一种山羊痘病毒的定量检测方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及病毒的检测及定量方法，具体涉及山羊痘病毒的定量检测方法。


背景技术：

2.山羊痘病毒(capripoxvirus，gpv)为痘病毒科，羊痘病毒属的一个成员，为双链dna病毒，基因组呈线性，全长约150kb，编码147个开放阅读框。病毒基本的化学组成成分是蛋白质、dna和脂类。病毒粒子为砖形，大小为300nm
×
270nm
×
200nm。gpv可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，其中羔羊最易感，感染率可达100％。gpv通过接触痘疹破损后的皮肤、呼吸道的吸入或者媒介的传播而感染其他山羊，同群间传播迅速，但一般不向其他羊群散播。山羊痘病毒对干燥有较高的抵抗力，干燥痂皮内的病毒可以存活3个～6个月，在干热达100℃时，仍可存活5min左右。对常用消毒剂有较强的抵抗力，但500ml/l酒精和0.1g/l kmno4可以在1h内将其灭活。对乙醚和氯仿敏感。反复冻融对其没有明显的灭活作用。
3.国内对该病毒的检测方法较少，目前对该病毒检测方法的研究主要涉及pcr法和tcid
50
法。cn104152583b公开了一种山羊痘病毒taqman-mgb探针实时荧光定量pcr检测用引物、试剂盒和检测方法。用两步扩增法检测目的靶序列。cn103215385b公开一种用于检测山羊痘病毒的试剂盒。试剂盒中至少包括有seq
№
1、seq
№
2、seq
№
3和seq
№
4四条引物，试剂盒内还有dntp、tris-hc、kcl、(nh4)2so4、mgso4、tween20和bst酶，以及模板dna。以上两种方法均为基于核酸检测的方法，需要设计引物，并进行引物合成，且cn104152583b需要荧光染料，环境友好性方面有待提高，且只能定性样品中有无山羊痘病毒基因序列，无法对完整病毒进行准确定量。
4.tcid
50
法操作繁琐，耗时长，需将病毒做多个稀释度后与细胞混合置于二氧化碳培养箱中培养7日，根据细胞病变数判定病毒的tcid
50
(半数细胞感染量)。该方法对环境的无菌条件要求高，如操作不当，易引起细菌污染，导致试验失败。
5.随着山羊痘病毒相关疫苗的研究，急需开发一种操作简单，环境友好，重复性和再现性好的对完整山羊痘病毒的定量检测方法，用于山羊痘病毒生产的质量控制，提升山羊痘病毒疫苗产品品质。
6.hp-sec(high performance-size exclusion chromatography高效尺寸排阻色谱)法是将高效液相色谱法和尺寸排阻色谱结合起来的色谱分离方法，采用凝胶色谱柱，根据被测物质的尺寸大小在高效液相色谱上实现有效分离，分离过程中不会对病毒造成损害。样品仅需简单离心，半小时内就可完成检测，多次检测的重复性非常好。


技术实现要素：

7.本发明提供了一种操作简单、灵敏度高、重复性好的山羊痘病毒的检测方法。本发明根据山羊痘病毒的结构特征，设计采用凝胶柱分离的hp-sec法，结合样品处理、标准品的制备以及检测条件优化，建立了高效的山羊痘病毒的定量检测方法，为山羊痘疫苗研发提
供了质控标准。
8.本发明提供一种山羊痘病毒的定量检测方法，用于对待测样品中的山羊痘病毒进行定量检测，包括下述步骤：
9.(1)液相色谱检测山羊痘病毒样品，对目标峰进行特异性鉴定，制备标准品；
10.(2)用蛋白测定仪测定标准品中抗原浓度；
11.(3)取标准品进行系列稀释，在液相色谱仪上进行检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程；
12.(4)待测样品进行离心澄清；
13.(5)对待测样品用步骤(3)所述的液相色谱法进行检测得到对应的峰面积；
14.(6)根据线性回归方程及样品中山羊痘抗原的峰面积计算得到待测样品中的山羊痘病毒抗原含量；
15.其中，(3)、(5)中所述的液相色谱法使用的色谱柱为凝胶色谱柱，检测器为紫外检测器，其检测波长为280nm。
16.所述液相色谱法流动相为含10mm～30mm磷酸盐(na2hpo4和nah2po4)和体积百分含量为5％～15％甲醇的混合液，ph7.2。所述流动相，磷酸盐缓冲液优选为10mm磷酸盐缓冲液，甲醇的体积百分比优选为10％。
17.所述流动相的流速为1.0ml/min，进样量：50μl
18.优选的，步骤(1)、(3)、(5)中所使用的液相色谱法的凝胶色谱柱为bio basic sec-2000或sephacryl s-500。
19.步骤(4)中，待测样品选自悬浮培养液或纯化液或山羊痘灭活疫苗中的任意一种。
20.步骤(4)中，待测样品采用离心机离心，进行澄清。
21.山羊痘病毒在上述色谱条件下保留时间为9.85min。
22.在本发明的一个实施方式，步骤(1)中，采用病毒特异性检测法对目标峰进行鉴定。
23.所述步骤(2)中，用nanodrop蛋白测定仪测定标准品中抗原浓度。
24.所述步骤(3)中，取山羊痘病毒标准品进行至少5个系列稀释度，并对稀释后的系列标准品进行色谱检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程，r2应大于0.99。
25.所述步骤(4)中，所述待测样品选自病毒悬浮培养液或纯化液或山羊痘灭活疫苗中的任意一种。
26.所述步骤(4)中，所述待测样品山羊痘病毒悬浮培养液或纯化液采用3000～5000r/min离心5～10分钟进行澄清。山羊痘灭活疫苗需解离后，病毒液采用3000～5000r/min离心5～10分钟进行澄清。
27.发明有益效果
28.本发明采用hp-sec法进行山羊痘病毒的定量分析，样品无需复杂的前处理，人为操作的失误极小，且检测方法操作简单，多次检测的重复性好、精密度高、检测时间短，半小时内就可出结果，有效解决了疫苗生产中无法准确定量完整病毒含量的难题。通过定量山羊痘病毒中抗原的含量，可有效指导疫苗的生产，对于提升疫苗的品质具有重大指导意义。
附图说明
29.图1是山羊痘病毒标准品的特异性鉴定结果；
30.图2是山羊痘病毒定量的标准曲线；
31.图3是悬浮培养液样品的检测结果；
32.图4是悬浮培养液同一样品5次重复检测结果。
具体实施方式
33.本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
34.本发明所采用的山羊痘病毒的定量检测方法主要包括以下步骤：
35.1、材料
36.1.1标准品：纯化的山羊痘病毒(中牧实业股份有限公司制备)
37.1.2仪器和试剂：液相色谱仪：akt pure，购自ge公司；蛋白定量仪：nanodrop 2000c，购自thermo；nah2p04、na2hp04、甲醇购自国药集团。
38.2、方法
39.2.1山羊痘病毒的特异性鉴定及标准品制备：取山羊痘病毒av41株液，3000～5000r/min离心5～10分钟，取上清液，0.45μm滤膜过滤，用100kd超滤膜浓缩10倍后，经液相色谱仪检测，得到在280nm的吸收图谱。收集各组分，用病毒特异性检测法对组分进行特异性鉴定。根据鉴定结果，确定保留时间9.85min的组分为山羊痘病毒。多次进样，收集保留时间9.85min的组分，用100kd超滤膜浓缩后制备成山羊痘病毒标准品。
40.2.2标准品蛋白浓度测定：用蛋白测定仪(nanodrop 2000c，购自thermo)测定标准品浓度；
41.2.3液相色谱体系：流动相为含10mm～30mm磷酸盐和5％～15％甲醇的混合液；凝胶色谱柱为thermo bio basic sec-2000或sephacryl s-500；流速为1.0ml/min；进样量50μl。
42.2.4建立线性回归方程：对浓度已知的山羊痘病毒标准品进行系列稀释，并对稀释后的系列标准品进行液相色谱检测，建立以峰面积为横坐标、浓度为纵坐标的线性回归方程；
43.待测样品准备：待测样品以3000～5000r/min离心5～10分钟，取上清液，待测；
44.待测样品检测：用与标准品相同的方法，对待测样品进行检测得到对应的样品峰面积；
45.根据线性回归方程及样品峰面积计算得到待测样品中的山羊痘病毒浓度。
46.实施例1
47.本实施例的目的在于研究缓冲液体系对检测结果的影响。
48.选取三种不同浓度的缓冲液，即10mm、20mm、30mm的磷酸缓冲液，分别加入体积比为5％、10％、15％的甲醇，以分离度为参数，考察不同缓冲体系对检测的影响。
49.以山羊痘病毒悬浮培养液为研究对象，考察不同磷酸缓冲液体系对分离度的影响，结果如表1所示。
50.表1.缓冲液组成对分离度影响的结果
[0051][0052]
由表1可知，10mm磷酸缓冲液中加入体积比为10％的甲醇，获得最佳的分离度，而其他缓冲液组成的分离度均较低。
[0053]
实施例2
[0054]
建立抗原定量标准曲线。
[0055]
(1)标准品的制备：
[0056]
色谱检测及组分收集：取山羊痘病毒av41株悬浮培养液，3000～5000r/min离心5～10分钟，取上清液，0.45μm滤膜过滤，用100kd超滤膜浓缩10倍后，经液相色谱仪检测，得到在280nm的吸收图谱。收集各组分。
[0057]
病毒的鉴定：用病毒特异性检测法对收集的各组分进行特异性鉴定。方法为：将各组分与等量mem营养液混合，同时与空白对照(细胞生长液)，在37℃作用1小时。分别接种已长成良好mdbk细胞单层的6孔细胞培养板，每孔1ml，每组接4孔。置37℃、含5％co2的培养箱中培养5日，每日观察细胞病变情况。如出现细胞病变，表明其中含有完整山羊痘病毒粒子，将其确定为目标峰。结果如图2所示，病毒组出现明显的细胞病变，而空白对照组未出现细胞病变，表明标准品为山羊痘病毒。
[0058]
标准品制备：根据鉴定结果，确定保留时间9.85min的组分为山羊痘病毒。多次进样，收集保留时间9.85min的组分，用100kd超滤膜浓缩后制备成山羊痘病毒标准品。
[0059]
(2)建立标准曲线：
[0060]
将山羊痘病毒标准品用蛋白测定仪进行蛋白定量。
[0061]
将准确定量的山羊痘病毒标准品用10mm磷酸盐缓冲液将标准品倍比稀释成浓度为80μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml的标准品溶液。取50μl进行检测，流速1.0ml/min，检测波长280nm。统计保留时间为9.85min特征峰面积，每组重复2次，结果如表1所示。
[0062]
表2:不同浓毒山羊痘病毒标准品检测结果
[0063][0064]
以山羊痘病毒的浓度与特征峰面积作线性回归，结果如图2所示，山羊痘病毒浓度与特征峰面积的线性关系是y＝2
×
10-5
x-0.0376(y：浓度，单位μg/ml；x：峰面积值)；r2值为0.9997,说明山羊痘病毒的特征峰峰面积与浓度的线性关系高，证明本发明的检测方法可用于山羊痘病毒的定量检测。
[0065]
(3)方法的精密度
[0066]
将已知浓度的标准品(20μg/ml)加入无病毒的培养液中混合后，立即平行检测5次，检测结果如图4；记录每次检测特征峰的峰面积值，计算检测的精密度和回收率，结果如下表3所示。
[0067]
表3:检测的精密度和回收率
[0068][0069]
如表3所示，样品平行测定5次，相对标准偏差仅为0.64％，方法的精密度高；平均回收率为102.6％，方法的回收率好。
[0070]
实施例3
[0071]
山羊痘病毒悬浮培养液的定量检测
[0072]
1、仪器与试剂
[0073]
液相色谱仪akta pure，配备紫外检测器。蛋白定量仪thermo nanodrop2000c。
[0074]
流动相的配制：取0.2m的na2hpo4水溶液72ml和0.2m的的nah2po4水溶液28ml，用超纯水定容至2000ml，配制成含10mm磷酸盐的缓冲液，加入体积比为10％的甲醇，ph7.2，即得流动相，0.45μm滤膜过滤。
[0075]
待测样品：山羊痘病毒悬浮培养液(av41株，中牧实业股份有限公司提供)
[0076]
标准品：中牧实业股份有限公司制备，来自实施例2。
[0077]
2、悬浮培养液中的山羊痘病毒含量测定
[0078]
对悬浮培养的山羊痘病毒进行定量，样品用离心法澄清(待测样品以3000～5000r/min离心5～10分钟)，取上清液50μl检测。
[0079]
图3为本发明实施例的样品的结果。
[0080]
如图3所示，上述样品的检测结果图谱中，保留时间9.85min处有山羊痘病毒的特征峰。连续检测3次，通过实施例2的标准曲线可计算出3次检测的含量分别为21.3μg/ml、21.7μg/ml、21.1μg/ml，由此计算出此悬浮培养的山羊痘病毒含量为21.4μg/ml。
[0081]
实施例4
[0082]
山羊痘病毒灭活疫苗的定量检测
[0083]
1、仪器与试剂
[0084]
液相色谱仪akta pure，配备紫外检测器。蛋白定量仪thermo nanodrop 2000c。
[0085]
流动相的配制：取0.2m的na2hpo4水溶液72ml和0.2m的的nah2po4水溶液28ml，用超纯水定容至2000ml，配制成含10mm磷酸盐的缓冲液，加入10％(体积比)的甲醇，ph7.2，即得流动相，0.45μm滤膜过滤。
[0086]
待测样品：山羊痘病毒灭活疫苗(中牧实业股份有限公司制备)
[0087]
标准品：实施例2制备的标准品。
[0088]
2、灭活疫苗中山羊痘病毒含量测定
[0089]
对待测灭活疫苗样品先用正丁醇解离，按疫苗:正丁醇＝6:1的比例，加入正丁醇至疫苗中，震荡1～3分钟，2～8℃下静置30分钟，取下层澄清液，采用离心法澄清(以3000～5000r/min离心5～10分钟)，取上层澄清液50μl检测。连续检测3次，通过实施例2的标准曲线可计算出3次检测的含量分别为6.3μg/ml、6.4μg/ml、6.3μg/ml，由此计算出此疫苗解离液中的山羊痘病毒含量为6.33μg/ml，因疫苗中抗原与佐剂比例为1:1，由此计算出疫苗中山羊痘病毒含量为12.66μg/ml。
[0090]
实施例作用与效果
[0091]
本实施例提供的山羊痘病毒的定量检测方法，采用了基于凝胶色谱柱的液相色谱法对山羊痘病毒进行定量检测，能有效将病毒和杂质分离，达到检测病毒的目的。本实施例的相对标准偏差仅为0.64％，方法的重复性好、精密度高，能够达到检测方法的定量要求，可以作为山羊痘病毒的定量检测方法应用。
[0092]
液相色谱具有操作简便、检测时间短等优点，使得本实施例的定量检测方法适用于山羊痘病毒产业化生产过程中的质量控制。
[0093]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。