Ctrp15在制备促进血管新生改善缺血相关的心功能产品中的应用的制作方法

ctrp15在制备促进血管新生改善缺血相关的心功能产品中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及ctrp15在制备促进血管新生改善缺血相关的心功能产品中的应用。


背景技术：

2.心肌梗死(myocardial infarction，mi)是由于冠脉的急性闭塞引起的心肌缺血缺氧死亡，是导致心衰以及死亡的主要原因。其中约1/3的患者在入院治疗时发现既往已存在陈旧性心梗并且具有较充分的侧支循环；并且有临床研究发现患者远期预后与侧支循环新生的程度明显相关，侧支循环建立充分的患者再灌注治疗60个月后心力衰竭发生率(3.1%vs11.6%)和死亡发生率(7.1%vs15.4%)显著低于不充分的患者。目前针对心肌梗死患者主要的治疗手段也是通过再灌注治疗恢复血供，尽管如此仍有大量患者因为未能及时手术或缺血再灌注损伤等导致心肌修复不良，出现心衰等并发症。一旦出现心衰，5年存活率仅为50%。因此亟需寻找内科药物干预靶点，通过改善心脏损伤后血管新生促进心功能的恢复。
3.侧支血管新生过程中内皮细胞的增殖、出芽是新血管侧支形成的关键细胞事件，在心脏损伤修复过程的微环境由浸润到心脏组织的中性粒、巨噬细胞以及大量的外分泌型因子(vegf,pdgf,etc.)形成，分泌型因子介导着细胞以及组织间的相互调节作用。研究发现骨骼肌与心脏组织之间的内皮细胞状态具有高度的相似性，提示骨骼肌与心脏组织中具有较为相似的调节机制，而骨骼肌是机体运动的主要支撑器官且研究表明运动可以促进心脏中侧支血管新生，同时2020年欧洲心血管疾病杂志指南表明适量的运动有助于心血管疾病患者的愈后。
4.肌连蛋白ctrp15是主要来源于骨骼肌组织的c1q/tnf相关蛋白(ctrp)分泌性家族中的一员，可参与调控脂代谢与免疫功能的。且已有研究提示在缺血再灌注模型中运动时骨骼肌来源的ctrp15因子可明显抑制心肌细胞的凋亡以及炎症的浸润来起到保护心功能的作用；但是心肌细胞的死亡主要是由于缺乏血供所导致，所以关注在心肌梗死过程中侧支血管新生的建立调控至为关键。


技术实现要素：

5.本发明一个目的是提供ctrp15蛋白或其编码基因或以ctrp15蛋白为活性成分的物质的用途。
6.本发明提供的ctrp15蛋白或其编码基因或以ctrp15蛋白为活性成分的物质在如下至少一种中的应用；1）制备治疗心脏损伤的产品；2) 制备减轻心脏损伤的产品；3) 制备提高心脏损伤后心功能修复能力的产品。
7.上述应用中，所述心脏损伤为心肌缺血导致的心脏损伤。
8.上述应用中，所述心肌缺血导致的心脏损伤为心梗导致的心脏损伤。
9.上述应用中，所述心脏损伤为陈旧性心肌梗塞，或慢性冠脉闭塞性病变，或急性心肌梗死，或急性冠脉综合征。
10.上述提高心脏损伤后心功能修复能力体现在促进血管侧支的形成和新生。
11.ctrp15蛋白或基因作为标志物在制备评估或辅助评估待测者心脏损伤程度的产品中的应用也是本发明保护的范围。
12.检测ctrp15蛋白含量或ctrp15蛋白编码基因表达量的物质在制备评估或辅助评估待测者心脏损伤程度的产品中的应用也是本发明保护的范围。
13.使动物运动的物质在制备促进侧支血管新生动物模型中的应用也是本发明保护的范围。
14.本发明还提供了一种促进侧支血管新生动物模型的制备方法，包括如下步骤：动物运动后得到促进侧支血管新生动物模型。
15.上述应用中，所述检测ctrp15蛋白含量的物质包括特异结合ctrp15蛋白的抗体，在本发明的实施例中，该抗体包被在elisa试剂盒（德国antibodies-online gmbh；货号：catalog no. abin6955638）中的孔板上。
16.上述应用中，所述心脏损伤为心肌缺血导致的心脏损伤。
17.上述应用中，所述心肌缺血导致的心脏损伤为心梗导致的心脏损伤。
18.上述应用中，所述心脏损伤为陈旧性心肌梗塞、慢性冠脉闭塞性病变、急性心肌梗死或急性冠脉综合征。
19.本发明通过对运动过程中ctrp15是否对侧支血管新生进行调控及分子机制的研究，发现运动诱导骨骼肌分泌的ctrp15蛋白可以改善心肌梗死后侧支血管新生最终促进心脏功能的修复。
附图说明
20.图1为运动促进心脏缺血缺氧损伤后的功能修复。
21.图2为运动促进心脏中血管侧支的增加。
22.图3为运动过程中骨骼肌显著高分泌ctrp15。
23.图4为心脏缺血过程中ctrp15的表达明显下降。
24.图5为补充蛋白过表达ctrp15可有效减轻心脏损伤。
25.图6为敲除ctrp15抑制血管侧支再生能力最终加重心脏缺血后损伤。
26.图7为心脏损伤患者血浆中ctrp15表达水平较健康人较低。
具体实施方式
27.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
28.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
29.下述实施例中雄性野生型小鼠(c57bl/6)均购自北京华阜康生物科技股份有限公司，下面简称为野生鼠（wt鼠）。
30.实施例1、运动诱导骨骼肌分泌的ctrp15蛋白
一、运动促进心脏缺血缺氧损伤后的功能修复选择wt野生鼠，利用游泳实验以及急性心肌梗死模型，统计心肌梗死模型后小鼠的生存率、心功能改变以及病理水平评估心脏重塑改变，明确运动对心脏的保护过程中对心肌梗死后侧支血管新生程度、心功能修复的影响。
31.（一）运动模型的构建游泳模拟运动：起始游泳10分钟每天并逐渐增加10分钟/天，直到50分钟/天后，每周6天进行运动，运动4周，得到运动模型小鼠。
32.（二）心肌梗死动物模型的构建根据目前报道的通用的结扎冠脉前降支方案mi术（冠脉结扎术）建立小鼠模型，以下手术过程均为无菌环境下操作：(1) 选取8-10周龄、体重20-22g的雄性wt小鼠（未运动）和上述（一）得到的运动模型小鼠（8-10周龄、体重20-22g的雄性，运动后）分别饲养于spf级动物房中，在计划手术的前一天使用脱毛膏进行胸部脱毛、备皮；(2) 术中使用2%的异氟烷进行持续性吸入麻醉，待小鼠稳定后固定体位使用75%酒精进行消毒心前区局部皮肤；(3) 在持续性吸入麻药的条件下，使用手术剪在左胸开一个1.2cm左右的小口；(4) 使用手术镊钝性分离胸大肌和胸小肌，可见明显搏动的肋间隙，用弯血管钳穿破肋间隙，顺势轻柔挤出心脏；(5) 利用7号外科手术针线，方结结扎冠脉左前降支后，可见被结扎后远端的心肌迅速变为白色，剪线后速将心脏恢复原位紧接着将胸腔挤一下排空胸腔中气体；(6) 使用4号外科手术针线对手术开口处皮肤进行间断缝合；(7) 模型评估：冠脉结扎术后半小时内通过遥测心电图仪评价模型建立，术后观察到心电图中st段明显抬高提示模型构建成功，可进入后续实验，得到心肌梗死小鼠模型（未运动组）和心肌梗死小鼠模型（运动组）（以手术当天记作心梗第0天）；(8) 将心肌梗死小鼠模型置于保温垫上待小鼠苏醒后，放回饲养笼中，术后两天内予以镇痛药丁丙诺啡(0.05 mg/kg/12h,i.p.)，并饲养在spf环境中。
33.（三）经胸超声心动图检测为了评估小鼠基础水平（运动后）、mi术（冠脉结扎术）对小鼠心脏功能改变的影响，对上述（二）得到的心肌梗死小鼠模型（未运动组）和心肌梗死小鼠模型（运动组）在术后不同时间进行无创的超声心动图检测。以不进行mi冠脉结扎术小鼠作为对照组，也分为运动对照组（运动方式同上述（一））和未运动对照组。
34.小鼠心功能相关指标包括左心室射血分数(lvef)；左室短轴缩短率(lvfs)；左室收缩末期内径(lvids)；左室舒张末期内径(lvidd)等数据。所有样本结果的测试采用同样的超声参数，对每个样本至少测量3-5个连续性周期，取平均值。
35.小动物超声心动图的操作步骤如下：(1) 提前一天对喂养在spf环境中的小鼠使用脱毛膏脱毛、备皮：脱去小鼠颈、前胸部分毛发；(2) 使用三溴乙醇(0.25g/kg)腹腔注射麻醉小鼠，待小鼠麻醉成功后将小鼠仰卧位固定于检查台上；
(3) 调试使用小动物高分辨超声成像系统(visual sonic 2100)，30mhz的探头进行心功能检测；(4) 将耦合剂涂于小鼠胸部表面，避免其中有气泡存在，待探头与耦合剂接触后轻微调节体位，首先使小鼠心脏长轴与探头平行获取胸骨旁左室长轴切面；(5) 此时将探头顺时针旋转约90
°
，获得m型二尖瓣腱索水平切面，以视野中可看到乳头肌为准留图进行后续的分析采值。
36.结果如图1所示，a为未运动组与运动组小鼠在心梗手术后的生存曲线、b为运动并且构建了心梗模型4周时小鼠的超声心动图，b1为不同处理情况下左室射血分数；统计mi术后不同时间心肌梗死小鼠模型的生存率以及心功能改变，可以看出，运动组小鼠制备的心肌梗死小鼠模型生存率高于未运动组小鼠制备的心肌梗死小鼠模型（图1a）；运动改善了小鼠的心功能（图1b和图1b1），该结果表明适量的运动可以减轻心肌梗死后的心脏损伤。
37.二、运动改善心肌梗死后侧支血管新生程度通过病理学水平血管性血友病因子vwf（抗体货号：ab6994，公司：abcam）阳性的血管管壁评估心脏中侧支血管新生，明确运动对心脏的保护过程中对心肌梗死后侧支血管新生程度的影响。
38.（一）vwf阳性的血管内膜评估心脏中侧支血管新生(1) 将上述一中的心肌梗死小鼠模型（未运动组）和心肌梗死小鼠模型（运动组），在术后的1周时收取小鼠心脏，冲洗心脏及循环中的血液后取出心脏；(2) 剪去心脏表面黏连的结缔组织，置于生理盐水中清洗心脏，使用吸水纸吸去心脏表面以及心腔中水分后置于福尔马林组织固定液中，保持心脏处于舒张形态进行过夜脱水固定；(3) 取出心脏进行石蜡包埋、切片、制片、脱蜡至水；(4) 首先使用1
×
柠檬酸溶液在高压锅中加热90秒对切片进行细胞表面抗原的修复，恢复室温后使用双蒸水ddh2o清洗3次，3分钟每次；(5) 用内源性过氧化物酶阻断剂3%的去离子h2o2水溶液室温孵育20分钟，擦掉阻断剂后用1
×
pbs清洗3次，3分钟每次；(6) 使用进口羊血清室温封闭30分钟，甩干切片上的血清；(7) 用pbs配制内皮细胞特异性标志物vwf的抗体(抗体货号：ab6994，公司：abcam，比例为1:500)，在4℃冰箱中湿盒孵育过夜；取出切片后恢复室温30分钟，1
×
pbs清洗3次，3分钟每次；(8) 室温孵育加辣根过氧化物酶标记的免疫组化二抗30分钟，1
×
pbs清洗3次，3分钟每次；(9) 用dab试剂盒进行显色，按照说明书将a/b/c三种液体按照1:20的比例混溶于ddh2o中（现配现用），在显微镜下显色约2分钟，以观察到组织切片稍微变黄色为准，迅速将切片置于ddh2o清洗3次，3分钟每次；(10) 利用苏木素染液染核3分钟，自来水冲去染色；(11) 利用浓盐酸和乙醇配制盐酸酒精分化液，将切片在分化液中处理2秒，低速流动自来水返蓝5分钟；(12) 取出切片后依次在95%酒精中迅速蘸3次5秒/次，100%无水乙醇中浸泡5分
钟；最终浸于二甲苯中10分钟后使用中性树胶及盖玻片进行封片，置于通风橱中待中性树胶硬化后在200倍镜下进行采图，每张切片随机选取8-10个视野进行数据采集和分析。
39.结果如图2所示，a为未运动组与运动组心梗手术后心脏vwf染色、a1为对vwf阳性细胞的定量统计，运动后制备的心肌梗死小鼠模型组（运动组），vwf阳性的内皮细胞数量多于单纯心肌梗死小鼠模型正常培养（未运动组）；表明，运动后vwf阳性的内皮细胞显著增加，表明运动促进心脏中血管侧支的增加，即促进侧支血管新生。
40.三、运动后骨骼肌高分泌fam132b(ctrp15)选择雄性c57bl/6 wt小鼠，构建运动模型，通过对运动后骨骼肌的转录组测序，发现运动后骨骼肌高分泌fam132b(ctrp15)。
41.（一）运动模型的构建采用与一相同的方法构建运动模型；（二）心肌梗死动物模型的构建采用与一相同的方法构建心肌梗死动物模型；（三）转录组学测序心肌梗死小鼠模型（未运动组）和心肌梗死小鼠模型（运动组），收集小鼠骨骼肌组织提取rna，对rna进行浓度以及纯度检测，之后将rna片段化经过逆转录为单链cdna-双链cdna；之后对cdna进行纯化、扩增构建dna文库。利用illumina测序平台进行测序分析。
42.结果如图3所示，a为heat-map聚类分析展示运动后骨骼肌中高表达的因子（top19），其中根据已知来源发现骨骼肌来源的主要是fam132b（ctrp15），b为运动后骨骼肌中显著升高的基因与已知为分泌型蛋白库相互分析；发现运动后升高的基因中有5个为分泌型的，包括（ctrp15,adipoq,hbegf,angptl4,agt），5个分泌型基因表达量如b1所示，ctrp15表达量最高；综合分析后，选用ctrp15（氨基酸序列为序列1）作为研究点。
43.四、心脏缺血过程中ctrp15的表达明显下降使用elisa检测方法，通过检测一中制备的心肌梗死小鼠模型在术后一周和四周后小鼠血浆ctrp15和心脏组织内ctrp15基因水平，明确心肌缺血工程中ctrp15的动态变化。以不进行的冠脉结扎术的运动模型小鼠为对照组。
44.（一）血浆ctrp15的检测通过商品化的elisa试剂盒（公司：antibodies-online gmbh；货号：abin6974881）进行检测具体步骤如下：（1）准备所有试剂和工作标准品；（2）从板上去除多余的微孔板条框架，将它们放回含干燥剂包塑料袋中；（3）向每个孔中加入100μl标准品或样品，在37℃下孵育2个小时；（4）除去每孔的液体，不要冲洗；（5）向每个孔中加入100μl的1
×
生物素标记的抗体，在37℃下孵育1个小时；（6）吸弃孔内液体，每孔300μl的1
×
洗涤缓冲液，充分洗涤后完全去除液体，在干净的纸上抬干，反复洗涤3次。注意：吸水纸上的污渍板可去除任何残留的缓冲液；（7）每孔加入100μl的avidin-hrp偶联物工作液。在37℃下孵育1个小时；（8）按照第6步吸出并清洗5遍；（9）每孔加入90μl的tmb底物显色液，在37
°
c下避光孵育15-30分钟；
（10）向每个孔中加入50μl的终止溶液，孔内颜色应该由蓝变黄；（11）5分钟内使用酶标仪在450nm确定每孔的吸光度。
45.（二）qpcr检测小鼠心脏组织内ctrp15基因转录水平1. 心脏组织中的rna提取及反转录（1）取心肌梗死小鼠模型在术后三天、一周或四周的新鲜的或者在负80℃冰箱或液氮中冻存的心脏组织团块于1.5ml的无rna酶的离心管中，并加入已灭活rna酶的磁珠2粒后加入1ml的trizol试剂，使用组织匀浆机进行震荡消化2-3遍，保持匀浆时温度在10℃以下；（2）取下匀浆后的组织悬液（以观察不到组织团块为准），向每一个管中加入200μl的三氯甲烷，盖紧管盖后强烈上下颠倒震荡约10秒，液体呈现乳糜状，静置于冰上待分层后重复震荡两次；（3）待分层后在4℃环境下，12000rpm离心20分钟，此时可发现分为三层，吸取上层清液移至分别对应的新的1.5ml的离心管中；（4）向每管中加入1.5倍体积800μl的异丙醇，轻混匀后置于负20℃冰箱中过夜进行rna的萃取；（5）取出过夜的混合液，在4℃环境下，12000rpm离心15分钟；（6）此时用无水酒精和无rna酶的depc水配制成75%的酒精，待离心弃上清后，向每管中加入配制的酒精1ml，清洗rna沉淀，此步骤重复三次；（7）最后一遍弃上清并再次离心后，使用200μl移液枪吸去残余酒精，在超净台中风干后加入20-30μl的depc水溶解rna得到rna溶液进行质量的检测以及测浓度后反转录为cdna。
46.2. 实时荧光定量pcr（realtime-pcr）反应（1）取适量的8联排200μl的离心管，按照每个样本2个复孔计算，放置于4℃的恒温金属浴上，每孔中加入的试剂如下：2
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sybr green pcr master mix
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10 μlrnase free h2o
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7 μl上游引物
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1 μl下游引物
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1 μlcdna
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1 μl（2）使用iq5实时定量pcr仪进行实时荧光定量pcr反应，反应步骤为：
①
95℃ 5分钟，
②
95℃ 45秒，
③
60℃ 1分钟（45个循环）；溶解曲线：55℃
→
95℃（每个循环增加0.5℃/cycle，每个循环30秒）；（3）所用引物序列为：上游引物ctrp15-f:aggcaggacactacacttctg；下游引物ctrp15-r:tcaccactctgcttggtaagg；结果如图4所示，左图为心梗后不同时间点血浆ctrp15水平，右图为心梗术后不同时间点心脏组织ctrp15基因水平，可以看出，无论是在小鼠血浆ctrp15和心脏组织内ctrp15基因水平中，心梗后1周和4周后的心脏缺血过程中ctrp15的蛋白和基因表达明显下降。
47.实施例2、ctrp15蛋白在治疗或减轻心脏损伤中的应用以补充蛋白过表达ctrp15检测是否有效减轻心脏损伤：在模型构建成功的前提下，利用wt野生鼠建立心肌梗死模型，补充蛋白过表达ctrp15，通过心脏超声以及病理检测来明确基于ctrp15的运动处方通过促进侧支血管新生对心肌梗死后心功能修复的治疗效果。
48.心脏损伤小鼠（mi）体内予以蛋白ctrp15处理：(1) 与实施例1的心脏损伤动物模型构建方式相同，得到心肌梗死小鼠模型（未运动组）；(2) 蛋白ctrp15的配制：将蛋白ctrp15（公司：aviscera bioscience；货号：00393-06-100）从4℃冰箱中取出后，使用12000rpm低温高速离心1分钟，使粉末聚集于管底，使用无菌的pbs缓冲液（ph7.2-7.4；0.01m；公司：solarbio；货号：p1020）进行溶解，得到浓度为1mg/ml蛋白ctrp15溶液,所有操作均于冰上处理；(3) 蛋白ctrp15的注射：蛋白ctrp15注射组：将配制好的蛋白ctrp15溶液吸入1ml的胰岛素注射器中，并将刻度进行标记。使用气体麻醉系统，利用异氟烷麻醉上述（1）构建心肌梗死小鼠模型（未运动组）在mi术后12小时的小鼠，根据所标记的分组通过小鼠内眦静脉分别将蛋白ctrp15溶液按照200ng蛋白/g小鼠体重注射入对应的小鼠体内，每只小鼠注射100μl总体积的量。
49.pbs注射组（对照组）：与蛋白ctrp15注射组不同的仅为静脉注射的为对照试剂pbs；分别再于术后1天、3天时各注射一次。注射过程中为避免小鼠产生不良反应以及保证不引起小鼠眼睛受损，一定保证注射器液体中不存在气体、注射总量不高于100μl以及速度不宜过快。
50.(4) 注射后处理：将小鼠放置于37℃保暖垫待小鼠苏醒后，继续观察半小时，无出血等异常后放入饲养笼中。
51.统计存活率，并称量小鼠的体重（bw）以及心脏重量（hw）。
52.结果如图5所示，a为蛋白ctrp15注射组（图中记作ctrp15重组蛋白）与对照组（pbs）心梗后28天生存曲线、b为蛋白ctrp15组（图中记作ctrp15重组蛋白）与对照组（pbs）心梗后四周心脏大体图、b1为蛋白ctrp15组（图中记作ctrp15重组蛋白）与对照组（pbs）心脏/体重比；将上述各组小鼠正常饲喂4周（以mi术当天记作第0天），结果发现补充蛋白ctrp15后明显降低心梗后小鼠死亡率（图5a）；蛋白ctrp15组与对照组（pbs）相比，心梗后四周小鼠心脏体积没有明显变化（图5b）；称量小鼠的体重（bw）以及心脏重量（hw），算得小鼠的心脏体重比值（图5b1），可以看出，补充蛋白ctrp15后反映心脏失代偿性增生的心脏体重比值明显降低，表明ctrp15蛋白可以减轻心脏损伤。
53.动脉环实验，具体如下：(1)选用上述蛋白ctrp15注射组（图中记作ctrp15重组蛋白）和pbs注射组（图中记作对照组）小鼠，脱颈椎处死，75%酒精擦拭皮肤消毒；(2)分离胸主动脉血管，剔除主动脉周围的脂肪及结缔组织，剪刀切成长约0.5 mm长的动脉环；
(3)在预冷的96孔细胞培养板中，每孔加入一个剪好的血管环，小心加入预先融化的matrigel胶70μl将血管环覆盖37℃孵育0.5h，使胶凝固；(4)加入含有10�s培养液80μl，覆盖胶原表面。
54.(5)第三天倒置显微镜下观察动脉环新生微血管。
55.动脉环实验结果如图5c所示，可以看出，体内打入了ctrp15蛋白的小鼠与pbs注射组小鼠相比，补充了ctrp15可促进血管侧支的形成和新生。
56.实施例3、敲除ctrp15明显加重心肌梗死后心脏损伤为了明确ctrp15对心功能的保护作用，构建了基因ctrp15 ko鼠；对wt以及ctrp15 ko鼠同时结扎冠脉前降支构建心肌梗死模型，通过观察血管侧支新生功能以及病理改变，明确敲除ctrp15对心肌梗死后心脏损伤的影响。
57.（一）ctrp15基因敲除鼠的构建ctrp15基因敲除鼠（命名为ctrp15-ko鼠）与野生型c57bl/6小鼠相比，仅基因组中的ctrp15基因（序列2）第5122位的碱基c缺失，其他基因不变。
58.上述ctrp15基因敲除鼠可以采用定点突变或者其他现有技术制备，本发明以如下为例：ctrp15全身敲除鼠构建于cyagen biosciences.鉴定的基因序列如下：mfam132b-1-f: 5
’‑
cgttgcacgagcttgggatct-3；mfam132b-1-r: 5
’‑
ctcggtgagtgctgtggaaaagac-3’。
59.ctrp15基因敲除鼠通过在c57bl/6小鼠受精卵中显微注射 talen创建 mfam132b 敲除，mfam132b 基因位于小鼠 1 号染色体上，外显子 5 被选为 talen 靶位点；具体方法如下：体外转录获得talen mrna，然后将其注射到受精卵中用于 ko 小鼠的构建。通过pcr（引物为mfam132b-1-f和mfam132b-1-r）和dna测序分析进行基因分型，得到322bp的为ctrp15基因敲除鼠。
60.ctrp15基因敲除鼠（命名为ctrp15-ko鼠）与野生型小鼠相比，仅基因组中的ctrp15基因缺失正常碱基序列： 5
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tctgtgtgctccgtagcccgaagttgagggagccttccaccggggcccaggcttgaatctgaccagcggcc-3’敲除鼠 id#30 ：5
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tctgtgtgctccgtagcccgaagttgagggagc-ttccaccggggcccaggcttgaatctgaccagcggcc-3
’ꢀ
(-1)。
61.（二）心脏损伤动物模型的构建用上述ctrp15-ko鼠和c57bl/6野生型鼠进行心脏损伤动物模型构建，方法与实施例1的心脏损伤动物模型构建方式相同。
62.（三）小鼠动脉环实验(1)选用wt构建的心脏损伤动物模型和ctrp15-ko鼠构建的心脏损伤动物模型，脱颈椎处死，75%酒精擦拭皮肤消毒；(2)分离胸主动脉血管，剔除主动脉周围的脂肪及结缔组织，剪刀切成长约0.5 mm长的动脉环；
(3)在预冷的96孔细胞培养板中，每孔加入一个剪好的血管环，小心加入预先融化的matrigel胶70μl将血管环覆盖37℃孵育0.5h，使胶凝固；(4)加入含有10�s培养液80μl，覆盖胶原表面。
63.(5)第三天倒置显微镜下观察动脉环新生微血管。
64.（四）小麦胚芽凝集素荧光（wga）染色(1)首先对心脏组织进行石蜡包埋以及固定切片，利用二甲苯和梯度浓度的酒精进行脱蜡至水后使用1
×
柠檬酸溶液在高压锅中沸水加热90秒对切片进行细胞表面抗原修复，取出后将玻片继续在柠檬酸溶液的浸泡下进行室温冷却，之后使用1
×
pbs清洗3次；(2)进一步使用进口羊血清室温封闭30分钟，擦去血清后使用1
×
的wga进行滴染，避光环境下在37℃孵育1小时，使用1
×
pbs清洗残留的染料3次、3分钟/次，使用dapi封片液以及盖玻片进行封片后置于4℃避光保存切片；(3)在避光的环境下利用nikon荧光显微镜观察，获取图后通过特定的配套软件进行图片数据处理，计算肌细胞横截面积。
65.结果如图6所示，a为正常野生鼠与ctrp15敲除鼠动脉环实验、b为正常野生鼠与ctrp15敲除鼠心梗4周后心脏wga染色、b1为wga染色的定量统计；与正常野生鼠相比，ctrp15敲除鼠明显减弱血管侧支新生功能；通过wga染色检测心肌细胞代偿性改变的情况，发现ctrp15敲除组中均较其他组有更大的损伤瘢痕（肌细胞横截面积增大）且加重心肌梗死后心脏损伤。
66.实施例4、心脏损伤患者和健康人血浆中ctrp15表达水平差异一、心脏损伤患者和健康人血浆中ctrp15表达水平差异根据性别年龄匹配的原则，选择14名健康人和22名心脏损伤患者（待检者知情，且心脏损伤患者已经鉴定），通过elisa检测待检者血浆ctrp15水平。
67.利用elisa试剂盒（公司：德国antibodies-online gmbh；货号：catalog no. abin6955638）检测人血浆中ctrp15的含量，该试剂盒中的孔板包被特异结合ctrp15蛋白的抗体。
68.（1）按照说明准备试剂、样品和标准品；（2）每孔加入100μl标准品或样品。在37
°
c下孵育1小时；（3）向每个孔中加入100μl的检测试剂a，并在37
°
c下孵育60分钟；（4）抽吸并清洗板3次；（5）向每个孔中加入100μl的检测试剂b，并在37
°
c下孵育30分钟；（6）抽吸并清洗板5次；（7）向每个孔中加入90μl的底物溶液，并在37
°
c下孵育10-20分钟；（8）加入50μl停止溶液。立即在450nm处读取并计算。
69.结果如图7所示，与健康人相比，心脏损伤患者血浆中ctrp15表达水平较健康人较低（p《0.01）。
70.血浆中ctrp15作为标志物可以制备检测或诊断或辅助检测或辅助诊断待测者是否心脏损伤或评估或辅助评估待测者心脏损伤程度产品中的应用；检测血浆中ctrp15蛋白含量的物质在制备检测或诊断或辅助检测或辅助诊断待测者是否心脏损伤或评估或辅助评估待测者心脏损伤程度产品中的应用；
其中，血浆中ctrp15蛋白含量低的待检者的心脏损伤程度大于或候选大于血浆中ctrp15蛋白含量高的待检者。
71.上述检测血浆中ctrp15蛋白含量的物质包括特异结合ctrp15蛋白的抗体。