
[0206]
在封闭完成后，将链霉亲和素磁微粒连接物进行磁分离。每克连接物分离2分钟，但不能少于5分钟。使用缓冲液13对连接物进行重悬，浓度为5mg/ml，缓冲液13的配方如下表21所示。
[0207]
表21
[0208][0209]
将清洗后的连接物充分混匀10分钟。
40pg/ml的样本b(人源外周血血清)中，所加入pgp9.5抗原与样本b之间的体积比例为1:9，根据公式(1)计算回收率r，其回收率在90％-110％范围内。
[0227][0228]
式中：
[0229]
r—回收率；
[0230]
v—样品a液的体积；
[0231]
v0—血清样品b液的体积；
[0232]
c—血清样品b液加入a液后的3次测量平均值；
[0233]
c0—血清样品b液的3次测量平均值；
[0234]
cs—样品a液的浓度。
[0235]
3.2空白限
[0236]
将不含任何分析物的人源外周血血清样本重复测试20次，得到20次测试结果的浓度值，按四参数logistic方程公式(2)进行拟合，计算其平均值和标准差(sd)。平均值即为空白限，结果≤40pg/ml。
[0237]
y＝((a-b)/(1 (∣x∣/c)^(d))) (b)
ꢀꢀꢀꢀ
(2)
[0238]
3.3检出限
[0239]
对5份浓度近似空白限的低值人源外周血血清进行检测，每份样本检测5次，对检测结果按照大小进行排序，如果低于空白限数值的检测结果的数量小于或等于3个，即可认为空白限和检出限的设置基本合理。
[0240]
3.4线性区间
[0241]
将接近线性区间上限的高值样本(2500pg/ml的人源外周血血清)与接近线性区间下限的低值样本或零浓度样本(人源外周血血清)混合成不少于5个稀释浓度，其中低值浓度的样本须接近线性区间的下限。对每一浓度的样本各重复测试3次得到发光值，记录各样品的测量结果，并计算各样品3次测量值的平均值(yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以测定结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。按公式(3)计算线性回归的相关系数(r)，在80-2560pg/ml的线性区间内，相关系数r≥0.990。(该最小二乘法拟合曲线详见图6)
[0242][0243]
式中：
[0244]
r为相关系数；xi为稀释比例；yi为各个样本测定结果均值；为稀释比例的均值；为样本测定结果总均值。
[0245]
3.5重复性
[0246]
同批号试剂盒重复测试质控品10次，计算10次测试结果的平均值和标准差sd。按公式(4)计算变异系数(cv)，结果cv≤8％。
[0247][0248]
式中：s为样本测试值的标准差；为样本测试值的平均值。
[0249]
3.6批间差
[0250]
用3个批号的试剂盒分别重复测试质控品10次，计算30次测试结果的平均值和标准差sd，根据公式(3)得出变异系数(cv)，结果cv≤12％。
[0251]
3.7特异性
[0252]
在不含任何分析物的样本中加入5000ng/ml的胶质纤维酸性蛋白(gfap)(厂家sigma，货号zrb2383)，测3次取均值，按公式(5)计算结果，交叉反应率小于5％。
[0253]rcr
＝m/c
×
100％
ꢀꢀꢀꢀꢀ
(5)
[0254]
式中：
[0255]rcr
为交叉反应率；m为交叉反应物测定结果均值；c为交叉反应物标示值。
[0256]
3.8校准品和质控品瓶间差
[0257]
检测同一批号10瓶校准品(或质控品)各1次，按公式(6)计算，测定结果的均值与标准差(s1)。另取上述10瓶校准品(或质控品)中的1瓶连续测定5次，计算结果的均值和标准差(s2)，按照公式(7)、(8)计算瓶间重复性cv％，测量结果cv＜10％。
[0258][0259][0260][0261]
(说明：当s1《s2时，cv瓶间＝0)
[0262]
式中：s为标准差。
[0263]
实施例2.准确度检测
[0264]
参照实施例1的方法，检测其准确度，检测结果如下表23：
[0265]
表23
[0266][0267]
实施例3.空白限检测
[0268]
参照实施例1的方法，检测其空白限，最终确定其空白限为40pg/ml，检测结果如下表24：
[0269]
表24
[0270][0271][0272]
实施例4.检出限检测
[0273]
参照实施例1的方法，检测其线性区间，检测结果如下表25：
[0274]
表25
[0275][0276]
实施例5.线性区间检测
[0277]
参照实施例1的方法，检测其线性区间，检测结果如下表26：
[0278]
表26
[0279][0280]
实施例6.重复性检测
[0281]
参照实施例1的方法，检测其重复性，检测结果如下表27：
[0282]
表27
[0283][0284][0285]
实施例7.批间差检测
[0286]
参照实施例1的方法，检测其批间差，检测结果如下表28：
[0287]
表28
[0288][0289]
实施例8.特异性检测
[0290]
参照实施例1的方法，检测其特异性，检测结果如下表29：
[0291]
表29
[0292][0293][0294]
实施例9.校准品和质控品瓶间差
[0295]
参照实施例1的方法，检测校准品和质控品瓶间差，检测结果如下表30：
[0296]
表30
[0297][0298]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。